CN106566792A - 一种直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法及所用菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用芽孢杆菌Bacillus sp. C9直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法，属于微生物制剂领域。本发明所涉及菌种为Bacillus sp. C9，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，专利菌种保藏号为CGMCC 13057。本发明可以直接转化未经预处理的稻糠生产微生物絮凝剂产品，能有效地降低微生物絮凝剂的生产成本，并且能实现稻糠的资源化利用，具有很好的应用前景。

Description

一种直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法及所用菌株
技术领域
本发明涉及一种直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法及所用菌株，具体涉及利用菌株Bacillus sp. C9直接转化稻糠发酵生产微生物絮凝剂的方法。
背景技术
絮凝剂是一类可以聚集沉降溶液中固体悬浮颗粒的物质，被广泛应用于污水处理等领域中。主要分为三类：无机絮凝剂、有机高分子絮凝剂和微生物絮凝剂。微生物絮凝剂是新型的第三代絮凝剂，是由微生物代谢产生的大分子物质，如多糖、蛋白质等物质。相对于无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂，微生物絮凝剂具有无毒无害，安全性高，生物易降解和无二次污染等优点，因此微生物絮凝剂在污水处理领域，尤其是在食品和发酵工业的后处理等工艺中具有明显的安全优势，其研究也日益受到重视。然而微生物絮凝剂的生产成本相对较高，限制了其大规模工业化生产应用。
我国每年在农业生产过程中会产生大约6-7亿吨的农业废弃物，如玉米秸秆，花生壳，土豆渣和稻糠等，这些农业废弃物被大量堆放或者燃烧处理，不仅造成生物质资源的浪费，而且污染环境。研究表明这些农业废弃物残渣中含有丰富的纤维素和半纤维素类物质，可以被微生物分解成糖类，从而转化为其他高附加值产品。因此如何有效地将这些农业废弃物变废为宝成为研究热点。
为了降低微生物絮凝剂的生产成本，目前的主要研究方向为筛选高产菌株，优化菌株发酵条件，利用诱变技术提高现有菌株的产量，扩大微生物絮凝剂的应用范围等几个方面，探索寻找廉价培养基发酵生产微生物絮凝剂也是有效降低微生物絮凝剂生产成本的重要手段。各种活性污泥被用作发酵培养基生产微生物絮凝剂(Bioresource Technology,2012, 121: 425-31; Bioresource Technology, 2013, 143: 289-97)。高浓度有机废水被用作培养基生产微生物絮凝剂，如土豆淀粉厂废水被用作菌株Rhizopussp.的发酵培养基(Bioresource Technology, 2014, 162:18414,)，棕榈油加工废水被用作Aspergillusniger的发酵培养基(Bioresource Technology,2014, 171: 6614,)，啤酒厂废水被用作复合菌群的发酵培养基，从而降低微生物絮凝剂的生产成本(Journal ofEnvironmental Science, 2007, 19(6): 667)。此外农业废弃物中含有大量的木质纤维素，有研究人员利用农业废弃物的水解物作为发酵培养基的碳源廉价生产微生物絮凝剂。Guo等人利用玉米秸秆水解物作为菌株Rhodococcuserythropolis的发酵碳源(Bioresource Technology, 2015,177:393-397)；Wang等人利用水稻壳水解物作为菌株Ochrobactiumciceri W2的发酵碳源(BioresourceTechnology, 2013, 145: 259-263)；Shu等人也利用水稻壳水解物作为Schizophyllum commune发酵培养基的碳源 (Journalof the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2011, 42(3): 387-393)；Liu等人也利用花生壳水解物作为Pseudomonas veronii L918的培养基生产微生物絮凝剂(BioresourceTechnology, 2016, 218: 318-325)。但是在高温强酸下水解秸秆或水稻壳往往会产生大量的有毒副产物，不仅在后续的发酵过程中抑制菌体生长，同时也会影响微生物絮凝剂的安全性。为了避免木质纤维素在热酸水解过程中产生的有毒副产物，Liu等人利用能够产生木质纤维素降解酶的微生物絮凝剂产生菌株CellulosimicrobiumcellulansL804直接转化玉米秸秆生产微生物絮凝剂（Biotechnology forBiofuels, 2015, 8:170），从而避免了高温强酸条件下产生的有毒副产物，降低了微生物絮凝剂成本，安全性更高。然而菌株Cellulosimicrobiumcellulans L804产生微生物絮凝剂的最佳条件为弱碱性(pH 8,2)，而其酶活的最佳条件为弱酸性(pH5-6)，存在最佳条件分歧，在一定程度上限制了转化生产效率。稻谷是我国第一大粮食作物，年产量约为1.85亿吨左右，在加工过程中会产生大量的副产物稻糠，每年约产生1000万吨以上。这些稻糠废弃物目前大多被用作畜禽饲料或者直接丢弃，造成资源浪费和环境污染。稻糠中含有丰富的蛋白质和木质纤维素类物质，具有开发其他高附加值产品的潜力。本发明利用菌种Bacillus sp.C9直接转化稻糠发酵生产微生物絮凝剂，该菌种能产生较高活性的碱性纤维素酶和碱性木聚糖酶，并在碱性条件下产生微生物絮凝剂。此外在碱性条件下更有利于稻糠的膨胀，促进稻糠中的纤维素和木聚糖等组分的酶解，直接发酵转化稻糠生产微生物絮凝剂，变废为宝，既有效地降低了微生物絮凝剂的生产成本，又实现了稻糠的资源化利用。专利检索未发现直接利用稻糠发酵生产微生物絮凝的专利。
发明内容
本发明提供了一种利用菌株Bacillus sp. C9直接转化稻糠生产高活性微生物絮凝剂的方法。该菌株能产生较高活性的碱性纤维素酶和碱性木聚糖酶，可以直接转化稻糠发酵生产微生物絮凝剂，能够有效地降低微生物絮凝剂的生产成本。
本发明的具体发明内容如下：
一种用于直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的菌株，菌株为芽孢杆菌Bacillus sp.C9保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，专利菌种保藏号为CGMCC13057。
一种利用菌株Bacillus sp. C9直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法，该方法的工艺步骤如下：
步骤1、将菌种Bacillus sp. C9接种于种子液培养基中，37℃，180 rpm摇床培养过夜制备种子液；
步骤2、将种子液按1%比例转接于发酵培养基中，37℃，180 rpm，摇床发酵培养24 h；
步骤3、将发酵液在10000 rpm条件下离心10 min，去除沉淀后，收集上清液；
步骤4、向步骤3中获得的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，10000 rpm离心10min收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥，获得微生物絮凝剂产品。
进一步的，步骤1中所述的种子液培养基为葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾1.3 g/L，碳酸钠10g/L；
进一步的，步骤2中所述发酵培养基为稻糠20g/L，酵母粉3 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.3g/L，碳酸钠20g/L。
本发明具有以下优点：
a、本发明所用的菌株Bacillus sp.C9生长速度快，发酵周期短，微生物絮凝剂产量高；
b、本发明利用芽孢杆菌可以直接转化稻糠生产微生物絮凝剂，避免了高温强酸水解农业废弃物过程中产生的有毒副产物；生产工艺相对简单，有利于进一步降低微生物絮凝剂的生产成本。
c、本发明所用菌株Bacillus sp.C9属于耐碱菌，在碱性条件下（pH 10-10.5）生长良好且具有很高的碱性纤维素酶和碱性木聚糖酶，能酶解稻糠中的木质纤维素类物质。碱性条件下有利于稻糠的膨胀，提高稻糠中木质纤维素酶解转化生产微生物絮凝剂的效率。
具体实施方式
一种直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法，具体实施方式如下：
步骤1、将菌株Bacillus sp. C9接种于种子液培养基中，37℃，180 rpm摇床过夜培养制备种子液；
步骤2、将种子液按1%比例转接至以稻糠为唯一碳源的发酵培养基中，37℃，180 rpm摇床培养24 h；
步骤3、将发酵培养基在4℃，10000 rpm离心10 min，去除沉淀，收集上清液获得液体生物絮凝剂；
步骤4、向步骤3中获得的液体生物絮凝剂中加入2倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀物，用70%乙醇洗涤沉淀并冷冻干燥得到微生物絮凝剂产品。
所述的步骤1中，所用菌株为Bacillus sp.C9，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC13057，该菌株能直接转化稻糠生产微生物絮凝剂；
所述的步骤1中，种子液培养基成分如下：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.3 g/L，Na2CO3 10g/L；
所述的步骤2中，发酵培养基的成分如下：稻糠20g/L，酵母粉3 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.3g/L，碳酸钠20g/L。
具体实施例1：微生物絮凝剂制备方法，具体步骤如下：
1、种子液制备：将菌株Bacillus sp. C9接种至种子液培养基中，种子液培养基组分如下：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.3 g/L，碳酸钠10g/L。然后37℃，180 rpm摇床过夜培养；
2、发酵制备微生物絮凝剂：将步骤1获得的种子液按1%比例接种至发酵培养基中，发酵培养基组分如下：稻糠20g/L，酵母粉为氮源3 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.3g/L，碳酸钠20g/L；然后37℃，180 rpm摇床发酵培养24 h；
3、微生物絮凝剂提取：将获得的发酵液在10000 rpm条件下离心10 min，收集上清液；向上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，10000 rpm离心10 min收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀后，冷冻干燥获得微生物絮凝剂产品。
4、微生物絮凝剂的应用：取60 mL燃煤电厂的洗灰废水，向电厂洗灰废水中加入100 uL发酵液；快速搅拌2 min，然后缓慢搅拌1 min，静置沉降1 min，取上清液用，并用分光光度计测定OD550值，以加入100 μL蒸馏水作为对照，通过计算絮凝率表示微生物絮凝剂对电厂洗灰废水的絮凝活性。絮凝率=(A-B)/A×100%，A代表加蒸馏水时上清液的OD550值，B代表加发酵液时上清液的OD550值。结果表明所获得的微生物絮凝剂对电厂洗灰废水的絮凝效果明显，絮凝率达到90%以上。

Claims (4)

1.一种用于直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的菌株，其特征在于，菌株为芽孢杆菌Bacillus sp.C9保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，专利菌种保藏号为CGMCC13057。
2.根据权利要求1所述的一种利用菌株Bacillus sp. C9直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于，工艺步骤如下：
步骤1、将菌种Bacillus sp. C9接种于种子液培养基中，180 rpm，37℃摇床过夜培养获得种子液；
步骤2、将种子液按1%的比例转接到以稻糠作为唯一碳源的发酵培养基中，180 rpm，37℃恒温摇床培养24 h；
步骤3、将发酵液在10000 rpm，4℃的条件下离心10 min，收集上清液；
步骤4、向步骤3中获得的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，离心收集沉淀物，用70%乙醇洗涤1次，冷冻干燥得到固体微生物絮凝剂。
3.根据权利要求2所述的一种利用菌株Bacillus sp. C9直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤1中所述种子液培养基为：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.3 g/L，碳酸钠10 g/L，种子液的培养条件为180 rpm，37℃过夜培养。
4.根据权利要求2所述的一种利用菌株Bacillus sp. C9直接转化稻糠生产微生物絮凝剂的方法，其特征在于，步骤2所述的发酵培养基为：稻糠20 g/L、酵母粉3 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L、磷酸氢二钾1.3 g/L，碳酸钠20 g/L，发酵条件为180 rpm，37℃。。
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