CN106561577A - 稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的制备方法及其在防治白纹伊蚊中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的制备方法及其在防治白纹伊蚊中的应用，制备方法包括以下步骤：筛选四环素处理的广州野外白纹伊蚊得到除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊、制备稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊；上述稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊在防治白纹伊蚊中的应用具有低成本、可持续以及绿色环保等特点，是目前最具潜力的蚊媒病生物防治手段之一，解决了化学杀虫剂的使用很容易使昆虫建立抗药性的问题，也解决了对环境和公众健康产生危害的问题。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的制备方法及其在防治白纹伊蚊中的应用。
背景技术：
白纹伊蚊(Aedes albopictus)也被称为亚洲虎蚊，是一种攻击性很强的蚊子，同时也是一种重要的病毒传播媒介，可以传播多种病原体，包括登革热、寨卡等病毒。目前登革热和寨卡已成为全球范围内两个重要的虫媒传染病，严重性也在逐年增加。每年有多于5000万的人死于蚊媒病，目前还没有疫苗或特定治疗药物用于控制登革热和寨卡。传统的控制虫媒病的措施是使用化学杀虫剂减少传播载体蚊子的种群，但是对于控制虫媒病没有起到很好的效果。化学杀虫剂使蚊虫容易产生耐药性，对环境和公众健康带来很大的问题。
沃尔巴克氏体(Wolbachia)是无脊椎动物胞内专性寄生、可经卵传递的胞内革兰阴性共生菌，具有专性细胞内寄生和母系遗传等特点，已经报道发现在自然界与很多昆虫和一些节肢动物建立了共生关系。与沃尔巴克氏体存在共生关系的很多宿主具有孤雌生殖、雌性化和胞质不相容(cytoplasmic incompatibility，CI)等特点。其中应用最广泛的是胞质不相容。胞质不相容是感染沃尔巴克氏体的雄虫与不感染沃尔巴克氏体的雌虫交配后，后代产生的卵不孵化，而感染沃尔巴克氏体的雌虫与不感染的雄虫交配后，后代都携带沃尔巴克氏体的现象。沃尔巴克氏体(Wolbachia)可以导致宿主产生胞质不相容现象，并能诱导蚊媒产生对多种人类病原体的抗性，因此基于沃尔巴克氏体的蚊媒种群控制可以阻断蚊媒病传播。
发明内容：
本发明的目的是提供一种稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的制备方法及其在防治白纹伊蚊中的应用，具有低成本、可持续以及绿色环保等特点，是目前最具潜力的蚊媒病生物防治手段之一，解决了化学杀虫剂的使用很容易使昆虫建立抗药性的问题，也解决了对环境和公众健康产生危害的问题。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)筛选四环素处理的广州本地野外白纹伊蚊得到除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊：将浓度为10mg/ml盐酸四环素溶液与质量分数为10％的蔗糖溶液按体积比1:10混合，喂食广州本地野外白纹伊蚊成蚊，7天后提供血餐，血餐三天后放产卵杯供其产卵，处理两代100％去除野外白蚊伊蚊体内的沃尔巴克氏体，得到除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊，简称白纹伊蚊GT；
(2)制备稳定携带致倦库蚊(简称QUI)沃尔巴克氏体的白纹伊蚊：包括两个步骤：a、用胚胎注射法提取沃尔巴克氏体转染蚊子胚胎得到转染成功的携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊；b、步骤a得到的转染成功的携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊(简称GQ)的筛选、鉴定和扩增；
步骤a所述用胚胎注射法提取沃尔巴克氏体转染蚊子胚胎具体包括三个步骤：胚胎注射针头的制备、QUI和GT胚胎的收集和准备、显微胚胎注射；
步骤b所述转染成功的携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的筛选、鉴定和扩增，具体包括三个步骤：孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得GQ雌蚊(原代,G0)、获取GQ雌蚊与GT公蚊交配后的子代(第一代G1)、在子代(第一代,G1)中筛选并扩增转染成功的GQ蚊株。
本发明的广州本地野外白纹伊蚊来自广州，简称GUA；除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊简称白纹伊蚊GT；致倦库蚊简称QUI；携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊简称GQ。
本发明还保护所述稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊在防治白纹伊蚊中的应用，利用GQ与野外白纹伊蚊种群是双向胞质不相容，首先进行种群压制，通过释放能与野外白纹伊蚊引起胞质不相容的GQ雄蚊，使得野外白纹伊蚊没有下一代，将野外白纹伊蚊蚊群数量压制到低于人们能觉察到的临界水平；其次，进行种群替换，抗疾病传播的GQ雌蚊被输入和扩散到野外白纹伊蚊蚊群中，这样野外白纹伊蚊的蚊群将不再能传病给人；最后，继续以种群压制的方法通过释放GQ雄蚊来维持低水平的抗病蚊群数量，最大程度降低蚊群对人群的骚扰。
本发明具有如下有益效果：
本发明与传统的化学杀虫剂比较有其独特的优势，具有可持续、低成本以及绿色环保等特点，是目前最具潜力的蚊媒病生物防治手段之一，解决了化学杀虫剂的使用容易使昆虫建立抗药性的问题，也解决了对环境和公众健康产生危害的问题。
首先，具有持效性，一旦用抗抗疾病传播的白纹伊蚊替换传病媒介野外白纹伊蚊成功，可拥有长久的疾病控制效果，不需象化学杀虫剂要不断重复使用。
其次，低成本，解决了化学杀虫剂的使用容易使昆虫建立抗药性的问题，一个新型杀虫剂的开发需要数十年的时间并花费巨额的研究经费，因此本发明成本要远低于使用化学杀虫剂的成本。
另外，本技术利用自然界存在的天然共生菌,不经任何基因改造，不会象化学杀虫剂那样对环境造成任何污染。
最后，种群替换不会对生物链造成任何破坏，但去除了昆虫对人类有害的特性，真正实现绿色农药的目的。
附图说明：
图1是利用PCR检测产卵后的G1代雌蚊是否携带wpip型沃尔巴克氏体。其中，M为Marker，1-6为待筛选的G1代阳性雌蚊；
图2是利用PCR检测产卵后的G2代雌蚊是否携带wpip型沃尔巴克氏体。其中，M为Marker，1-16为待筛选的G2代阳性雌蚊；
图3是持续释放区白纹伊蚊幼虫数量被持续压制，最高压制效果达100％。其中纵坐标为每周每个阳性诱卵器的平均破壳虫卵数，释放区为:沙仔岛，对照区:小虎岛。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本实施例的野外白纹伊蚊来自广州，即为广州本地野外白纹伊蚊，简称GUA；除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊简称白纹伊蚊GT；致倦库蚊简称QUI；携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊简称GQ。
实施例1：
1、筛选四环素处理的广州本地野外白纹伊蚊(GUA)得到除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊：称1g盐酸四环素溶于100mL的水里得到浓度为10mg/ml盐酸四环素溶液，将得到的浓度为10mg/ml盐酸四环素溶液与质量分数为10％的蔗糖溶液按体积比1:10混合，喂食广州本地野外白纹伊蚊(GUA)成蚊，7天后提供血餐，血餐三天后放产卵杯供其产卵，处理两代100％去除野外白蚊伊蚊体内的沃尔巴克氏体，得到除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊，简称白纹伊蚊GT；
2、制备稳定携带致倦库蚊(简称QUI)沃尔巴克氏体的白纹伊蚊：
a、用胚胎注射法提取沃尔巴克氏体转染蚊子胚胎得到转染成功的携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊，具体包括三个步骤：胚胎注射针头的制备、QUI和GT胚胎的收集和准备、显微胚胎注射。
所述胚胎注射针头的制备：采用毛细管(Quartz with filament，O.D.1.0mm，I.D.:0.7mm)和拉针器(P2000Micropipette puller，Sutter Instrument Co.)制备胚胎注射针头。设定对应的拉针仪参数(Heat-280，Fil-3，Vel-30，Del-240，Pull-150)，将毛细管拉制成开口小于5μm的注射针，用磨针器(micro-pipette beveller，Sutter InstrumentCo.)磨开针头。
QUI和GT胚胎的收集和准备：把6-10只已吸饱血的QUI和GT雌蚊，分别放到装有湿润棉花和滤纸的离心管中，把离心管放到黑暗的环境下，让其产卵45min-60min。产完卵后将蚊子放回笼子里，把带有QUI和GT胚胎的滤纸放在湿润的培养皿中。在解剖镜下用毛笔将注射蚊卵胚胎排序，所有蚊卵胚胎的尾部朝向要一致，将带有排列好蚊卵的厚滤纸反转贴在有双面胶的玻片上，并轻轻按压，使蚊卵粘在双面胶上。蚊卵在室温下干燥1min左右(具体干燥时间视蚊卵情况而定)，用水饱和油覆盖蚊卵表面，防止进一步干燥。
显微胚胎注射：把带有QUI和GT蚊卵的玻片放在显微镜下，调节显微镜使其处于视野中上部。将制备好的注射针安装到持针器上，通过调节显微操纵杆，使注射针的尖部和蚊卵尾部尖头处于同一水平面。通过调整注射压力和时间控制吸取量和注射量。吸取QUI蚊卵的尾部尖头胞浆，然后注射进入GT蚊卵的尾部尖头。依次将所排列的蚊卵分别进行吸取和注射。注射完毕，将玻片置于27℃、80％的相对湿度下1h，然后用毛笔轻轻挑取注射后的GT蚊卵，将这些蚊卵放在有湿润棉花和滤纸的杯子中，放在温度27℃、相对湿度80％的环境下培养。
b、步骤a得到的转染成功的携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊(简称GQ)的筛选、鉴定和扩增，具体包括三个步骤：孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得GQ雌蚊(原代,G0)、获取GQ雌蚊与GT公蚊交配后的子代(第一代G1)、在子代(第一代,G1)中筛选并扩增转染成功的GQ蚊株。
1)培育获得GQ雌蚊，(原代,G0)：注射后的GT蚊卵成熟7天后，取出盛有蚊卵的滤纸，放在一个装有纯水的杯子里，加入孵化液，定时观察孵化杯，发现有幼虫孵化出，立即将幼虫挑出放入加有少量幼虫食物的清水中，7天后成蛹，3天后羽化成蚊。雌蚊与GT雄蚊进行交配，吸血产卵，得到G1代的卵。产卵后的G0代雌蚊进行PCR检测，是否携带致倦库蚊沃尔巴克氏体(wpip型沃尔巴克氏体)。
2)获取G1代的GQ：挑选阳性携带wpip型沃尔巴克氏体GQ雌蚊产的卵进行孵化，孵化出的幼虫加入幼虫食物进行培养，7天后成蛹，3天后羽化成蚊。雄蚊直接进行PCR检测，雌蚊与GT雄蚊进行交配，吸血产卵，得到G2代的卵。产卵后的G1代雌蚊进行PCR检测，是否携带致倦库蚊沃尔巴克氏体(wpip型沃尔巴克氏体)，结果如图1所示。
3)筛选并扩增转染成功的GQ蚊株：挑选G1代阳性携带wpip型沃尔巴克氏体GQ雌蚊产的卵进行孵化，孵化出的幼虫加入幼虫食物进行培养，7天后成蛹，3天后羽化成蚊。雌蚊与GT雄蚊进行交配，吸血产卵，得到G3代的卵。产卵后的G2代雌蚊进行PCR检测，是否携带wpip型沃尔巴克氏体。如果G2代雌蚊都携带wpip型沃尔巴克氏体，那么GQ蚊株就筛选成功。结果如图2所示证明筛选成功。
4)胞质不相容(cytoplasmic incompatibility，CI)实验
筛选成功的GQ要进行CI验证，即GQ雄蚊与野外白纹伊蚊GUA雌蚊交配，吸血产卵，卵的孵化率，GQ与野外白纹伊蚊GUA的CI结果参见表1。实验结果证明孵化率为0，有完全的CI能力。可以用于控制野外的白纹伊蚊。
表1
实施例2：实施例1得到的稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊(简称GQ)在防治白纹伊蚊中的应用
在2014年完成沙仔岛(释放控制区)和小虎岛(对照区)白纹伊蚊群数量季节波动和种群结构的本底调查基础上，2015年3月起在广州沙仔岛开始释放能与野外白纹伊蚊引起胞质不相容的GQ雄蚊(不育雄蚊)的现场田间测试。有效的压制效果取决于释放的不育雄蚊的交配优势,而该优势由GQ雄蚊(不育雄蚊)与野生雄蚊的比率决定。从3到5月底,释放地蚊卵的不育率很快达70％，种群压制效果明显，但6月起进入雨季,促使大量库存的白纹伊蚊卵孵化，将野生白纹伊蚊数量推入高峰季节，对现场试验形成挑战。故6月16起改进控制策略，从全岛释放改为地毯式释放，对高密度区进行重点持续释放，并及时提高生产产能,将GQ雄蚊周产量从10万提高到100万,最终达到白纹伊蚊的有效控制，数据显示在持续释放区对白纹伊蚊幼虫数量压制效果达100％，成蚊数量压制效果最高达97％(参见图3)。以上压制效果是基于释放区和对照区白纹伊蚊的数量比较，由于对照区事实上自4月13日起，每个星期进行2次化学杀虫剂的消杀灭蚊，而释放区却没有开展该消杀活动,故以上压制效果有可能被低估。
Claims (2)
1.一种稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)筛选四环素处理的广州本地野外白纹伊蚊得到除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊：将浓度为10mg/ml盐酸四环素溶液与质量分数为10％的蔗糖溶液按体积比1:10混合，喂食广州本地野外白纹伊蚊成蚊，7天后提供血餐，血餐三天后放产卵杯供其产卵，处理两代100％去除野外白蚊伊蚊体内的沃尔巴克氏体，得到除去沃尔巴克氏体的白纹伊蚊，简称白纹伊蚊GT；
(2)制备稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊：包括两个步骤：a、用胚胎注射法提取沃尔巴克氏体转染蚊子胚胎得到转染成功的携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊；b、步骤a得到的转染成功的携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的筛选、鉴定和扩增；
步骤a所述用胚胎注射法提取沃尔巴克氏体转染蚊子胚胎具体包括三个步骤：胚胎注射针头的制备、QUI和GT胚胎的收集和准备、显微胚胎注射；
步骤b所述转染成功的携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊的筛选、鉴定和扩增，具体包括三个步骤：孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得GQ雌蚊、获取GQ雌蚊与GT公蚊交配后的子代、在子代中筛选并扩增转染成功的GQ蚊株。
2.一种稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊在防治白纹伊蚊中的应用，其特征在于，利用权利要求1得到的稳定携带致倦库蚊沃尔巴克氏体的白纹伊蚊GQ与野外白纹伊蚊种群是双向胞质不相容，首先进行种群压制，通过释放能与野外白纹伊蚊引起胞质不相容的GQ雄蚊，使得野外白纹伊蚊没有下一代；其次，进行种群替换，抗疾病传播的GQ雌蚊被输入和扩散到野外白纹伊蚊蚊群中；最后，继续以种群压制的方法通过释放GQ雄蚊来维持低水平的抗病蚊群数量。
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