CN106480162A - 一种真菌拮抗菌的快速筛选方法 - Google Patents

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庄桂芬
黄振东
薛志静
李研
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

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Abstract

本发明公开了一种真菌拮抗菌的快速筛选方法，该方法包括步骤一、收集目标真菌的孢子；二、准备至少三种培养液：待测菌培养液、对照菌培养液和LB细菌培养液；三、配制步骤二中对应数量的相同琼脂：取琼脂糖30‑50mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，取下烧杯并冷却至35℃等步骤。通过该方法快速测定待测菌对孢子的萌发率从而判断待测菌是否为真菌的拮抗菌，该方法试验周期短，能快速的筛选出真菌的拮抗菌，满足了实验要求。

Description

一种真菌拮抗菌的快速筛选方法
技术领域
本发明涉及真菌拮抗菌筛选领域，具体为一种真菌拮抗菌的快速筛选方法。
背景技术
真菌大致分为植物病原真菌、动物致病真菌、环境污染真菌和食品污染真菌等几类。对于动物致病真菌，该种真菌在动物体内或体表滋生，在体外难以培养，因此对其拮抗菌的研究较少；而对于植物病原真菌、环境污染真菌和食品污染真菌，其生活环境相对开放，孢子可大量释放于环境中，该类孢子便于收集，因此现实中研究植物病原真菌、环境污染真菌或食品污染真菌的拮抗菌的较多。
拮抗菌的筛选主要通过平板对峙培养法进行筛选，该方法通过将真菌与待测菌分别放置在平板两侧，通过观察是否形成抑菌带从而判断待测菌是否具有拮抗作用，该方法虽然操作简单且便于观察，但由于部分真菌的生长缓慢，因此该方法实验周期较长，且该实验过程受外界环境影响较大，从而制约着拮抗菌的筛选。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供一种真菌拮抗菌的快速筛选方法，通过该方法快速测定待测菌对孢子的萌发率从而判断待测菌是否为真菌的拮抗菌，该方法试验周期短，能快速的筛选出真菌的拮抗菌，满足了实验要求。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明包括以下步骤：
一、收集目标真菌的孢子；
二、准备至少三种培养液：待测菌培养液、对照菌培养液和LB细菌培养液；
三、配制步骤二中对应数量的相同琼脂：取琼脂糖30-50mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，取下烧杯并冷却至35℃；
四、制作步骤三中对应数量的琼脂基质：往每杯将要凝结的琼脂中以枪头分别注射步骤二中准备的培养液，并轻轻搅拌均匀，使培养液与琼脂的体积比为2-10％，分别做成待测菌琼脂基质、对照菌琼脂基质和LB菌琼脂基质，所述每种琼脂基质中培养液与琼脂的体积比相同；
五、分别将步骤四中的每种琼脂基质平铺于相应的载玻片上，厚度约1-2mm，待其凝结，每种琼脂基质在载玻片上的尺寸相同；
六、制作步骤五中相应数量的孢子平板：在凝结后的每一琼脂基质上喷洒少量无菌水，并分别加入等量的步骤一中收集的目标真菌的孢子，使其粘附于相应的琼脂基质上，分别形成待测菌孢子平板、对照菌孢子平板和LB菌孢子平板；
七、将步骤六中每个孢子平板分别置于底部有浸湿滤纸的培养皿内，加盖保湿相同时间；
八、将步骤七中各个培养皿再置于27-30℃培养箱内继续保湿培养；
九、分别于培养后6h、12h、24h，观察、计数各个培养皿上的孢子的萌发率。
由于大部分真菌均通过孢子进行传播，而孢子的萌发是真菌是否能生长、定殖、入侵的先决条件，因此通过本方法计算真菌孢子的萌发率从而判断待测菌对真菌是否具有抑制作用，最后根据孢子萌发率的大小来判断待测菌是否为目标真菌的结抗菌，该方法不像对峙培养法那样需要等待目标真菌生长完整，节约了试验时间，大大缩短了真菌拮抗菌的筛选时间。
本发明设计了，所述待测菌为家蝇体内分离的铜绿色假单胞菌，所述对照菌为大肠杆菌，所述孢子为禾谷镰刀菌孢子。
附图说明
图1所示为实验结果示意图。
具体实施方式
禾谷镰刀菌Fusarium graminearum是一种植物的根部致病菌，可引起穗腐、茎腐、茎基腐和根腐病等病害，是一种重要的植物病原真菌；以下3个实施例均以禾谷镰刀菌孢子为研究对象，以家蝇体内分离的铜绿色假单胞菌为待测菌，以大肠杆菌为对照菌，以LB细菌为空白参照。
实施例1：
本发明包括以下步骤：
一、收集禾谷镰刀菌孢子；
二、准备三种培养液：待测菌培养液、对照菌培养液和LB细菌培养液；
三、配制三杯相同琼脂：取琼脂糖30mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，取下烧杯并冷却至35℃；
四、制作三种琼脂基质：往每杯将要凝结的琼脂中以枪头分别注射步骤二中准备的培养液，并轻轻搅拌均匀，使培养液与琼脂的体积比为2％，分别做成待测菌琼脂基质、对照菌琼脂基质和LB菌琼脂基质，所述三种琼脂基质中培养液与琼脂的体积比相同；
五、分别将步骤四中的三种琼脂基质平铺于三个载玻片上，厚度约1mm，待其凝结，三种琼脂基质在载玻片上的尺寸相同；
六、制作三种孢子平板：在凝结后的每一琼脂基质上喷洒少量无菌水，并分别加入等量的步骤一中收集的目标真菌的孢子，使其粘附于相应的琼脂基质上，分别形成待测菌孢子平板、对照菌孢子平板和LB菌孢子平板；
七、将步骤六中三个孢子平板分别置于底部有浸湿滤纸的培养皿内，加盖保湿相同时间；
八、将步骤七中各个培养皿再置于27℃培养箱内继续保湿培养；
九、培养后6h，观察、计数各个培养皿上的孢子的萌发率。
结果表明：禾谷镰刀菌孢子在以铜绿色假单胞菌为琼脂基质的孢子萌发率约为28％；以大肠杆菌为琼脂基质的孢子萌发率约为84％；以LB菌为琼脂基质的孢子萌发率约为85％；通过三个数据对比，可以明显的看出铜绿色假单胞菌对禾谷镰刀菌孢子的萌发具有显著的抑制作用。
实施例2：
本发明包括以下步骤：
一、收集禾谷镰刀菌孢子；
二、准备三种培养液：待测菌培养液、对照菌培养液和LB细菌培养液；
三、配制三杯相同琼脂：取琼脂糖40mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，取下烧杯并冷却至35℃；
四、制作三种琼脂基质：往每杯将要凝结的琼脂中以枪头分别注射步骤二中准备的培养液，并轻轻搅拌均匀，使培养液与琼脂的体积比为6％，分别做成待测菌琼脂基质、对照菌琼脂基质和LB菌琼脂基质，所述三种琼脂基质中培养液与琼脂的体积比相同；
五、分别将步骤四中的三种琼脂基质平铺于三个载玻片上，厚度约1.5mm，待其凝结，三种琼脂基质在载玻片上的尺寸相同；
六、制作三种孢子平板：在凝结后的每一琼脂基质上喷洒少量无菌水，并分别加入等量的步骤一中收集的目标真菌的孢子，使其粘附于相应的琼脂基质上，分别形成待测菌孢子平板、对照菌孢子平板和LB菌孢子平板；
七、将步骤六中三个孢子平板分别置于底部有浸湿滤纸的培养皿内，加盖保湿相同时间；
八、将步骤七中各个培养皿再置于28℃培养箱内继续保湿培养；
九、分别于培养后12h，观察、计数各个培养皿上的孢子的萌发率。
结果表明：禾谷镰刀菌孢子在以铜绿色假单胞菌为琼脂基质的孢子萌发率约为6％；以大肠杆菌为琼脂基质的孢子萌发率约为86％；以LB菌为琼脂基质的孢子萌发率约为87％；通过三个数据对比，可以明显的看出铜绿色假单胞菌对禾谷镰刀菌孢子的萌发具有显著的抑制作用。
实施例3：
本发明包括以下步骤：
一、收集禾谷镰刀菌孢子；
二、准备三种培养液：待测菌培养液、对照菌培养液和LB细菌培养液；
三、配制三杯相同琼脂：取琼脂糖50mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，取下烧杯并冷却至35℃；
四、制作三种琼脂基质：往每杯将要凝结的琼脂中以枪头分别注射步骤二中准备的培养液，并轻轻搅拌均匀，使培养液与琼脂的体积比为10％，分别做成待测菌琼脂基质、对照菌琼脂基质和LB菌琼脂基质，所述三种琼脂基质中培养液与琼脂的体积比相同；
五、分别将步骤四中的三种琼脂基质平铺于三个载玻片上，厚度约2mm，待其凝结，三种琼脂基质在载玻片上的尺寸相同；
六、制作三种孢子平板：在凝结后的每一琼脂基质上喷洒少量无菌水，并分别加入等量的步骤一中收集的目标真菌的孢子，使其粘附于相应的琼脂基质上，分别形成待测菌孢子平板、对照菌孢子平板和LB菌孢子平板；
七、将步骤六中三个孢子平板分别置于底部有浸湿滤纸的培养皿内，加盖保湿相同时间；
八、将步骤七中各个培养皿再置于30℃培养箱内继续保湿培养；
九、分别于培养后24h，观察、计数各个培养皿上的孢子的萌发率。
结果表明：禾谷镰刀菌孢子在以铜绿色假单胞菌为琼脂基质的孢子萌发率约为7％；以大肠杆菌为琼脂基质的孢子萌发率约为83％；以LB菌为琼脂基质的孢子萌发率约为84％；通过三个数据对比，可以明显的看出铜绿色假单胞菌对禾谷镰刀菌孢子的萌发具有显著的抑制作用。
从上述三个实施例的实验数据可以看出，禾谷镰刀菌孢子在以铜绿色假单胞菌为琼脂基质的孢子萌发率很低，可以得出铜绿色假单胞菌就是禾谷镰刀菌的拮抗菌，如图1所示：其中铜绿色假单胞菌a、禾谷镰刀菌b、对照c；上述实施例中的对照菌只取了一种，为了能更快速的找到拮抗菌，可以增加对照菌的种类，那么从步骤二就开始准备相应数量与种类的培养液，由此可以看出该方法能大范围、一致性对比，不用像以往那样单独、逐一进行对比，大大缩短了实验周期，在农业、环保、食品等行业有广阔的应用前景。

Claims (2)

1.一种真菌拮抗菌的快速筛选方法，本发明包括以下步骤：
一、收集目标真菌的孢子；
二、准备至少三种培养液：待测菌培养液、对照菌培养液和LB细菌培养液；
三、配制步骤二中对应数量的相同琼脂：取琼脂糖30-50mg置于50ml烧杯中，加入1ml水，100℃水浴加热10min，使琼脂融化，取下烧杯并冷却至35℃；
四、制作步骤三中对应数量的琼脂基质：往每杯将要凝结的琼脂中以枪头分别注射步骤二中准备的培养液，并轻轻搅拌均匀，使培养液与琼脂的体积比为2-10％，分别做成待测菌琼脂基质、对照菌琼脂基质和LB菌琼脂基质，所述每种琼脂基质中培养液与琼脂的体积比相同；
五、分别将步骤四中的每种琼脂基质平铺于相应的载玻片上，厚度约1-2mm，待其凝结，每种琼脂基质在载玻片上的尺寸相同；
六、制作步骤五中相应数量的孢子平板：在凝结后的每一琼脂基质上喷洒少量无菌水，并分别加入等量的步骤一中收集的目标真菌的孢子，使其粘附于相应的琼脂基质上，分别形成待测菌孢子平板、对照菌孢子平板和LB菌孢子平板；
七、将步骤六中每个孢子平板分别置于底部有浸湿滤纸的培养皿内，加盖保湿相同时间；
八、将步骤七中各个培养皿再置于27-30℃培养箱内继续保湿培养；
九、分别于培养后6h、12h、24h，观察、计数各个培养皿上的孢子的萌发率。
2.根据权利要求1所述的一种真菌拮抗菌的快速筛选方法，其特征在于：所述待测菌为家蝇体内分离的铜绿色假单胞菌，所述对照菌为大肠杆菌，所述孢子为禾谷镰刀菌孢子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110283879A (zh) * 2019-03-29 2019-09-27 安阳工学院 一种真菌拮抗菌的快速筛选方法

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409494A (zh) * 2013-08-16 2013-11-27 江苏省农业科学院 镰刀菌拮抗菌的筛选方法

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