CN106447717A - 一种基于多角度的选择性光片照明显微成像的重建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多角度的选择性光片照明显微成像的重建方法，涉及光片照明显微成像技术领域。本发明为了消除光片照明显微成像(SPIM)技术中条状伪影和散射模糊、灰度不均匀以及轴向和横向分辨率差别对图像质量的影响，提出：针对不同角度获取的显微体数据，提取其尺度不变特征，进行匹配并通过聚类算法求出旋转中心，再用最近邻算法和加权平均重建，得到样本的清晰体数据。本发明对选择性光片照明显微成像系统采集的多角度图像进行融合，有效的抑制了图像噪声和散射模糊，提高显微图像的纵向分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及光片照明显微成像(SPIM)技术领域，尤其涉及一种基于多角度的选择性光片照明显微成像的重建方法。
背景技术
选择性光片照明显微成像系统(SPIM)：使用一层光束激发荧光样品，通过图像传感器(CCD)来检测成像，而入射照明光路和CCD接收荧光光路互相垂直，通过移动样品使入射光面激发不同的平面而得到整个组织的3D图像，同时保证细胞水平的分辨率。SPIM是一种非常优秀的组织结构和形态学的分析工具，能够达到生物大样品的最大成像深度且无需对样品切片，可以很快而且方便地研究表型学、小鼠大脑、淋巴结、发育阶段或者整个动物器官。首先用成型的低熔点琼脂包埋样本，或者用毛细玻璃管封装样本，其次将琼脂或毛细玻璃管浸泡到盛放有光学匹配液体的玻璃水槽中，激光器发出均匀单色的平行光束，光学元件将激光束转化成薄层单色平行光，CCD相机通过前端显微镜头聚焦到薄层光所在的平面上。最后，通过琼脂或玻璃管变换样本的位置，使样本中感兴趣的一个层面处于薄层光的照射下，CCD相机采集这一层面的激发荧光图像。通过对样本的位置变换，如平移、提升、旋转等，可以采集样本内部不同位置的激发荧光图像，通过重建就可以得到样本的三维成像(体数据)。
但是SPIM在成像过程中由于样本内部结构的不同，对光的散射和吸收不同，这会导致光线的强烈衰减，最后出现条状伪影和散射模糊，同时由于光线被吸收后导致采集数据的灰度不均匀。另外，由于SPIM的照明光片厚度和光片的间距远远大于采集图像平面的分辨率，这会导致体数据的轴向分辨率远低于横向分辨率。本专利所述的方法就是消除灰度不均匀以及轴向和横向分辨率差别对图像质量的影响。
发明内容
(一)要解决的技术问题
在SPIM成像过程中，因样本内部结构的差异，会造成SPIM内对光的散射和吸收不同，导致光线强烈衰减，并出现条状伪影和散射模糊；同时，由于光线被吸收后会造成采集到的数据灰度不均匀，影响成像效果。另外，SPIM的照明光片厚度和光片的间距过大，尤其在远大于采集图像平面的分辨率时，就会导致体数据的轴向分辨率远低于横向分辨率，这也会极大地影响SPIM成像的效果。
(二)技术方案
本发明针对SPIM成像过程中出现伪影或散射模糊、灰度不均匀、以及轴向和横向分辨率的差异，为了将图像质量的影响降低到最小。本发明提出了一种基于多角度的选择性光片照明显微成像的重建方法，包括：
首先采集样本某角度的体数据，然后对样本进行旋转并再次采集，依次得到多个角度的体数据；
针对不同角度的体数据，通过提取体数据的尺度不变特征，进行配准，求取旋转中心并聚类优化；
对空的重建体数据，进行旋转变换，采用最近邻原则和加权平均进行插值，得到样本的重建体。
所述的配准是基于欧式距离构造的相似度函数，函数的值越小说明越相似。
所述的插值是基于GPU并行实现的。
本发明采用一种包括入射照明光路、图像传感器、接收荧光光路的选择性光片照明显微成像系统实施，所述的入射照明光路由激光器发射的光束经过处理形成光片，该光片与物镜方向垂直，即xy断层面；样本受到光照后激发的荧光沿xy断层面的法线方向，即z轴，入射到图像传感器，从而形成一张图像数据。
所述的采集样本某角度的体数据，是指沿着z轴移动样本，得到多幅图像数据的集合。
所述提取体数据的尺度不变特征是针对入射照明光路和图像传感器接收荧光光路的方向组成的断层面，即x-z面进行等间距抽样得到的子数据。
所述的样本旋转过程中，每次旋转的角度一样，最多旋转360°；旋转方向为沿垂直于入射照明光路和图像传感器接收荧光光路的方向；求取旋转中心并聚类优化过程包括：
1)跟据旋转变换公式和匹配点反推出旋转中心集；
2)统计旋转中心点集中每个中心点的16邻域中包含点的个数；
3)找到个数最多的点，并计算这个邻域中所有点的平均值，即为估计的旋转中心点。
所述的求取旋转中心过程中，需在特征提取之前对等间距抽样得到的子数据沿着z轴拉伸，使x轴方向的分辨率与z轴一致，目的是为了更好的进行特征提取，和使求出的旋转中心误差更小。
所述的旋转中心点集通过匹配的特征点对反变换得到。
所述的通过聚类优化过程中，通过聚类算法剔除旋转中心点集中错误的旋转中心。
所述的聚类优化是指根据所求中心点集合的特点构造聚类规则剔除错误的中心点，在剔除错误的点后，通过计算平均值的来估计真实的旋转中心。
所述的最近邻算法和加权平均是基于CUDA代码库实现的。
(三)有益效果
本发明针对不同角度获取的显微体数据，提取其尺度不变特征，进行匹配并通过聚类算法求出旋转中心，再用最近邻算法和加权平均重建，得到样本的清晰体数据。最终减小了因散射或吸收不同造成条状伪影和散射模糊对图像质量的影响，同时消除了灰度不均匀，改善了图像的轴向和横向分辨率，极大地提高了SPIM成像质量。
附图说明
图1为作为本发明一实施例的基于多角度的选择性光片照明显微成像的重建方法的流程图；
图2为作为本发明一实施例中选择性光片照明显微成像系统采集数据的示意图；
图3为作为本发明一实施例中选择性光片照明显微成像系统采集的四个角度的体数据在各个面的某一断层图像；
图4为作为本发明一实施例中对多角度的光片数据的处理过程；
图5为作为本发明一实施例中以初始角度(106.120316)为基准角度进行重建，重建体数据在各个面的某一断层图像；
图6为作为本发明一实施例的基于多角度的选择性光片照明显微成像重建体数据的三维可视化。
其中，图2：2-1为图像传感器(CCD)，2-2为物镜，2-3为激光器，2-4为光片，2-5为样本池，2-6为载物管，2-7为样本。
具体实施方式
所述的光片照明显微成像的重建方法(如图1)包括：选择性光片照明显微成像首先采集某一定角度的体数据，然后对样本进行旋转并再次采集，依次得到多个角度的体数据(图1-S1)；针对不同角度的成像，计算数据的尺度不变特征，进行配准，求旋转中心并聚类优化(图1-S2)；针对不同角度的成像，进行旋转变换，采用最近邻原则和加权平均融合多个角度的体数据(图1-S3)。
所述的采集某一定角度的体数据，是指在不旋转载物管2-6的情况下移动物管2-6，得到多幅图像的集合。所述的对样本进行旋转并再次采集，是指旋转载物管2-6。图3展示了采集的结果；
所述的样本旋转过程中，每次旋转的角度一样，最多旋转360°。
所述的样本旋转过程中，旋转方向为沿垂直于入射照明光路和图像传感器接收荧光光路的方向。
所述的尺度不变特征的数据提取是针对入射照明光路和图像传感器CCD 2-1接收荧光光路的方向组成的断层面(xz面，如图4-a)进行等间距抽样得到的子数据的拉伸(如图4-b)，图4-c展示了提取特征的结果。
所述的拉伸为沿着z轴拉伸，使x轴方向的分辨率与z轴一致，目的是为了更好的进行特征提取，和使求出的旋转中心误差更小。所述的特征数据提取为提取断层面的尺度不变特征。
所述的配准是用欧式距离构造特征相似函数，函数的值越小说明越相似，图4-d是某两个角度的配准；所述的求旋转中心是指用配准点结合旋转变换公式反推出中心点；所述的聚类优化是指根据所求中心点集合的特点(图4-e)构造聚类规则剔除错误的中心点，在剔除错误的点后，通过计算平均值的来估计真实的旋转中心。
得到旋转中心后，以初始角度为基准角度，输入重建体的大小，本例是1272*700*500，把1272*700*500的体数据映射到各个角度，并根据最近邻和加权平均原则对其进行插值；如图4-f为重建体的第一个xz面图，图5为重建体的各个切面，图6是其的三维可视化。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于所述值。
下面结合附图对本发明的基于多角度的选择性光片照明显微成像的重建方法中的表示符号做如下声明：
体数据：V(Angle，y，x，z)，Angle代表角位置，y代表宽度坐标，x代表高度坐标，z代表深度坐标；Width，High，depth代表体数据各个方向的像素数；dy，dx，dz分别代表各个方向的一个像素点的实际大小，单位是mm；dAngle代表角度的间距；widthLength，highLength，depthLength分别代表各个方向的实际度量，单位mm；
feature(Angle，yi)表示在Angle角度和y＝yi断层面的SIFT特征点集合；
reVolume(newx，newy，newz)代表重建的体数据，newx，newy，newz分别为在高，宽，和深方向的坐标值；newdx，newdy，newdz分别代表重建体的各个方向的一个像素点的实际大小，单位是mm；nx，ny，nz分别代表重建体的连续坐标，单位是mm；
本发明的实现方案分为三个主要步骤：图像获取和求取旋转轴中心和数据融合。下面利用小鼠结肠实验描述本发明的步骤，实验中采用小鼠结肠进行选择性光片照明显微成像，成像系统成像区域大小为8.268mm×7.020mm；图像分辨率为1272×1080；每个像素大小为0.0065mm；样本每次沿着z轴(CCD 2-1接收荧光光路的方向，如图2)移动0.05mm，共移动5mm，即得到101张断层图像，参考图2；这样就得到了某一个角度的体数据，它的纵向每个像素点之代表0.05mm，使得图像的xz面和yz面的分辨率很差(如图3)，本发明采用沿着平行于y方向的轴旋转样本，再次采集数据，得到多个角度的数据，然后融合它们，以提高成像质量。以结肠实验为例，本发明的详细步骤如下：
步骤S1：实验中采用小鼠结肠进行选择性光片照明显微成像，xy面的图像尺寸1272×1080，z轴移动是从26.419399mm到31.419399mm每隔0.05mm采集一幅图像，共计101张，得到一个角度的体数据。沿着平行于y方向的轴旋转样本，在角度106.120316到376.120300每90度采集一轮(即z是从26.419399mm到31.419399mm每隔0.05mm采集一幅图像)，得到共计4个角度的体数据。我们把得到的体数据表示为originalVeiw＝{V(Angle，y，x，z)|Angle＝0，1，2，3；y＝0，1，...，1271；x＝0，1，...，1079；z＝0，1，...，100}，我们所获取的数据的参数有：角度数(AngleNum＝4)，体数据的尺寸{Width＝1272，High＝1080，Depth＝101}，各个方向的分辨率{dy＝0.0065mm，dx＝0.0065mm，dz＝0.05mm，dAngle＝90°}，每个角度体数据的范围{widthLength，highLength，depthLength；＝width*dy，high*dx，depth*dz}，即8.268mm×7.020mm×5mm，至此，我们得到了4个1272×1080×101的体数据(如图3)。
步骤S2：首先，抽取从角度对中选取3个进行特征匹配，且对每个体的xz断层面进行抽样，得到{V(0，yi，x，z)，V(1，yi，x，z)}、{V(1，yi，x，z)，V(2，yi，x，z)}、{V(2，yi，x，z)，V(3，yi，x，z)}，其中yi为y的抽样；x＝0，1，...，1079；z＝0，1，...，100。；接下来，拉伸z轴，使dx＝dy＝dz，这样新z轴尺寸为strZSize＝floor(depthLength/dx)＝769(floor()是求整函数)，也就得到了新的子体数据的z轴拉伸V(Angle，yi，x，strZ)，其中strZ是大于0小于strZSize的整数，如图4-a、4-b、4-c。
其次，提取V(Angle，yi，x，strZ)的SIFT特征点{feature(Angle，yi)}，如图4-d为{feature(2，1)}。接下来进行特征点匹配，以图4-e为例匹配(feature(0，1)，feature(1，1))，设Point∈feature(0，1)，Point*，mPoint#∈feature(1，1)，且
如果d(Point，mPoint*)*0.6＞d(Point，mPoint#)，则Point在feature(1，1)里有匹配的特征点为mPoint*，否则，没有匹配点，其中d(*)代表欧几里得距离。若Point对应的像素点位(w，h)，mPoint*对应的像素点为(mw，mh)，我们利用式1求这个匹配点对求出它对应的旋转轴中心(rx，rz)，
其中θ＝90°，这样我们就得到了一个旋转中心。对每一个在feature(0，1)里的特征点都在feature(1，1)搜索匹配特征，就能得到一组对应的匹配点match＝{wi，hi，mwi，mhi|i是正整数}，通过式子1得到一组旋转轴中心(rxi，rzi)。
最后，为了得到更精准的旋转轴中心，对(feature(0，yi)，feature(1，yi))、(feature(1，yi)，feature(2，yi))、(feature(2，yi)，feature(3，yi))进行匹配，就得到了一组旋转轴中心集Centre＝{(rxi，rzi)}，我们对点集C聚类，就去除了噪音点，如图4-f。聚类方法如下：
其中，num(Centre)是计算Centre中有多少个点，Max(rPnumi)返回序列中的最大值和最大值所在位置的索引。至此我们得到了rindex，即点集C中第index个点，再计算点集{ri|dis(ri，rindex)＜14∩ri∈Centre}的平均值即是我们所求的旋转轴中心在xz面(1080*500)的像素坐标，转换为连续的位置我们记为即旋转轴中心连续坐标中的坐标，单位mm。
步骤S3：首先，以为基准角度，重建体的尺寸为(700，1272，500)构造一个空的体{reVolume(newx，newy，newz)}，它们的参数newdx＝highLength/700＝0.01、newdy＝dy＝0.0065、newdz＝depthLength/700＝0.01。其次，把重建体的每个像素位置映射到它在每个角度的位置。每个角度相对基准角度旋转了设nx＝newx*newdx，nz＝newz*dz，ny＝newy*dy，则，
最后，对用最近邻原则和加权平均对reVolume(newx，newy，newz)进行赋值。图5是reVolume(newx，newy，348)、reVolume(newx，497，newz)和reVolume(227，newy，newz)；图6是reVolume的三维可视化。
通过对比图4-a，b，f，可知4-5图融合和了4-1，2，3，4的优点，单个角度4-4与4-5的对比最明显。所以，本发明可实现选择性光片照明显微成像技术中图像噪声和散射模糊的抑制，改善图像的轴向分辨率，提高图像的质量。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，包括：
首先采集样本某角度的体数据，然后对样本进行旋转并再次采集，依次得到多个角度的体数据；
针对不同角度的体数据，通过提取体数据的尺度不变特征，进行配准，求取旋转中心并聚类优化；
对空的重建体数据，进行旋转变换，采用最近邻原则和加权平均进行插值，得到样本的重建体。
2.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，所述的配准是基于欧式距离构造的相似度函数。
3.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，所述的插值是基于GPU并行实现的。
4.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，采用一种包括入射照明光路、图像传感器、接收荧光光路的选择性光片照明显微成像系统实施，所述的入射照明光路由激光器发射的光束经过处理形成光片，该光片与物镜方向垂直，即xy断层面；样本受到光照后激发的荧光沿xy断层面的法线方向，即z轴，入射到图像传感器，从而形成一张图像数据。
5.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，所述的采集样本某角度的体数据，是指沿着z轴移动样本，得到多幅图像数据的集合。
6.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，所述提取体数据的尺度不变特征是针对入射照明光路和图像传感器接收荧光光路的方向组成的断层面，即x-z面进行等间距抽样得到的子数据。
7.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，所述的样本旋转过程中，每次旋转的角度一样，最多旋转360°。
8.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，所述的样本旋转过程中，旋转方向为沿垂直于入射照明光路和图像传感器接收荧光光路的方向。
9.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，所述的求取旋转中心并聚类优化过程包括：
跟据旋转变换公式和匹配点反推出旋转中心集；
统计旋转中心点集中每个中心点的16邻域中包含点的个数；
找到个数最多的邻域，并计算这个邻域中所有点的平均值，即为估计的旋转中心点。
10.根据权利要求1所述的光片照明显微成像的重建方法，其特征在于，所述的求取旋转中心过程中，需在特征提取之前对等间距抽样得到的子数据沿着z轴拉伸。
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