CN106434856B - 一种测序仪运行测试的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种测序仪运行测试的方法，包括采用至少四种接头构建测序文库，四种接头含不同索引序列，索引序列最后一碱基分别为A、G、C、T；用与四种接头对应的测序引物，测序引物与接头构建的文库杂交后，其3’末端杂交于索引序列倒数第二位碱基上；测试时，四种测序文库上样到不同流道，四种测序引物分别加入含对应文库的流道，进行第一个测序循环，各流道分别发出单色A、G、C或T对应荧光，实现四个碱基信号强度测试。本申请的方法，能实现对四个碱基对应信号强度的测试；还能用于初期测试激光，检测四个通道的滤片是否准确，并检测平台移动系统和自动对焦系统是否正常，为测序仪运行测试提供了一种简单、有效，且全面的检测方法。
Description
技术领域
本申请涉及基因测序领域，特别是涉及一种用于测序仪运行测试的方法。
背景技术
基于采集光学信号的二代测序的基本原理是ATCG四种碱基用四种不同的荧光染料标记，在不同波长的激光下被激发出不同波长的光，通过一系列镜头、滤片和镜片将光传递到CCD上，通过CCD采集荧光信号。
在测序仪进行正常使用之前，通常需要对其进行运行测试。测序运行测试的内容包括，测定各个碱基对应信号的强度，所以需要整张芯片上同一个测序循环后发出的都是一种荧光。Illumina公司的专利CN101415839A中，利用切割位点的方式，通过尿嘧啶-N-糖基化酶对尿嘧啶的作用所生成的双链分子上无碱基位点，使“边合成边测序”反应中掺入的第一个碱基总是T，反应自通过该位点处的切割形成的3’末端游离羟基起始。因此如果模板多核苷酸双链体形成包含许多此类分子的成簇阵列的一部分，即所有的分子都通过这种方式被切割成测序模板，那么普通掺入整个阵列的第一个碱基将是T，这可以提供一种在测序运行测试时测定各个成簇阵列强度的序列不依赖性的测定法；也就是说，无论是什么测序样品，都可以采用该方法测定各个阵列簇的强度，这种测试方法不依赖于任何序列。
但是，这种方法仅适用于成簇阵列，并且只能保证测序反应中掺入的第一个碱基总是T，对于其它三个碱基ACG则没有提及；也就是说，虽然每个簇的第一个碱基都是T，可以用于显示各个簇本身的强度，但是，对其它三个碱基对应信号的强度则无法确定。
发明内容
本申请的目的是提供一种测序仪运行测试的新方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
1.本申请公开了一种测序仪运行测试的方法，该方法包括采用至少四种接头构建测序文库，四种接头中含有不同的索引序列，索引序列的最后一个碱基分别为A、G、C、T；采用与四种接头对应的四种测序引物，并且测序引物与各自的接头所构建的文库杂交后，其3’末端杂交于接头的索引序列的倒数第二位碱基上；运行测试，将四种接头构建的文库上样到芯片流道中，加入四种测序引物，进行第一个测序循环，测试A、G、C和T四个碱基对应信号的强度。
其中，索引序列的最后一个碱基，以及索引序列的倒数第二位碱基都是DNA序列按照正常的5’-3’顺序排列而言的；例如本申请的一种实现方式中，索引序列由十个碱基组成，则其最后一个碱基即从5’-3’数的第十位碱基，倒数第二位碱基则是从5’-3’数的第九位碱基。
需要说明的是，本申请的关键在于将四种不同索引序列的最后一个碱基分别设计为A、G、C、T，并且设计四种测序引物，测序引物与四种接头构建的文库杂交时，测序引物的3’末端正好杂交到索引序列的倒数第二位碱基上；这样在进行第一个测序循环时，四种测序文库分别添加到不同的芯片流道中，就可以保障各芯片流道中产生单色的碱基A或碱基G或碱基C或碱基T对应的荧光。本申请的一种实现方式中，四种测序文库添加到不同的芯片流道，同时测序引物也分别添加到含有对应的测序文库的芯片流道中，因此，四个芯片流道分别产生了单色的碱基A对应的荧光、碱基G对应的荧光、碱基C对应的荧光以及碱基T对应的荧光。
还需要说明的是，不同的测序平台，或者针对不同的测序对象，其接头序列和索引序列是固定的，相应的，其测序引物序列也是相对固定的，在这种情况下，只需要将其中的四种接头的四个索引序列的最后一个碱基分别改为A、G、C、T，并使其测序引物杂交后3’末端正好杂交到索引序列的倒数第二位碱基上，即可达到本申请的效果；因此，不同测序平台的接头、索引序列以及引物序列的具体序列并不构成对本申请的限定。可以理解，除以上改进以外，其它的，例如文库的构建、上样、测序、荧光信号收集和荧光强度测定等，都可以参考各测序平台各自的常规测序方法，在此不累述。
优选的，运行测试时，四种接头构建的文库分别上样到四个不同的芯片流道中，然后向四个芯片流道中分别加入四种测序引物的混合液，或者，四种测序引物分别加入到含对应的接头构建的测序文库的芯片流道中，进行第一个测序循环。
优选的，运行测试时，四种接头构建的文库混合一起上样到四个芯片流道中，然后向四个芯片流道中，分别加入四种测序引物，进行第一个测序循环。
需要说明的是，无论是四种接头构建的文库混合一起上样，还是四种测序引物同时加入到同一个芯片流道中，根据不同的需求和试验设计，运行测试时有以下几种方式：第一种，四种接头的文库分别添加到四个芯片流道中，四种测序引物混合一起，分别向四个芯片流道中加入四种测序引物；第二种，四种接头的文库分别添加到四个芯片流道中，四种测序引物，对应的分别加入到四个芯片流道中，这里所说的对应是指，向芯片流道中加入与芯片流道中的接头文库相对应的测序引物；第三种，四种接头构建的文库混合一起，做四个重复，添加到四个芯片流道中，即四个芯片流道中都分别含有四种接头构建的文库，然后四种测序引物分别加入到四个芯片流道中；第四种，四种接头构建的文库混合一起，做四个重复，添加到四个芯片流道中，四种测序引物混合一起，分别向四个芯片流道中加入四种测序引物。第一种、第二种和第三种方式都可以获得每个芯片流道单色的荧光，第四种获得的是A、G、C、T四色混合的荧光。
优选的，测序文库为DNB文库。需要说明的是，DNB即DNA纳米球，是由环状的DNA经滚环扩增而成，即将常规的线性DNA片段环化，形成DNA环，然后采用聚合酶Phi29进行链置换扩增，形成以DNA环为基础的，线性的若干个DNA环的序列重复的单链，由此形成的DNA纳米球；需要补充说明的是，DNB只是本申请的一种优选实施方案，本申请的方法并仅限于基于DNB的测序。
优选的，四种接头的序列分别为Seq ID No.1至Seq ID No.4所示序列；四种接头的索引序列分别为Seq ID No.5至Seq ID No.8所示序列。
需要说明的是，接头、索引序列的具体序列只是本申请的一种实现方式中的优选方案，如前面提到的，本申请的方法并不受限于具体的接头序列或索引序列。
优选的，四种接头对应的测序引物序列分别为Seq ID No.9至Seq ID No.12所示序列。
需要说明的是，测序引物序列的具体序列只是本申请的一种实现方式中的优选方案，如前面提到的，本申请的方法并不受限于测序引物的具体序列。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的测序仪运行测试方法，采用四种接头建库，四种接头分别含有四种索引序列，索引序列的最后一位碱基分别设计成A、G、C、T，并且设计四种测序引物，使得测序引物杂交到接头上后，其3’末端正好杂交于索引序列最后一位碱基的前一位，因此，在运行测试时，四种测序引物分别产生单色的四种碱基对应的荧光，实现对四个碱基对应信号强度的测试。同时还能用于初期测试激光，检测四个通道的滤片是否准确，并检测平台移动系统和自动对焦系统是否正常，为测序仪运行测试提供了一种简单、有效，且全面的检测方法。
附图说明
图1是本申请实施例中单色T碱基对应的荧光图像；
图2是本申请实施例中单色G碱基对应的荧光图像；
图3是本申请实施例中单色A碱基对应的荧光图像；
图4是本申请实施例中单色C碱基对应的荧光图像。
具体实施方式
本申请的测序文库采用的是由环状DNA扩增形成的DNB，本申请的测序仪运行测试也是以此为基础的；因此，Illumina公司专利CN101415839A中的方法并不适合于DNB。并且，如前面提到，Illumina公司的方法仅能保障每个簇的第一个测序循环为T，无法实现对四个碱基荧光强度的检测。因此，本申请创造性的，将四种不同索引序列的最后一个碱基分别设计为A、G、C、T，并且设计四种测序引物，使其与四种接头杂交时，测序引物的3’末端正好杂交到索引序列的倒数第二位碱基上，这样在采用四种测序引物进行第一个测序循环时就可以分别获得A、G、C、T四种碱基对应的荧光信号；这不仅可以用于检测各个碱基的荧光强度，而且可以用于初期测试激光，检测四个通道的滤片是否准确，平台移动系统和自动对焦系统的工作是否满足使用需求等。
可以理解，虽然本申请是在DNB的基础上进行的研究，实施例中也是依据DNB进行的试验；但是，采用四种不同的索引序列，将其最后一个碱基分别设计为A、G、C、T，并且设计四种测序引物，使其与四种接头杂交时，测序引物的3’末端正好杂交到索引序列的倒数第二位碱基上，这种发明思路并不仅限于DNB；其它常规的测序文库构建以及测试运行也可以使用本申请的方法，这都在本申请的保护范围内。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例的测序文库是由携带四种索引序列的接头混合在一起形成的，四种接头的具体序列如表1所示，四种接头对应的索引序列如表2所示，根据四种接头设计并合成了四种测序引物如表3所示，测序引物由nvitrogen公司合成。本例的测序芯片由CompleteGenomics提供。
表1 接头序列
表2 索引序列
| 编号 | 序列(5’-3’) | Seq ID No. |
| 1 | TTAATTAAG<u>G</u> | 5 |
| 2 | GACTCACTG<u>A</u> | 6 |
| 3 | ATAAGGCAG<u>T</u> | 7 |
| 4 | AATATCTCT<u>C</u> | 8 |
表3 测序引物
| 编号 | 序列(5’-3’) | Seq ID No. |
| 1 | ACTGCTGACGTACTGTTAATTAAG | 9 |
| 2 | ACTGCTGACGTACTGGACTCACTG | 10 |
| 3 | ACTGCTGACGTACTGATAAGGCAG | 11 |
| 4 | ACTGCTGACGTACTGAATATCTCT | 12 |
采用合成的表1所示序列的四种接头进行测序文库构建，建库的具体流程详见CG测序仪的双接头DNB建库方式。本例中，模板库是由切割的DNA环化形成的DNA环，DNA环化的方法参考文献：Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNANanoarrays,Radoje Drmanac,et al.Science 327,78(2009)；DOI:10.1126/science.1181498。具体的，将人类基因组DNA通过超声方式打断成主要为500bp长度的片段，片段的长度浮动区间为100bp，～400到～500bp；然后，利用聚丙烯酰胺纯化柱纯化获得人类基因组DNA片段，进行DNA环化处理。DNA环化处理包括：(1)取约1微克的DNA片段以10个单位的FastAP(Fermentas,Burlington,ON,CA)处理，37摄氏度60分钟，随后利用AMPure(AgencourtBioscience,Beverly,MA)磁珠纯化。(2)12摄氏度以40单位的T4DNA聚合酶(New England Biolabs(NEB),Ipswich,MA)孵育1小时，利用AMPure再次纯化，以上操作都依据试剂厂商的建议操作，产生非磷酸化的末端。(3)上述染色体DNA片段与合成的衔接头连接，反应体系为：1.5pmol的DNA片段在50mM三羟甲基氨基甲烷，5％PEG 8000，10mM氯化镁，1mM rATP，10倍于DNA片段摩尔量的5’磷酸和3’双脱氧法终止的衔接头以及4000单位的T4连接酶。连接反应中，T4连接酶将衔接头5’磷酸与染色体DNA的3’羟基形成嵌入的中间结构。连接反应结束后，通过AMPure纯化，移除没有结合衔接头。(4)DNA在以下溶液中60摄氏度下孵育15分钟，溶液中包括200微摩尔衔接头的链聚合酶扩增反应引物，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷，50毫摩尔氯化钾，1.5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔rATP,100微摩尔dNTPs，以便将3’端双脱氧末端衔接头片段换成末端为羟基的衔接头聚合酶连扩增反应引物。反应温度随后减低到37摄氏度，另加50个单位的耐高温DNA聚合酶和2000单位的T4DNA连接酶，随后在37摄氏度孵育30分钟。(5)约700皮摩尔AMPure纯化的衔接头连接物进行聚合酶链反应，反应液包括40个单位的(Stratagene,La Jolla,CA)1X Pfu Turbo Cx，3毫摩尔硫酸镁，300微摩尔dNTPs，5％DMSO,1摩尔三甲铵乙内酯和500纳摩尔衔接头引物进行聚合酶链反应；反应条件为，进行6-8个循环的：95摄氏度30秒，56摄氏度30秒，72摄氏度4分钟。DNA片段孵育在10毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷，50毫摩尔氯化钠，1毫摩尔乙二胺四乙酸中12小时。(6)利用T4连接酶使180纳摩尔非磷酸化的桥接片段与衔接头14摄氏度反应2小时形成单分子双链DNA环。经AMPure纯化和37摄氏度孵育60分钟，以减少残余线形DNA。取3皮摩尔的DNA加入200单位的ssDNA连接酶，在60摄氏度形成最终所需的单链DNA环。
获得环状的DNA后，测定DNA文库浓度，本例构建的文库浓度均控制为1.1ng/μL。获得的环状DNA在聚合酶Phi29的作用下，滚环复制半小时，制成DNB。制备DNB的具体方式为：100fmol/ul(100fmol/ul,170bp长度，约为7ng/ul)的单链DNA环在90摄氏度下与以下反应液反应10分钟。反应液包括：50毫摩尔三(羟甲基)氨基甲烷，10毫摩尔硫酸铵，10毫摩尔氯化镁，4毫摩尔二硫苏糖醇和100纳摩尔聚合酶链反应引物。以上反应液组成800微升体系，再加入800微摩尔dNTP和320单位的Phi29 DNA聚合酶，在30摄氏度下孵育30分钟，形成DNB。
测定DNB浓度，将其配制成8ng/μL，在同一张测序芯片的8个芯片流道上，以20μL浓度为8ng/μL的DNB进行loading，具体的，Seq ID No.1所示接头构建的DNB测序文库上样到第一和第二芯片流道，Seq ID No.2所示接头构建的DNB测序文库上样到第三和第四芯片流道，Seq ID No.3所示接头构建的DNB测序文库上样到第五和第六芯片流道，Seq ID No.4所示接头构建的DNB测序文库上样到第七和第八芯片流道。将四种测序引物分别配制成100μmol/L的工作液，在测序前，向测序芯片的各芯片流道中加入30μl测序引物，各测序引物对应的添加到含有相应测序文库的芯片流道中，具体添加方式为，测序引物1添加到第一和第二芯片流道，测序引物2添加到第三和第四芯片流道，测序引物3添加到第五和第六芯片流道，测序引物4添加到第七和第八芯片流道。
加入测序引物后，室温杂交30分钟，室温约22℃即可，使测序引物结合到DNB上，然后利用Complete Genomics公司的测序方法，完成第一个测序循环，具体测序方法参考CG测序仪的使用说明。
完成第一个测序循环后，在荧光显微镜下用绿光激发，获得单色的A、G、C、T四种碱基对应的荧光图像。结果显示，第一和第二芯片流道能且仅能检出G碱基对应的荧光信号，且芯片的背景非常干净，背景和亮点的亮度差异大，没有信号干扰，背景最低值400，最高值2000，滤片准确，提供了单一荧光在单一激光下的亮度；第三和第四芯片流道能且仅能检测A碱基对应的荧光信号，同样的背景也很干净，背景和亮点差异大，无信号干扰，背景最低值400，最高值2000，滤片准确；第五和第六芯片流道能且仅能检测T碱基对应的荧光信号，同样的背景也很干净，背景和亮点差异大，无信号干扰，背景最低值400，最高值2000，滤片准确；第七和第八芯片流道能且仅能检测C碱基对应的荧光信号，背景很干净，背景和亮点差异大，无信号干扰，背景最低值400，最高值2000，滤片准确。并且，所有图像都非常清晰，说明自动对焦系统和光学平台的移动都正常。部分结果如图1-图4所示，图1为第五芯片流道的图像，即T碱基对应的荧光图像；图2为第二芯片流道的图像，即G碱基对应的荧光图像；图3为第三芯片流道的图像，即A碱基对应的荧光图像；图4是为第七芯片流道的图像，即C碱基对应的荧光图像。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
Claims (6)
1.一种测序仪运行测试的方法，其特征在于：包括采用至少四种接头构建测序文库，四种接头中含有不同的索引序列，索引序列的最后一个碱基分别为A、G、C、T；采用与四种接头对应的四种测序引物，并且测序引物与各自对应的接头所构建的文库杂交后，其3’末端杂交于接头的索引序列的倒数第二位碱基上；运行测试，将四种接头构建的文库上样到芯片流道中，加入四种测序引物，进行第一个测序循环，测试A、G、C和T四个碱基对应信号的强度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：运行测试时，四种接头构建的文库分别上样到四个不同的芯片流道中，然后向四个芯片流道中分别加入四种测序引物的混合液，或者，四种测序引物分别加入到含对应的接头构建的测序文库的芯片流道中，进行第一个测序循环。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：运行测试时，四种接头构建的文库混合一起上样到四个芯片流道中，然后向四个芯片流道中，分别加入四种测序引物，进行第一个测序循环。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述测序文库为DNA纳米球文库，所述DNA纳米球是由环状的DNA经滚环扩增而成。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述四种接头的序列分别为SeqID No.1至Seq ID No.4所示序列；四种接头的索引序列分别为Seq ID No.5至Seq ID No.8所示序列。
6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述四种接头对应的测序引物序列分别为Seq ID No.9至Seq ID No.12所示序列。
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