CN106414504B - 用于治疗由谷氨酸兴奋性毒性引起的疾病的细胞可渗透肽系统 - Google Patents

Abstract

包含至少一种阻断谷氨酸突触前释放的肽的肽系统，所述肽具有序列SEQ ID NO 5:GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS；和/或序列SEQ ID NO 8:GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER，用于治疗与谷氨酸兴奋性毒性相关的病状。

Description

用于治疗由谷氨酸兴奋性毒性引起的疾病的细胞可渗透肽 系统

技术领域

本发明涉及医疗领域。更详细地，本发明涉及能够阻断NMDA诱导的谷氨酸突触前释放的新的肽系统。本发明的肽系统适用于治疗与谷氨酸兴奋性毒性相关的病状。

背景技术

脑中最丰富的氨基酸之一是L-谷氨酸。其在神经元水平上最重要的功能是控制兴奋性神经传递，这自20世纪50年代就已经被描述，并且其生理拮抗剂是γ-氨基丁酸(GABA)。

L-谷氨酸被认为是兴奋性信号和中枢神经系统中快速突触传递的主要介质。L-谷氨酸在中枢神经系统(CNS)的发育中，在突触的形成和消除中以及在细胞迁移、分化和死亡中起重要作用。此外，L-谷氨酸还是外周器官和组织以及内分泌细胞中传递信号的重要分子。

当它在生理水平释放时，L-谷氨酸在脑功能中具有基本作用，并且似乎参与正常脑功能的许多方面，包括认知、记忆和学习。矛盾的是，当L-谷氨酸在突触空间中达到高水平时，它变得高度毒性。因此有必要保持作为神经递质的游离L-谷氨酸和从突触空间去除和降解的L-谷氨酸的平衡。如果这种平衡得到良好控制，它会保持突触传递的正常生理。当这种平衡由于某些原因朝着突触空间中的L-谷氨酸持久性不平衡时，该事件导致对细胞存活非常危险的毒性状态。这种病理状态被定义为“谷氨酸兴奋性毒性”，并且其专门涉及中枢神经系统(CNS)，尽管该氨基酸具有普遍存在的性质。

谷氨酸能突触传递因CNS细胞上存在L-谷氨酸受体(GluR)的存在而发生。这些受体分为两个主要类别：离子型(iGluR)和代谢型(mGluR)谷氨酸能受体。

这两种受体类别功能不同。实际上，离子型受体是一组蛋白质(亚基)，其在细胞膜上形成离子通道，并通过向外和向内打开和流动离子来转导信号。相反，代谢型受体是横贯在细胞膜上，不允许分子通过膜但传递外部信号，开始一系列细胞内事件(第二信使)的蛋白。

亚型NMDA、AMPA和红藻氨酸盐(KA)构成离子型受体组的一部分。

代谢型受体组被标记为mGluR，并且其中8种不同的蛋白是已知的。

许多研究已经表明，谷氨酸的急性形式的神经毒性主要由谷氨酸(iGluR)的离子型受体介导。这种形式的神经毒性的特征在于iGluR突触前和突触后的过度活化，其涉及被动跟随Cl^-离子的大量Na⁺的神经元内的流入和K⁺离子的流出。离子的这种运动负责水的进入，这引起神经元“肿胀”，渗透性溶解和坏死。此外，大量的Ca²⁺流完成离子运动。

在负责谷氨酸突触前释放的谷氨酸能受体中，有被称为NMDA的谷氨酸能受体。这种受体是第一个被发现和表征的谷氨酸能受体。

NMDA从以特定方式药理活化它的化学物质命名，即：N-甲基D-天冬氨酸。它是由4个亚基形成的配体激活的通道受体，其中4个亚基一起在细胞膜中产生孔。它在神经元中的定位是突触后和突触前。

NMDA通道具有被镁离子正常阻断的特定特性。当存在神经元的去极化时，例如当谷氨酸的其他受体(AMPA，代谢型)被激活时，这种“镁阻断”不会发生。

NMDA受体由多个亚单位的组装体：GLUN1和GLUN2构成。后者又相应地分为其他同种型(2A-B-C-D)。亚基的组成在脑的各个部位和亚细胞定位中是可变的，但是GLUN1的存在对于正常受体功能是必需的。

NMDA受体复合物对于不同分子具有许多不同的键合位点——由于它们与谷氨酸一起是共激动剂——可以调节通道的开放，并因此调节对该事件的细胞反应的强度。这些调节位点是谷氨酸的位点(也是NMDA的位点)、甘氨酸的位点和多胺(精胺和亚精胺)的位点。

一旦突触前NMDA通道开放，存在Na⁺，Ca²⁺离子的入口和K⁺离子的出口。这种离子运动导致膜的去极化，并因此导致谷氨酸的释放。NMDA的去极化诱导细胞内激活导致神经递质释放的所有系统的Ca²⁺的增加和迁移。

即使现在许多研究已经描述了NMDA受体将外部信号转移到细胞内部的模式，仍然需要许多努力来了解在这种机制中哪些是结合NMDA受体和释放谷氨酸的蛋白。

这个论点的重要性在于许多病理学与兴奋毒性相关，即使药物存在试图对抗它们，但是迫切需要找到更具体地可以作为创新药物的目标的新的药理学靶点。

然而，除了对于神经元的生命是必需的之外，谷氨酸也可以变得相当有毒。在急性应激事件例如缺血、颅脑损伤和癫痫危象期间GluR的过度活化导致脑神经元的死亡。此外，谷氨酸的神经毒性也可以参与在神经变性和神经炎症的背景下分类的各种慢性疾病的发病机理。谷氨酸的神经毒性可通过NMDA、AMPA、KA受体或谷氨酸代谢型受体的第I组的异常刺激而发生。这些不同类型的受体的相对贡献根据所涉及的神经元和各种其他情况而变化。

谷氨酸通过这种受体的过度激活似乎在各种攻击后的细胞死亡中起重要作用，例如与癫痫状态、脑缺血、围产期窒息和颅外伤有关的那些。更具体地，似乎NMDA受体是更大程度地参与这些病理的受体；实际上，通过使用NMDA拮抗剂，可以缓解与这些病理相关的脑损伤程度。

当应激严重时，细胞死亡通过坏死发生，而如果其不太严重，则可触发凋亡型过程。所涉及的主要机制是通过配体依赖和电压依赖性通道连接到Na+和Ca²⁺的过量进入有关的离子不平衡。细胞内Ca²⁺浓度的增加以级联方式激活有助于细胞死亡的各种酶。离子稳态的变化、改变的能量细胞代谢、线粒体的毒性和来自自由基的氧化应激之间存在复杂的相互作用。

还已经提出GluR受体的慢性活化也起到基本作用，因为这可以在多种迟发性神经性障碍中诱导神经变性的过程。至少部分地，过度和长期活化受体如NMDA或AMPA的内源性谷氨酸似乎是诸如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默氏病和帕金森病疾病的发病机制的原因。目前在市场上临床药物被用于急性和慢性病。它们的活性通常是NMDA受体拮抗剂的活性。这种受体阻断剂一方面似乎有效并且在有些上述病状中产生初步益处，另一方面产生甚至可能是严重的副作用。因此，医学研究必须尽最大努力，继续鉴定受体的细胞内配偶体，在这种特定情况下是NMDA，以使得可能的药物的作用越来越具有特异性和少毒性。

在老年人群中引起慢性痴呆的最常见疾病是阿尔茨海默病(AD)。

在这种病理学中，发作是进行性的，并且从年轻时开始发展，那时认知功能轻微下降。

然后，在偶发性记忆减少发作之后，在语言和现实感知以及执行正常日常活动的能力方面存在认知缺陷的增加。

现在已经确定，该病理学是由于在分配给记忆的区域中的神经炎斑块和神经原纤维缠结的沉积。这些沉积物随时间流逝导致进行性神经元死亡，从而诱导尤其是皮质和海马的脑萎缩。

已认识到，通过淀粉样前体蛋白(AβPP)的淀粉样加工过量产生的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽的片段是AD原因的第一个因素。实际上，Aβ肽的胞外积累导致神经炎斑的形成。正在讨论关于神经元毒性的物质是循环的细胞外肽还是不溶性斑块。

神经原纤维缠结是病理学的另一种组织病理学特征。在这些缠结中最存在的蛋白质是与其超磷酸化形式的微管(Tau)相关的蛋白质。这些细胞间聚集体存在于各种神经变性病理学中，其被称为tau蛋白病。这种蛋白质的过度磷酸化被指示为这些病理学中神经元变性的原因。

帕金森病(PD)是一种神经退行性病变，其中中枢神经系统的特定区域主要由于严重的排尿问题击中运动系统而受到损伤。这种类型的缺陷归因于投射到条纹体的黑色物质的多巴胺能神经元的进行性变性。在脑组织中的分子水平上，PD的特征在于Lewy体的积累，Lewy体是蛋白质聚集体，其中α-突触核蛋白和泛素也可以在其他元件中被识别。有各种导致该病的病理学遗传突变体和蛋白质；在目前已知的那些中，还有Parkin，其突变是大多数家族性PD形成的原因和涉及各种基因转录的多功能蛋白DJ-1，DJ-1的功能丧失是早期PD发病的原因之一。

肌萎缩性侧索硬化(ALS)是影响脑运动神经元和脊髓的高度失能的退行性神经病理学。

该病起始于大量消耗，导致肌肉萎缩，并逐渐发展成肌肉瘫痪。

SLA通常是零星来源的，但一部分的遗传形式被认可。在遗传形式的情况下，超氧化物歧化酶(SOD1)的突变是疾病的原因。SOD1参与通过发挥解毒作用保护神经元细胞免受“氧化”。

突变的人SOD1导致对所讨论的神经元细胞有毒的聚集体的形成。

亨廷顿舞蹈病(HD)是具有遗传特性的神经变性病理学，其属于来自多聚谷氨酰胺的病理学类别。纹状体神经元的逐渐萎缩是这种病理学的主要特征，其导致具有非常熟知的排尿缺陷。

HD是亨廷顿蛋白(HTT)的N末端链的polyQ延长的结果，其不被这样降解并积聚在神经元中。

脑缺血不是具有退行性特征的病理学；然而，击中注定要死亡的神经细胞也可以在与其他神经变性病理的病理性共病中具有重要作用，并且其存在于癫痫以及围产期窒息和头颅创伤中。它是一种高度致残的疾病，会导致死亡或严重残疾。当由于心脏病发作，动脉瘤、血管闭塞、出血、创伤等原因，正常血流不再提供大脑区域时，局部缺血以明显突然的方式发生。由于受影响区域中的血液再灌注缺血期间氧和葡萄糖的丧失以及损伤导致神经元细胞经历高代谢应激。

在细胞水平上，缺血引起ATP的减少，细胞内钙的增加，氧化损伤和线粒体功能障碍。所有这些事件导致高的谷氨酸能传递，其导致兴奋性毒性并因此损害注定死亡的神经元细胞。

多发性硬化(MS)是脱髓鞘性慢性自身免疫性疾病，其击中中枢神经系统，引起各种各样的体征和症状。多发性硬化症击中神经细胞，使得脑和脊髓之间的交流困难。神经细胞通过轴突传递电信号，轴突被隔离物质髓鞘覆盖。在该疾病中，患者的免疫防御攻击并损伤该鞘。当这种情况发生时，轴突不再能够有效地传输信号。其致病机制是复杂的，并由兴奋毒性基础上的炎症和变性过程维持；确切的病因仍然未知。不同的理论提出遗传和感染原因；此外，已经指示了与环境风险因素的相关性。该疾病可以表现为许多神经系统症状，并且可以发展为身体和认知残疾。多发性硬化可以呈现多种形式，包括复发和进行性形式。

重性抑郁障碍是一种情绪障碍或病理学，其特征为抑郁情绪的发作伴随着低自尊和在正常的愉悦活动中的兴趣或快乐的丧失。抑郁症是一种复杂的疾病，由于遗传和环境因素，涉及神经系统的复杂网络。最确认的假说是“抑郁症的单胺能理论”，根据该假说，临床抑郁症将源于使用单胺例如5-羟色胺、多巴胺或去甲肾上腺素的一种或多种类型的脑突触的效率降低。新的研究表明抑郁症和一些参与谷氨酸信号传递的基因的一些变体之间的关系。据此，已经证明氯胺酮(已知用于阻断NMDA受体的物质)具有比常规抗抑郁药更快的抗抑郁作用，而常规抗抑郁药在显示结果之前需要许多周：氯胺酮能够在很大程度上反对抑郁症比目前用抗抑郁药(其确实没有有效地解决目前的问题)发生的方式更有效。

精神分裂症是一种严重的精神障碍，是复杂的，往往是有病的。精神分裂症的第一症状通常表现在青春期和早期成年期。受精神分裂症影响的人难以表达他们的想法；这种情况导致他们有幻觉、妄想、不连贯的思想以及不寻常的行为和言语。由于这些症状，被这种疾病打击的人们在与他人交流中具有严重的困难，并且倾向于与外部世界隔离。已经进行了各种尝试来解释改变的脑功能和精神分裂症之间的联系。最经典的假说之一是多巴胺的作用：多巴胺能神经元的功能障碍可能是导致精神病的症状的原因。最近的结果支持物理受试者中多巴胺和谷氨酸神经递质系统之间的异常关系的假说，并且表明能够影响谷氨酸盐传递途径的药物的开发可用于治疗精神病。

焦虑症是精神疾病的常见形式，其通常引起明显的痛苦和问题并导致生活质量下降。存在不同类型的焦虑障碍：例如，广泛性焦虑障碍、社交焦虑障碍、恐慌障碍和强迫性强迫性障碍。焦虑症的原因是未知的。然而，脑功能的一些改变似乎涉及各种焦虑症。此外，社会和压力条件可能有助于焦虑症的发展。由于遗传学、神经化学、心理药理学和神经成像技术的发展，对涉及恐惧、焦虑和相关干扰的生物学基础的理解-即使仍然不全面-已经取得了相当大的进展。特别地，关于焦虑的神经生物学基础的知识的显著增加源自对恐惧反应的行为组分的研究，特别是与涉及神经解剖学途径(杏仁核、前额皮质[PFC]、丘脑和海马)，以及可以至少部分解释个体对焦虑障碍的不同脆弱性的受体和遗传方面。在涉及的神经递质中，GABA、谷氨酸、5-羟色胺、神经肽和内源性大麻素发挥重要作用。

偏头痛是一种高度禁用的局限于中枢神经系统的神经病理学，其在最严重的情况下也与自主神经系统的症状相关。通常，病理学表现为局限在头部的疼痛，但也与恶心、呕吐、畏光和恐惧症有关。许多遭受偏头痛的人会有预兆，其表现在头痛之前的暂时视觉、运动和感觉障碍。目前，最确认的分子原因是在神经元，特别是皮质中发生的异常兴奋性兴奋性喘振，然后是在整个皮层区域延伸的神经元活动的抑制。目前使用的药物是在最严重的情况下与止吐药物相关的经典的镇痛药物。因此，在这种病理学中，谷氨酸盐的过度释放是器官紊乱的基础。

另一种谷氨酸释放是疼痛症状的原因之一的病理是慢性神经性疼痛。这是自外周纤维和中心纤维之间的神经信号的连接以异常方式起作用开始的中枢神经系统的病理学。通常，症状表现为持续的烧灼或电击感，并且感觉异常也常常存在于主疼痛位置的周围区域。痛觉过敏和异常性疼痛是这种病理的主要特征。

不幸的是，神经性疼痛难以治愈；目前使用的唯一药物是镇痛药，其通常导致无效。

本发明基于识别位于神经元终止的突触前区室上的NMDA受体的活化所诱导的谷氨酸释放的非常特异性的机制。特别地，下文详细描述的本发明实现了蛋白质c-Jun N-末端激酶(JNK)参与由NMDA受体活化触发的细胞事件的级联中的识别。这发生在第一次记录在突触前水平的JNK蛋白的存在时。在开始更详细的描述之前，及时指出JNK是具有与涉及许多细胞功能的不同信号途径相关的酶活性的普遍存在的细胞内激酶。JNK是涵盖在导致神经元死亡的信号中的核心作用的蛋白质，其在各种病理条件下得到验证。JNK可以在刺激酪氨酸激酶受体、细胞因子受体，与G蛋白偶联的受体和配体依赖性离子通道(包括NMDA受体)后被激活，并且它们表示信号细胞死亡的真正指标。虽然JNK通常与突触后NMDA受体相关，但其突触前的作用仍然很大程度上未被发现。

发明内容

本发明涉及能够特异性阻断NMDA诱导的谷氨酸突触前释放的肽系统。特别地，本发明涉及适于制备用于抑制参与控制谷氨酸释放的蛋白质的相互作用的两种细胞渗透性肽。在本发明肽系统的定义的上游，通过生物化学和电生理学方法，证实了JNK在突触前水平的存在，参与NMDA诱发的谷氨酸释放的控制。此外，通过使用敲除小鼠与JNK的单一同种型结合分子模型研究，在与本发明有关的研究过程中证明JNK的同种型2是介导该突触前的必需蛋白事件。更详细地，表明JNK2位于神经元的突触前部分，并且可能通过与称为突触融合蛋白1a(STX1a)的专有突触蛋白的相互作用来执行其对NMDA介导的释放的控制的作用。由于STX1a是神经递质释放机制的必需蛋白，本发明是基于JNK2和STX1a之间相互作用的研究，以确定两种蛋白质相互作用的部位。因此，设计了两种细胞可渗透的肽，其能够阻断这种JNK2-STX1a相互作用。以这样的方式设计肽，使得它们可以通过细胞屏障并抑制位于突触前水平的相互作用。因此，这两种肽能够特异性阻断NMDA诱导的谷氨酸突触前释放。这两种肽在下文中称为JGRi1和JGRi2。

附图说明

图1表示JNK蛋白的抑制对谷氨酸的突触前释放的作用，并且还显示了在不同刺激的作用下JNK蛋白的突触活化。A)表示从野生型小鼠的皮质制备的突触体的相关结果，所述突触体预先装载有放射性神经递质，然后如所示用不同的刺激孵育。结果表示为诱导释放的百分比。数据表示为三个重复(每个实验条件三个灌注室)的三个实验获得的平均值±SEM(平均值的标准误差)。**p<0.01相对于基础释放。B)从野生型小鼠的皮质制备的突触体预先装载放射性神经递质，并在如所示的刺激之前与L-JNKi1(2μM)孵育30分钟。结果表示为诱导释放的百分比。数据表示为从三个重复的三个实验(每个实验条件三个灌注室)获得的平均值±SEM(平均值的标准误差)。L-JNKi1阻止NMDA刺激引起的释放。**p<0.01相比于由NMDA诱发的100％释放。C-D-E)具有相对定量的代表性蛋白质印迹，显示在KCl(B)刺激90秒，NMDA(C)10分钟，AMPA(D)10分钟后达到的p-JNK水平和用带L-JNKi1的突触体处理。结果表示为p-JNK/JNK比例相比对照(按100％计)的增加百分率。数据表示每个条件4个实验的平均值±SEM。用NMDA处理诱导JNK磷酸化增加**p<0.01相对于对照的100％)，而JNKi1不降低NMDA的作用(*p<0.05，相对于对照的100％)。

图2表示JNK在依赖于NMDA的谷氨酸的释放中的功能性作用。A)描述了来自菌株C57BL6/J的小鼠切片的7个神经元记录和与L-JNKi1(2μM)预孵育的小鼠C57BL6/J切片的10个神经元记录的诱发型EPSC的配对脉冲比(PPR)直方图(平均值±SEM)。在左边，在对照条件下，在施用D-AP5(50μM)期间和在洗涤D-AP5后，从相同的神经元获得代表性印迹。B)表示mEPSC(左)和从C57BL6/J的单个神经元记录的事件间间隔(右)或与D-AP5响应的与L-JNKi1预孵育的C57BL6/J神经元的振幅的累积分布。在对照条件下，在施用D-AP5和随后的洗涤期间，从相同的神经元获得顶部印迹。C)描绘了从C57BL6/J株的小鼠切片的11个神经元和回应D-AP5与L-JNKi1预孵育的小鼠C57BL6/J神经元切片的10个神经元记录的诱发EPSC的配对脉冲比(PPR)的直方图(平均值±SEM)。**p<0.01(t-检验)。

图3表示JNK控制Syntaxin 1a的磷酸化，并且JNK2/3与Syntaxin 1a一起免疫共沉淀。A)显示了在所示的治疗期间各自定量的STX1a的磷酸化的代表性的蛋白印迹结果。结果表示为百分比，并用对照标准化。数据是5个实验的平均值±SEM，其中10分钟的NMDA+L-JNKi1降低了pSTX1a/STX1a的比率(**p<0.01相对于对照的100％)，L-JNKi1自身也是如此(**p<0.01相对于对照的100％)。B)表示代表性的蛋白质印迹结果，其中各自的定量显示了在用D-AP5处理期间JNK的磷酸化水平。结果表示为相对于对照的百分比(100％)。数据是3次实验的平均值±SEM。C)显示了代表性的蛋白质印迹结果，其中各自的定量显示了在用D-AP5处理期间STX1a的磷酸化水平。结果表示为百分比，并用对照标准化。数据表示3个实验的平均值±SEM。D)表示相对定量的免疫共沉淀(Co-IP)的实验结果。如图所示刺激野生型小鼠的皮质突触体，并用STX1a抗体进行免疫沉淀。代表性的蛋白质印迹结果显示剥离程序后p-JNK的Co-Ip和JNK。将膜印迹为STX1a(作为免疫沉淀的对照)和SYT1(作为特异性的对照)。结果表示为相对于对照条件p-JNK/STX1a或JNK/STX1a比率增加的百分比。数据是每个处理的4个实验的平均值±SEM(*p<0.05，**p<0.01，相对于对照的100％)。

图4表示NMDA-诱发的谷氨酸释放和NMDA-诱导的JNK磷酸化在JNK2KO小鼠中如何被抑制。

A)表示在预装有放射性示踪剂的野生型和JNK-KO型小鼠的皮质中的突触体中通过NMDA刺激诱导的谷氨酸释放的结果。结果表示为诱导释放的百分比。数据是一次三个进行的4个实验的平均值±SEM(每个实验条件3个灌注室)。**p<0.01相对于WT；相对于JNK1-KO或JNK3-KO，p<0.05。B)表示定量的代表性蛋白质印迹结果，其显示了在治疗期间JNK2-KO或JNK3-KO小鼠中pJNK/JNK的比率。结果表示为相对于对照的百分比(100％)。数据表示3个实验的平均值±SEM(**p<0.01相对于100％的对照)。

图5表示同种型JNK2如何参与NMDA介导的谷氨酸释放。A)表示响应于D-AP5(50μM)的同工型JNK KO小鼠的单个神经元记录的mEPSC的幅度(左)和事件间间隔(右)的累积分布。在对照条件下，在施用D-AP5和随后的洗涤期间，从相同的神经元获得顶线。B)表示mEPSC(左)和事件间间隔(右)的振幅值的平均值的直方图(平均值±SEM)，其中响应D-AP5放的n＝8JNK1KO，n＝7JNK2KO和n＝6JNK3KO神经元。**p<0.01t-检验。

图6表示蛋白质相互作用JNK-STX1a的分子对接模型。A、B、C)代表从分别鉴定为模型1、2和3的STX1a和JNK2之间相互作用的研究中获得的三个最佳对接可能性。JNK2蛋白由组100表示，而STX1a的N末端部分由组200表示。D)表示STX1a的N-末端部分的结构：示出了300、400和500区段，其表示以最高概率与JNK2相互作用的部分。所有图像的渲染是通过使用VMD软件进行的。

图7表示用L-JNKi1处理不引起NMDA和AMPA受体亚单位(A)的改变，也不引起释放机制(B)的蛋白质的改变，不论在NMDA刺激条件期间还是它独自施用。

图8表示在电生理学膜片钳实验中两种肽JGRi1和JGRi2对野生型小鼠皮层切片中谷氨酸盐的释放的影响。更详细地，所讨论的图表示具有n＝9个神经元的事件间间隔的幅度值的平均值的直方图(平均值±SEM)，其中JGRi1和JGRi2一起应用或n＝4个神经元用于JGRi1和n＝6个神经元的JGRi2。**p<0.01t-检验。

图9表示肽的固相化学合成方法的实例。符号表示：小圈，氨基酸链保护基；R，氨基团保护；X、Y、Z、L，官能团。

循环重复该过程，直到获得肽。

图10表示从具有序列SEQ ID NO.5：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS的肽JGRi1的HPLC分析获得的色谱图。

图11表示从具有序列SEQ ID NO.8：GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER的肽JGRi2的HPLC分析获得的色谱图。

图12表示具有序列SEQ ID NO:5：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS的肽JGRi1的质谱。

图13表示具有序列SEQ ID NO.8:GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER的肽JGRi2的质谱。

具体实施方式

本发明基于在STX1a突触前水平存在JNK同种型(JNK1、JNK2、JNK3)存在的证实。以这种蛋白质相互作用为起点，设计两种肽：细胞可渗透的JGRi1和JGRi2，其能够阻断这种JNK2-STX1a相互作用并减少通过刺激NMDA受体诱导的谷氨酸的释放。

实验数据

c-Jun N端激酶(JNK)调节谷氨酸的突触前释放

JNK在突触前水平上的生理学存在通过进行谷氨酸释放实验来证明。由于该实验类型，可以研究JNK激酶在突触前区室中的作用。使用小鼠品系C57/BL6的分离皮层末端(突触体)。对预先装载有氚化的D-天冬氨酸([³H]D-Asp)的这些突触体进行由不同刺激诱导的谷氨酸释放。突触体用已经使用多年的方法即超表达进行刺激，其中突触体用连续的电流溶液不断洗涤，并且在某一点进行刺激。在该过程中释放的氚化谷氨酸由于突触前细胞内事件而被排他地释放，并且一旦收集，就被分配到β-发射辐射计数器中。突触体对轻微去极化刺激(8mM KCl)的瞬时暴露(90秒)诱导[³H]D-Asp明显地胞吐释放(158±37％对比，**P<0.01)，其与暴露于100μMNMDA的10分钟获得的释放相当(202±21％相对于对照，**p<0.01)。在缺乏Mg²⁺的培养基中应用NMDA刺激以确保突触前NMDA受体的有效性。以相同的方式，10分钟的50μM(S)-AMPA的刺激能够显著增加[³H]D-Asp的释放(98±11％相对于对照，**P<0.01)(图1A)。所有应用的刺激已知用于以Ca²⁺依赖性方式触发神经递质的释放。然后，为了研究JNK的可能的突触前作用，使用阻断JNK信号级联的特异性抑制剂

(L-JNKi1)，阻止JNK与结合JNK结合域(JBD)的靶蛋白的相互作用。L-JNKi1是市售的细胞渗透性肽，皮质突触体与它在2μM浓度下处理30分钟。有趣的是观察到，仅NMDA-刺激的谷氨酸的释放被L-JNKi1强烈抑制(-60±10％相对于对照＝100％**P<0.01)(图1B)，这表明是JNK信号级联在特异性调节NMDA诱发的谷氨酸释放中存在特异性。

在突触按钮级别激活JNK

上述报告的结果首次说明JNK在突触前按钮中的存在以及相应的功能。此外，很明显JNK能够调节由NMDA受体活化诱导的谷氨酸的释放。为了证实JNK的突触前位置及其它们可能的活化，对小鼠的皮质突触体进行生化实验，测量由上述刺激诱导的磷酸化(图1C-E)。在不含Mg²⁺的培养基中暴露于100μMNMDA 10分钟后，JNK的磷酸化增加(+63±18％，相对于对照＝100％**P<0.01)。由于L-JNKi1不影响JNK的磷酸化，即使其已经预孵育，所应用的NMDA刺激继续导致磷酸化JNK的增加(+49±10％相对于对照＝100％。*P<0.05)。相反，当L-JNKi1单独应用时，JNK基础磷酸化保持不变，表明该物质在基础系统中没有作用(图1D)。另外两种去极化刺激，AMPA和KCl，反而不能增加JNK的磷酸化，表明NMDA刺激是特异性调节JNK活性的(图1C-E)。

JNK介导NMDA依赖性谷氨酸的突触前释放

谷氨酸能末端上的突触前NMDA受体被自发释放的谷氨酸激活，并且通过正反馈机制，确定谷氨酸的强直释放。进行电生理记录以研究JNK在谷氨酸盐释放中的功能作用。为此，从与或不与JNK、L-JNKi1抑制剂(2μM，30min)一起孵育的成年小鼠C57BL6/J获得的内嗅皮质(EC)的大脑切片的锥体神经元测量称为双脉冲易化(PPF)的参数。这种双脉冲易化是通过膜片钳配置中电生理记录技术进行研究的模式。

在这种情况下，用NMDA受体拮抗剂D-AP5(50μM)的灌注不可逆地降低了以50ms间隔获得的双脉冲(PPR)关系(**p<0.01，Student t-检验，对照相对于D-AP5，n＝7；**p<0.01，Student t-检验，D-AP5相对于洗涤，n＝7；图2A)。当切片用L-JNKi1预孵育时，用D-AP5灌注不改变PPR(p>0.05，Student t-检验，对照相对于D-AP5，n＝10；图2A)。该数据表明，即使在更加整合的系统如大脑切片中，L-JNKi1也消除了NMDA依赖性突触前释放的概率，并且与突触体的释放数据一致。

随后，根据已经常用的方案，通过测量微型兴奋性电流(mEPSC)，研究L-JNKi1对NMDA依赖性突触前谷氨酸释放的影响。当在膜片电极下在存在细胞外河豚毒素(1mM)和微毒素(100μM)以及MK-801(10mM)、NMDA抑制剂(在记录的细胞中为了阻断突触后NMDA通道)的存在下将D-AP5应用，观察到累积事件(IEI)之间的间隔分布的可逆增加(***p<0.001，KS测试，C57BL6/J相对于D-AP5，n＝11；图2B)和其平均值(**p<0.01，Student t-检验，对照相对于D-AP5，n＝11；图2C)；另外，相同事件的累积幅度和平均值都没有受到影响(p>0.05，KS测试，C57BL6/J相对于D-AP5，n＝11；图2B，p>0.05，Student t-检验，对照相对于D-AP5，n＝11；图2C)。D-AP5引起的频率降低是由于突触前NMDA受体的阻断，这有助于补充性谷氨酸盐的释放。在与L-JNKi1预孵育的切片中，D-AP5效应丢失。实际上，发现用D-AP5灌注没有导致事件间间隔的显著变化(p>0.05，KS测试，C57BL6/J+L-JNKi1相对于D-AP5，n＝10；2B；p>0.05，学生t检验，对照相对于D-AP5，n＝10；图2C)，其振幅也没有(p>0.05，KS检验，C57BL6/J+L-D-AP5，n＝10；图2B；p>0.05，Student t-检验，对照相对于D-AP5，n＝10；图2C)。这些结果表明JNK的抑制降低了由突触前NMDA受体介导的谷氨酸的释放。

总体而言，我们的电生理数据表明JNK在NMDA急性治疗的脑切片中的谷氨酸的NMDA依赖性释放中发挥功能性作用。

JNK调节STX1a的磷酸化

Syntaxin 1a是用于装配SNARE复合物(可溶性NSF附着蛋白受体)的必需蛋白，其是释放神经递质的必要步骤。STX1a在ser14(pSTX1a)磷酸化在神经递质释放机制中的作用仍是一个有争议的主题。已经有一些报道，pSTX1a的减少具有降低神经递质释放的直接后果，而另一些实验证明pSTX1a的减少促进了神经递质的释放。

在暴露NMDA10分钟后，JNK磷酸化增加(图1D)，这引起STX1a(STX1a(S14))磷酸化的轻微但非显著降低(图3A)。有趣的是观察到用L-JNKi1预处理30分钟，然后NMDA刺激导致pSTX1a的显著降低(-40±6.4％，相对于对照＝100％，**P<0.01)。即使其对JNK的磷酸化没有影响(图1D)，L-JNKi1自身的施用令人惊讶地引起STX1a的磷酸化的强烈降低(-45±6.4％，相对于对照＝100％，**P<0.01)。为了解释这种现象，我们可以假设，由于突触体与缺乏Mg²⁺的培养基分批保持，所以神经递质(包括谷氨酸)可以积聚在细胞外区室中，因此即使在L-JNKi1单独施用时。然后将NMDA拮抗剂D-AP5用于估计pJNK(+10±8.9％相对于对照)(图3B)或pSTX1a(-10±7.2％相对于对照)相比对照条件(100％)下(图3C)可能的变化，从而排除发生这种变化的可能性。由于已知其他蛋白质是神经递质释放系统的一部分，所以分析了JNK与突触蛋白磷酸化的可能相互作用。

突触蛋白(SYN(S9))的磷酸化不受在所有实验条件下引起的刺激的影响(图3A)。总的来说，这些结果让我们可以假设JNK活性的抑制特异性地降低了STX1a的磷酸化。

JNK与STX1a相互作用

为了更好地理解在NMDA诱导的谷氨酸释放中JNK和STX1a之间的协同相互作用，进行了共免疫沉淀(Co-IP)实验(图3D)。用针对STX1a的特异性抗体免疫沉淀从突触体提取的蛋白质，然后通过蛋白质印迹用特异性抗体检测pJNK和JNK。对照(非免疫沉淀样品)给出具有较低条带(JNK1，46kDa)和较高条带(JNK2/3，54kDa)的典型JNK信号。令人惊讶的是，以JNK和磷酸化的pJNK形式的STX1a仅免疫沉淀JNK2和3同工型；事实上，抗体检测到上带。这个结果明显地阻止了蛋白质STX1a绑定到JNK1上，并表明STX1a和JNK2/3相互作用的形成已经在基础条件(Ctrl)下得到验证。此外，当用NMDA施用到L-JNKi1上时，相对于对照条件，JNK和pJNK的免疫反应性都显著降低(图3DA/KNK/STX1a：-42±2％对照＝100％；**p<0.01，比值pJNK/STX1a：-39±3％与对照＝100％；*p<0.05)，表明蛋白质-蛋白质相互作用被L-JNKi1扰乱。有趣的是观察到，通过应用L-JNKi1，在非刺激条件下STX1a-JNK2/3相互作用减少(图3D，比率JNK/STX1a：-44±4％，相对于对照＝100％；**p<0.01和比率pJNK/STX1a：-46±8％，相对于对照＝100％；**p<0.01)，显示相互作用是结构性存在的。为了评价免疫沉淀物的特异性，还使用了抗突触结合蛋白1抗体(Syt1)，其没有免疫沉淀，这表明STX1a-JNK2/3相互作用是特异性的。

在敲除JNK2的小鼠中，谷氨酸的释放和JNK的磷酸化不再受NMDA诱导

为了识别由突触前区室中的NMDA刺激活化的JNK的特异性同种型，对从敲除JNK(KO)的小鼠获得的皮质突触小体进行谷氨酸释放实验。通过NMDA施用10分钟诱导出谷氨酸的释放，测量[³H]D-Asp的流出量。有趣的是观察到，相对于JNK1、JNK3-KO小鼠和野生型型小鼠(WT)，只有在JNK2-KO小鼠中NMDA诱导的释放相对于对照显著降低(相对于本底为28±19％)，(图4A)。该结果表明突触前JNK2同工型特异性控制NMDA诱发的释放。

为了确认释放实验，如果不存在JNK2降低JNK的磷酸化，则对用NMDA刺激的突触小体进行研究。如所预期的，在JNK2-KO小鼠中，相对于对照，JNK的磷酸化被完全消除。相反，它仍保持在JNK3-KO小鼠中，其中NMDA诱导pJNK的增加(相对于对照＝100％为+76±10％；**p<0.01)(图4B)与在WT小鼠中完全相当(图1D)。在这两种情况下，L-JNKi1自身不能影响JNK的磷酸化。

膜片钳实验中JNK2调节NMDA依赖性谷氨酸释放

通过记录mEPSC，使用相同的上述方案对JNK1 KO、JNK2-KO和JNK3-KO小鼠进行电生理记录。D-AP5的灌注诱导JNK1-KO中的事件间期的累积分布的增加(***p<0.001，KS测试，JNK1 KO相对于D-AP5，图5A)和JNK3 KO(***p<0.001，KS测试，JNK3-KO相对于D-AP5，图5A)和平均值的增加(**p<0.01，Student t-检验，对照相对于JNK1或JNK3 KO；图5B)。在两种基因型中，mEPSC的振幅从未受D-AP5的影响(p>0.05，KS测试，JNK1或JNK3-KO相对于D-AP5，图5A；P>0.05，Student t-检验，JNK1或JNK3KO；图5B)，而在JNK2-KO小鼠中由于施用D-AP5而导致谷氨酸盐释放的减少已被特异性降低。实际上，D-AP5在mEPSC中没有产生显著变化(p>0.05，KS测试，JNK2-KO相对于D-P5；图5A；p>0.05，Student t-检验，对照相对于JNK2KO，图5B)，或幅度(p>0.05，KS测试，JNK2-KO相对于D-P5，图5A；p>0.05，Student t-检验，对照相对于JNK2KO，图5B)。总体而言，这些数据表明，在我们的实验条件下，只有JNK2同种型介导谷氨酸的突触前释放。

JNK变种的对接结果

通过比较三个JNK的不同序列，观察到JNK1提供18个特征性残基，JNK245个，而JNK3仅有11个。特征残基被定义为仅有一个同种型的特异性变体的残基，与其他两个JNK不同。

特征残基在蛋白质-蛋白质相互作用中是重要的，尤其是如果Syntaxin 1a与JNK的仅一种变体特异性相互作用，则这种变体的特征残基相对于其他JNK应当是不同的。JNK2明显不同于JNK1和JNK3的事实可以是其与Syntaxin的特异性相互作用的第一个指示。

随后，使用Rosetta软件进行蛋白质-蛋白质对接的模拟，用于模拟Syntaxin 1a和JNK2之间的复合物。

观察到从分析得到的三个主要结构是基于界面得分的三个最佳分类结构。这些中的每一个的渲染图像在图6中报告，其中JNK2用白色表示，而突触融合蛋白1a的N端用红色表示。

为了更好地评价这些结构，计算了隐藏的表面积。在模型1(图6a)和2(图6b)中，存在约1700A2的隐藏表面积，而模型3(图6c)呈现2680A2的表面积。然后分析界面残基并与JNK2的特征残基比较。该测试证明在模型3中，Syntaxin 1a的N-末端与八个特征残基相互作用，在模型2中具有五个这样的残基，在模型1中仅具有两个这样的残基。这些观察促使我们将模型3解释为获得的最佳相互作用构象。

然后获得呈现图像，其指示了突触融合蛋白1a的N-末端部分(区段300和400)的可能的接触位点。

在囊泡蛋白和NMDA或AMPA受体的亚基水平的机制下JNK的抑制没有引起变化。

然后监测几种突触前蛋白如Syntaxin 1a(STX1a)、突触蛋白(SYN)、Munc18-1和突触结合蛋白1(Syt1)的表达水平，因为它们的改变削弱了神经递质的释放机制。在我们的实验条件下，L-JNKi1，如果单独施用或与NMDA组合施用，没有修改突触体中STX1a、SYN、Munc18-1和Syt1的存在(图7A)。以相同的方式，NMDA和AMPA受体亚基的表达(图7B)保持不变，因此确保NMDA介导的对突触前JNK的影响不依赖于其表达水平的特异性修饰。

分析和构建抑制谷氨酸释放的肽

分析突触融合蛋白1a的N-末端部分的氨基酸序列，可鉴定形成特征性3α-螺旋的3个不同残基；它们是Ha、Hb和Hc。氨基酸序列(总共288个氨基酸)表示如下：

SEQ ID NO.1:

MKDRTQELRTAKDSDDDDDVTVTVDRDR(28)FMDEFFEQVEEIRGFIDKIAENVEEVKRKHSAIL(62)ASPNPDEKT(71)KEELEELMSDIKKTANKVRSKLKSIEQSIEQEE(104)GLNRSSA(111)DLRIRKTQHSTLSRKFVEVMSEYNATQSDYRER(144)CKGRIQRQLEITGRTTTSEELEDMLESGNPAIFASGIIMDSSISKQALSEIETRHSEIIKLETSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVERAVSDTKKAVKYQSKARRKKIMIIICCVILGIIIASTIGGIFG

Ha从氨基酸28到62

Hb从氨基酸71到104

Hc从氨基酸111到144

已经鉴定为在Syntaxin 1a上JNK2的相互作用位点的两个序列如下：

1)SEQ ID NO.2:IEQEEGLNRS

2)SEQ ID NO.3:MSEYNATQSDYRER

然后将这两个序列用于构建两个细胞可渗透肽JGRi1和JGRi2。

所述肽的功能是基于中断JNK2蛋白与突触融合蛋白1a的N-末端部分的相互作用的原理。因此，如果细胞具有不同长度的Syntaxin 1a的氨基酸序列，其从两种蛋白质之间的最小相互作用的位点或直到Syntaxin 1a的N末端的整个部分变化，那么这些肽将竞争性地参与与JNK2的相互作用，从而抑制与内源性Syntaxin 1a的键合。该事件能够减少谷氨酸的释放。可以认为有效的肽从Syntaxin 1a的整个N末端部分(288个氨基酸)至对应于序列SEQ ID NO.2：IEQEEGLNRS的最少10个氨基酸的长度上变化。或对应于序列SEQ ID NO.3：MSEYNATQSDYRER的14个氨基酸。

为了使肽具有细胞可渗透性，在本序列的N-末端部分之前插入HIV病毒的Tat蛋白(48-59)的序列，因此又增加了12个氨基酸。

Tat(48-59)具有以下12个氨基酸的序列：GRKKRRQRRRPP。

该序列是非常有效的，无论其是在每种可能的合成肽的N-或C-末端位置加入。肽的一个实例是以一种方式合成的具有26个氨基酸总长度的肽。

两个肽的序列如下：

JGRi1(SEQ ID NO.5):GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.6)IEQSIEQEEGLNRSGRKKRRQRRRPP或甚至关于Tat序列的相应的镜像序列例如(SEQ ID NO.7)PPRRRQRRKKRGIEQSIEQEEGLNRS

JGRi2(SEQ ID NO.8):GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER或(SEQ ID NO.9)MSEYNATQSDYRERGRKKRRQRRRPP或甚至关于Tat序列的相应的镜像序列如(SEQ ID NO.10)PPRRRQRRKKRGMSEYNATQSDYRER

所述两种肽由具有L对映体结构的氨基酸合成，但也合成为D对映体，以提高其在活生物体中的稳定性。

相同的序列可以作为相应的DNA序列插入，也插入到用于在细胞系、细菌中以及在病毒生产的载体中表达的不同载体中。

表达载体中的插入可以是完整序列，因此是

JGRi1(SEQ ID NO：5)：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.6)IEQSIEQEEGLNRSGRKKRRQRRRPP或关于Tat序列的相应的镜像序列例如(SEQ ID NO.7)PPRRRQRRKKRGIEQSIEQEEGLNRS

JGRi2(SEQ ID NO.8):GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER或(SEQ ID NO.9)MSEYNATQSDYRERGRKKRRQRRRPP或关于Tat序列的相应的镜像序列如(SEQ ID NO.5)PPRRRQRRKKRGMSEYNATQSDYRER或通过添加不同的结构域，因此首先是TAT的序列，然后是(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER，或反之亦然。此外，为了使最终蛋白在细胞系统中可识别，可以加入小片SNA，其编码小(tag)肽，例如HA、GST、Myc、EGFP等。

例如：pGEX-4、pTAT、p-EGFP-C1、pc-DNA、商购或还未用于基因治疗的3代慢病毒载体、用于辛德比斯病毒的载体、用于感染(转导)神经元的腺病毒。

在谷氨酸释放实验(如上所述)和电生理学实验(膜片钳，如上所述)中测试两种肽，以测试它们在减少神经递质的NMD诱发释放中的有效性。

在膜片钳实验中两种肽都导致谷氨酸的NMDA依赖性释放降低。将小鼠皮层切片处理30分钟，然后记录mEPSC与各种条件下肽的间期的累积分布。两种肽(JGRi1和JGRi2)无论以5μM的浓度一起加入还是以10μM的浓度分别加入，降低了抑制剂D-AP5阻断NMDA突触前受体的功能(图8)。该数据表明NMDA受体已经被细胞内通路中的两种肽有效阻断，因此作用于NMDA胞外部分的受体抑制剂不再具有作用。

这两种肽证实了突触体和脑切片上的有效性，表明假设它们在细胞外环境中施用，它们能够渗透进入细胞，也扩散到完整的组织中。还预计所述肽能够在生物体中完全扩散。为了减少它们的降解，从而增加它们的半衰期，本发明的肽系统是通过使用属于D立体化学系列的氨基酸合成的。

D-JGRi1:

dG-dR-dK-dK-dR-dR-dQ-dR-dR-dR-dP-dP-dI-dE-dQ-dS-dI-dE-dQ-dE-dE-dG-dL-dN-dR-dS

D-JGRi2:

d-G-dR-dK-dK-dR-dR-dQ-dR-dR-dR-dP-dP-dM-dS-dE-dY-dN-dA-dT-dQ-dS-dD-dY-dR-dE-dR

这些细胞可渗透肽的可能的给药途径包括所有已知的组合，其范围从具有直接生物利用度的那些到随着时间改变释放的那些组合。

我们包括通过腹膜内、肌内、皮下和静脉内注射(肽系统的生理溶液)，透皮吸收途径(膏药、软膏、乳膏、油等)、舌下(糊剂或固体溶液)、鼻内(各种生理溶液)和口服(口服制剂如悬浮液，片剂，胶囊等)途径。

此外，所有纳米技术制剂产生改性释放，无论是经皮或系统通过注射或口服给药。

此外，考虑新的给药途径：神经元干细胞的产生，工程改造使得它们以细胞可渗透形式(表达序列Tat)或非细胞可渗透形式产生肽系统。这些细胞一旦注射，一旦它们到达受退行性疾病袭击的脑区，能够增殖并原位释放肽系统。

制备本发明肽系统的方法

这些肽的合成通过目前通常使用的化学方法进行，其允许获得高达甚至70个残基的氨基酸链。使用固相化学合成仪，其中第一个氨基酸锚定于固体碱基(树脂)下，然后通过氨基酸之间的异肽反应，肽链通过重复循环延长(图9；改自Current Protocols inMolecular Biology(2002)11.15.1-11.15.9)。

合成后，使用HPLC(高效液相色谱)分析来从反应废物的污染物中纯化肽。此外，进行质谱分析的循环以验证肽的身份。当所获得的产率(具有26个氨基酸的肽)超过95％时，认为肽是良好的。

如果最终肽是L形式，则使用L立体化学形式的氨基酸形成肽链，如果最终肽是D形式，则使用D形式的肽。

质粒载体合成。

关于质粒系统，肽的核苷酸序列-无论它们是否都包含Syntaxin 1a的N-末端部分，或甚至更短的对应于序列(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS长度为10个氨基酸的肽和对应于序列(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER的含有14个氨基酸的肽以及所有可能的长度，也可在序列Tat＝(SEQ ID NO.4)GRKKRRQRRRPP的前(N末端)或后(C末端)端-插入在质粒表达载体中。

例如，对应于氨基酸序列(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.11)IEQSIEQEEGLNRS和(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER插入核苷酸序列，并且还将Syntaxin 1a的整个N末端部分插入细菌表达载体pTAT中。该载体的特定性质在于细菌合成的融合蛋白含有不同标签，其从N末端部分开始为：6xHis，序列Tat＝(SEQ ID NO.4)GRKKRRQRRRPP和标签人流感血凝素(HA)。除了用于使合成的蛋白质细胞可渗透的序列Tat之外，其它标签可用于通过特异性抗体识别外源蛋白质。

细胞表达的质粒制备和质粒细菌合成的蛋白纯化

在下文中，描述了关于含有包含作为本说明书目标的肽系统的质粒载体的细菌菌株的制备的几个实施例。下文指出的物质的量仅作为非限制性实例报道。因此，在本说明书的过程中，假设本领域技术人员理解使用甚至不同量的可能性，只要试剂之间的比例遵循以下实施例中所述。

含有上述序列的慢病毒质粒pGEX-4或pTAT或p-EGFP-C1或pc-DNA被插入大肠杆菌，例如菌株DH5α或BL21和化学感受态衍生物(rosetta)。然后，根据需要将5μg质粒DNA(p-EGFP-C1或pc-DNA)加入到20μL KCM 5X(含有0.5M KCl；0.15M CaCl₂；0.25M MgCl₂)，5μLMnCl₂，加水至100μL溶液。此时，加入等体积的化学感受态DH5α细菌细胞。将它们在冰(4℃)上放置几分钟。将整个溶液在室温下放置几分钟，产生热冲击。

然后，因为质粒含有抗生素抗性，加入含有100μg/mL氨苄青霉素在37℃下加热的600μL Luria Broth培养基(LB)(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，15g/L琼脂)。然后将溶液铺在具有相同浓度的氨苄青霉素的琼脂上。然后，通过MAXI-prep商业试剂盒进行质粒DNA的纯化用于细胞转染或用文献中经典方法合成慢病毒颗粒。

细菌BL21和衍生物的转化用不同的方案进行。

将5μg载体(pGEX-4或pTAT)加入到100μL细菌中，然后将其在4℃下孵育30分钟。然后，将溶液在42℃下放置45秒诱导热冲击。以这种方式，细菌掺入质粒。然后将溶液在冰中放置5分钟，接着加入4倍体积(400μl)LB。将整个溶液铺在含有氨苄青霉素的琼脂上，并使菌落在约37℃下生长12小时。

MINI-PREP，用限制酶切割

由于目的序列被插入限制酶之间，因此测试细菌生长以控制质粒在细菌内的实际掺入。

然后用无菌点提取生长的菌落，并置于5mL含氨苄青霉素的LB中。在37℃细菌生长5-6小时后，用商业试剂盒制备小量制备物。然后，将从每个菌落获得的等分试样DNA溶液进行酶切，利用限制酶作为亚克隆(37℃，60分钟)。

之后，让DNA在琼脂糖凝胶上运行，并在光度计上控制切割的序列。

让表达更多质粒的几微升菌落生长，以便接下来制备在-80℃冷冻的甘油储液。

生长和诱导：

从甘油储液中，来自单个菌落的细菌在37℃下在搅拌(250rpm)下作为预接种物接种在LB+氨苄青霉素(100μg/ml)中生长。

用1/50的预接种物在37℃(250rpm)下在新鲜的LB+Amp中生长(数量取决于预期产量的多少)，直至达到0.8-1的OD 600。

然后加入0.5mM IPTG以诱导外源蛋白的产生。

提取1mL的预接种物，并以5000rpm离心5分钟。然后将沉淀储存在-20℃下，以便随后在SDS-PAGE凝胶上分析。

在37℃以250rpm的速度诱导持续4-5小时。然后，将细菌在4℃以8000rpm离心20分钟。

倾析上清液称重沉淀并在-20℃下储存。

细菌团块的溶解

将具有以下组成(0.1M TRIS-HCl、1mM EDTA pH 7.5)的裂解缓冲液加入到沉淀中，每克沉淀物加2ml裂解缓冲液。

然后将沉淀重悬浮并加入1.5mg/g Lisozyme(来自10mg/ml储液)以裂解细菌。将溶液在室温下孵育2小时，并在200rpm下搅拌。

将裂解物在冰上孵育10分钟，然后持续50秒的4个脉冲进行超声处理。在一个脉冲与下一个脉冲之间，将溶液在冰中放置1分钟。

然后，在4℃下以12000rpm离心20分钟。

储存上清液并取出沉淀的薄片；将此片花破碎，使其变软。

包涵体的分离

加入裂解物的体积(超声处理后)是Triton缓冲液的体积的1/2。然后，将其在室温下以200rpm搅拌孵育30分钟。然后在4℃下以12000rpm的速度离心20分钟。将沉淀重悬于裂解缓冲液中。然后，加入Triton缓冲液，其体积等于管中体积的一半。然后将其在室温下以200rpm孵育。在4℃下12000rpm离心20分钟。

将沉淀重悬浮于洗涤缓冲液中并在4℃下以12000rpm离心20分钟。再次洗涤沉淀3或4次，总是用洗涤缓冲液。然后将沉淀储存在-20℃下。

溶解和透析

沉淀用5mL/g含有6M胍和1mM DTT的增溶缓冲液溶解。

2-3小时后，用HCl将pH调节至3-4。然后在4℃下以12000rpm离心20分钟。

然后将上清液用6M胍盐在pH 3-4下透析。

将透析溶液改变3次：每次洗涤在3小时后进行，第三次洗涤在4℃下保持整夜。

然后透析溶液变为pH为7的50mM的磷酸钠缓冲液**，用与胍盐进行透析所用的相同的模式更换透析溶液。

最后，在丙烯酰胺凝胶上使用透析物质的等分试样，用考马斯染色，其中必须看到对应于合成蛋白质的条带。

剩余的透析物质在离子交换柱上纯化。

**磷酸盐缓冲液的制备：

制备1M的NaH2PO4溶液和1M Na₂HPO₄溶液。将两种溶液一起加入，并确认pH 7。

在离子交换柱上纯化。

使用三种溶液：50mM pH 7磷酸盐缓冲液；50mM pH 7磷酸盐缓冲液+1M NaCl；20％乙醇+20％乙酸钠的H₂O溶液。

将溶液过滤，脱气并在+4℃下储存，以便在使用时是冷却的。

<110> 马尔科•费利焦尼

罗伯特•乔瓦尼•尼斯蒂科

<120> 用于治疗由谷氨酸兴奋性毒性引起的疾病的细胞可渗透肽系统

<130> A7718

<140> ITRM2014A000171

<141> 2014-04-04

<160> 13

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 1

Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu

20 25 30

Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala

35 40 45

Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser

50 55 60

Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile

85 90 95

Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp

100 105 110

Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val

115 120 125

Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg

130 135 140

Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr

145 150 155 160

Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile

165 170 175

Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu

180 185 190

Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser

195 200 205

Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu

210 215 220

Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala

225 230 235 240

Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys

245 250 255

Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys

260 265 270

Val Ile Leu Gly Ile Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly

275 280 285

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 2

Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 3

Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 4

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 5

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Ile Glu Gln Ser

1 5 10 15

Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser

20 25

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 6

Ile Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Gly Arg

1 5 10 15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro

20 25

<210> 7

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 7

Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Ile Glu Gln Ser

1 5 10 15

Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser

20 25

<210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 8

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Met Ser Glu Tyr

1 5 10 15

Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg

20 25

<210> 9

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 9

Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg Gly Arg

1 5 10 15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro

20 25

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 10

Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ser Glu Tyr

1 5 10 15

Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg

20 25

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 11

Ile Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 300

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 12

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Met Lys Asp Arg

1 5 10 15

Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Val

20 25 30

Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu Phe Phe Glu Gln

35 40 45

Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala Glu Asn Val Glu

50 55 60

Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser Pro Asn Pro Asp

65 70 75 80

Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser Asp Ile Lys Lys

85 90 95

Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile Glu Gln Ser Ile

100 105 110

Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu Arg Ile Arg

115 120 125

Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu Val Met Ser

130 135 140

Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg Cys Lys Gly Arg

145 150 155 160

Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr Ser Glu Glu

165 170 175

Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile Phe Ala Ser Gly

180 185 190

Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu Ser Glu Ile Glu

195 200 205

Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser Ile Arg Glu Leu

210 215 220

His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln Gly Glu

225 230 235 240

Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp Tyr Val

245 250 255

Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys

260 265 270

Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys Val Ile Leu Gly

275 280 285

Ile Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly

290 295 300

<210> 13

<211> 22

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 13

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Ile Glu Gln Glu

1 5 10 15

Glu Gly Leu Asn Arg Ser

20

Claims (6)

1.一种融合肽，其包含至少一种阻断谷氨酸的突触前释放的肽和至少一种细胞可渗透的肽；

其中所述细胞可渗透肽由以下氨基酸序列组成：

GRKKRRQRRRPP(SEQ ID NO：4)；

其中所述阻断谷氨酸的突触前释放的肽由选自以下的氨基酸序列组成：

IEQEEGLNRS(SEQ ID NO：2)，

MSEYNATQSDYRER(SEQ ID NO：3)，

和

IEQSIEQEEGLNRS(SEQ ID NO：11)；

和

其中所述融合肽包含选自以下的氨基酸序列：

GRKKRRQRRRPPIEQEEGLNRS(SEQ ID NO：13)，

GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER(SEQ ID NO：8)，和

GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS(SEQ ID NO：5)，

所述融合肽能够特异性阻断NMDA诱导的谷氨酸的突触前释放。

2.根据权利要求1所述的融合肽，其中所述融合肽中的氨基酸残基是L-氨基酸或D-氨基酸。

3.根据权利要求1所述的融合肽，其中所述融合肽还包含选自以下的标签序列：HA标签序列、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签序列、Myc标签序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的标签序列。

4.包含权利要求1的融合肽的药物。

5.药物组合物，其包含根据权利要求1所述的融合肽。

6.包含根据权利要求1所述的融合肽的药物组合物，其中所述药物组合物的剂型选自溶液、悬浮液、软膏、贴剂、片剂和胶囊。

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