CN106399175B - 二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的新用途 - Google Patents

二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了二肽meso‑DAP‑D‑Ala和/或四肽L‑Ala‑D‑Glu‑L‑Lys‑D‑Ala在制备结核分枝杆菌培养基或卡介苗分枝杆菌培养基中的应用。本发明的有益效果为：本发明提供的二肽meso‑DAP‑D‑Ala及四肽L‑Ala‑D‑Glu‑L‑Lys‑D‑Ala作为结核分枝杆菌的促生长因子，在开发新型结核分枝杆菌快速培养基中具有良好的应用前景，可用于结核分枝杆菌的分离培养、诊断培养、分型鉴定及药敏检测，培养基中加入上述两种化合物中的一种或两种混合物后，在液体培养基中菌群密度远远高于空白对照组，在固体培养基上出现肉眼可见的菌落比空白对照组提前5天，菌斑直径要明显大于空白对照组的菌斑直径，这两种肽类化合物可以促进结核分枝杆菌的快速生长。

Description

二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的 新用途
技术领域
本发明涉及化合物的新用途，具体涉及二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的新用途。
背景技术
结核病是一种全球性的传染性极强的疾病，全世界有1/3的人口感染结核分枝杆菌，每年由于结核病导致的死亡人数达百万以上（Andreu N, Fletcher T, Krishnan N,Wiles S, Robertson BD.. J Antimicrob Chemother. 2012, 67: 404–414）。由于结核分枝杆菌的生长速度非常缓慢，在常用的罗氏（Lowenstein-Jensen）固体培养基中一般需要28天的时间才能形成肉眼可见的菌落，这给结核病的诊断、分型鉴定及药敏试验带来很大的挑战。近年来，随着多药耐药结核分支杆菌(MDR-TB)及广泛耐药结核分支杆菌(XDR-TB)的大量出现（Espinal M A, Laszlo A, Simonsen L, et al. N Engl J Med. 2001,344:1294-1303），结核病的快速诊断和药敏检测显得尤为重要，这样可以更好的管理和治疗结核病人，减少耐药菌的传播。尽管现代分子生物学技术在结核病研究中发挥着越来越重要的作用，但是结核分枝杆菌的培养在结核病的诊断、流行病学指标、结核菌的分型鉴定、药敏试验、结核病药物的研究等方面依然有着不可替代的作用。因此，开发新的促进结核分枝杆菌快速生长的培养基对结核病的诊断、分型鉴定及药敏试验具有非常重要的意义。
目前，结核分枝杆菌病的培养基主要有固体培养基和液体培养基两种。固体培养基主要有改良罗氏（Lownstein-Jenson，L-J）培养基、小川辰次（Tatsujiogawa）鸡蛋培养基和美国Becton-Diskinson（BD）公司研制的Middle brook 7H10、7H11等琼脂培养基等。液体培养基主要苏通（Sauton）培养基和美国BD公司的Middle brook 7H9、7H12等液体培养基。其中罗氏培养基和小川辰次鸡蛋培养基是以鸡卵液为关键成分，在制备培养基时，要充分考虑鸡卵液的新鲜程度以及营养成分是否受到破坏，制备培养基的过程繁多而复杂，而且结核分枝杆菌在其上的生长速度要明显慢于BD公司的Middle brook 7H10和7H11固体培养基。以苏通培养基和BD公司的 Middle brook系列培养基主要是由琼脂、无机盐类及一系列的有机化合物等成分组成（Saito H. Laboratory media for the cultivation oftubercle bacillus. Kekkaku,1998,73(5):329-337.WHO. Laboratory services intuberculosis control,1998.）。目前，美国BD公司的Middle brook系列培养基是国外最常用于结核杆菌研究、诊断和药敏检测的培养基，其培养时间短，越来越受到国内外学者的关注。国内的医院及各级疾病预防控制中心主要还是采用传统的改良罗氏培养基来进行结核菌的分离培养、传代培养及药敏检测培养。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，通过研究结核分枝杆菌生长及复苏机制，从结核分枝杆菌减毒株H37Ra的培养液中，通过色谱分离得到具有促进结核分枝杆菌快速生长活性的化合物二肽meso-DAP-D-Ala（内消旋二氨基庚二酸-D-丙氨酸）及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala（L-丙氨酸-D-谷氨酸-L-赖氨酸- D-丙氨酸）两种化合物。迄今为止，尚未见到有关上述两种肽类化合物有促进结核分枝杆菌快速生长的报道，也未见到以这两种肽类化合物中的任意一种或组合物为组分的结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)分枝杆菌培养基上市，并依此提供了二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala两种肽类化合物的新用途。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala在制备结核分枝杆菌培养基或卡介苗分枝杆菌培养基中的应用。
本发明的第二个目的是提供了二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala在制备结核菌诊断培养基、结核菌分离传代培养基或结核病药敏检测培养基中的应用。
进一步的，上述的应用，所述二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的有效浓度为0.1-10μmol/mL。
本发明所述的二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala是两种白色粉末状物质，无气味,易溶于水，难溶于有机溶剂。其中二肽meso-DAP-D-Ala分子式为C10H19N3O5，分子量261；四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala分子式为C17H31N5O7，分子量417。这2种肽类化合物最初由结核分枝杆菌减毒株H37Ra的培养液中分离纯化得到，并由上海楚肽生物科技有限公司化学合成验证，试验所用肽类样品均由上海楚肽生物科技有限公司合成，两种样品的纯度均为96.5%。
为了获得二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的促进结核分枝杆菌的生长活性，本发明采取了以下技术路线与步骤：
1、结核分枝杆菌7H9-S液体培养基的配制：所述的7H9-S培养基组成为0.47% 7H9（购自美国BD公司，货号271310），0.2%甘油，0.05%吐温-80,0.085%氯化钠，0.5%小牛血清组分Ⅴ（Roche公司，货号10735094001），0.2%葡萄糖，0.003%过氧化氢酶（Sigma-Aldrich公司，货号C9322-1G）。配制时先称取0.47克7H9粉末，0.2ml甘油，0.05ml吐温-80，加入90ml超纯水后于121℃高压灭菌10分钟，然后加入用0.22um无菌滤膜除菌的ADC营养液10ml（ADC的配制如下：称取0.85克氯化钠，5克小牛血清组分Ⅴ，2克葡萄糖，0.003克过氧化氢酶，加入100ml超纯水充分溶解，用0.22um无菌滤膜除菌后，4℃冰箱保存）。
2、二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala溶液的配制：
用电子天平分别称取一定量的上述2种化合物放入2支试管中，分别用无菌水溶解，浓度均为50微摩尔/毫升，分别用0.22um的无菌滤膜除菌后装入2支无菌离心管中，作为促生长试验用的母液放入4℃冰箱保存。
3、促生长活性试验用的培养基配制：在配制好的无菌7H9-S培养基中分别加入上述2种化合物母液，每个化合物分别配置4个浓度梯度：即10微摩尔/毫升，5微摩尔/毫升，1微摩尔/毫升，0.1微摩尔/毫升，对照组加入相等体积的无菌水。
4、对结核分枝杆菌的促生长试验：首先从-80℃冰箱取出用甘油保存的结核分枝杆菌减毒株H37Ra,菌液浓度为1.0×108CUF/ml，先4℃放置30分钟后，取100ul菌液分别接种于装有5ml的7H9-S对照培养基及试验组培养基试管中，37℃培养箱中培养5天后，用酶标仪于OD600下检测各试验组的H37Ra菌密度，并对各试验组于7H10（购自美国BD公司）平板上进行菌落计数。研究结果表明，上述2种化合物在0.1微摩尔/毫升—10微摩尔/毫升浓度范围内，促生长活性非常明显，能使结核分枝杆菌菌浓度增加5-10倍，在液体培养基中菌群密度远远高于空白对照组，在7H10固体培养基（7H10购自美国BD公司，货号262710）上出现肉眼可见的菌落比空白对照组提前1周，菌斑明显大于空白对照组。
本发明的有益效果为：本发明提供的二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala作为结核分枝杆菌的生长因子，在开发新型结核分枝杆菌快速培养基中具有很好的应用前景，可用于结核病的快速诊断、分型鉴定及药敏检测。
附图说明
图1为本发明用到的式（Ⅰ）-式（Ⅱ）的结构示意图。
图2为7H10固体平板培养基上促生长试验空白对照组示意图。
图3为7H10固体平板培养基上促生长试验试验组示意图。
具体实施方式
实施例1：
对照培养基7H9-S液体培养基的配制：
电子天平上准确称取0.47克7H9，0.2ml甘油，0.05ml吐温-80，加入90ml超纯水后于121℃高压灭菌10分钟，冷却至室温，然后加入10ml的ADC营养液，即为配制好的7H9-S液体培养基。其中ADC营养液的配制如下：称取0.85克氯化钠，5克小牛血清组分Ⅴ，2克葡萄糖，0.003克过氧化氢酶，加入100ml超纯水充分溶解后，用0.22um无菌滤膜除菌，得到配制好的ADC营养液。
实施例2：
活性试验组培养基的配制：
用电子天平分别准确称取一定量的二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala两种化合物放入2支试管（试验所用样品均购自于生工生物工程上海有限公司，2种样品的纯度均为96.5%），分别用无菌水溶解，浓度均为50微摩尔/毫升，分别用0.22um的无菌滤膜除菌后装入2支无菌离心管中备用。然后将配制好的上述两种化合物溶液，用配制好的7H9-S液体培养基分别稀释至10微摩尔/毫升，5微摩尔/毫升，1微摩尔/毫升，0.1微摩尔/毫升共4个浓度梯度。
实施例3：
促生长活性测定：
从-80℃低温冰箱中取出用甘油保存的结核分枝杆菌减毒株H37Ra, 先4℃放置30分钟后,然后用无菌水稀释至菌液浓度为1.0×108CUF/ml，各取100ul分别接种于装有5ml的7H9-S对照培养基及各试验组培养基试管中，37℃培养箱中培养5天后，用酶标仪于OD600nm下读取吸光度值，从而检测各试验组的H37Ra菌株的生长密度, 并对各试验组于7H10（购自美国BD公司，货号262710）平板上进行菌落计数（其中结核菌减毒株H37Ra由美国约翰-霍普金斯大学分子微生物学与免疫学研究所张颖教授提供给本实验室）。结果表明，上述2种化合物在0.1微摩尔/毫升—10微摩尔/毫升浓度范围内，促生长活性非常显著，能使结核分枝杆菌菌浓度增加5-10倍，其中二肽meso-DAP-D-Ala组的促生长活性较强，两种肽类化合物对结核分枝杆菌H37Ra的促生长作用见表1。
表1
同时，用7H10固体平板培养基进行促生长试验，结果表明加入二肽和四肽后的试验组出现肉眼可见的菌落时间为18天，空白对照组出现肉眼可见的菌落时间为23天，试验组固体培养基出现肉眼可见的菌落比空白对照组出现肉眼可见的菌落要提前5天，且试验组菌斑明显大于空白对照组。固体培养基上培养18天后的结果见图2（空白对照组）、图3(加入二肽、四肽后的试验组）。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.二肽meso-DAP-D-Ala或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala在制备结核分枝杆菌培养基中的应用，所述二肽meso-DAP-D-Ala及四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala的有效浓度为0.1-10μmol/mL。
2.二肽meso-DAP-D-Ala和/或四肽L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala在制备结核菌诊断培养基、结核菌分离传代培养基或结核病药敏检测培养基中的应用。
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