CN106358729B - 一种用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法：将亲代种子经过人工老化处理后，选取不同发芽率梯度的亲代处理；破除硬实后进行育苗，然后移栽至大田中；单株收获；将各个子代处理，按照与亲代处理同样的步骤进行育苗、移栽、形态性状调查、单株收获。子代单株与其亲代是一一对应关系，即子代的各个处理每个单株的编号与其亲代单株是一一对应的。亲代和子代繁殖更新期间，进行形态标记分析及SSR分子标记分析以检测其遗传完整性。本发明还创新了破除野生大豆硬实的方法。本发明方法完整可行且系统规范，可应用本发明方法对库存的高生活力野生大豆进行繁殖更新以更好的维持其遗传完整性。

Description

一种用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法

技术领域

本发明属于作物种质资源学领域，涉及一种用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法。

背景技术

野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)是栽培大豆的直接祖先，自然条件下生长的野生大豆，在遗传方面从未受到人为选择的影响，因此很多丰富的功能基因并没有因为人为选择而丢失，这些基因很可能是大豆生产中所迫切需要的关键性基因。野生大豆具有蛋白含量高、抗逆性强、繁殖系数大等优良特性，是栽培大豆性状改良及品种选育的重要基因来源，也是研究大豆起源、进化、分类的宝贵资源。野生大豆在世界上分布非常狭窄，仅限于东亚非干旱的温带地区，包括中国、朝鲜半岛、日本、俄罗斯的远东地区、库页岛、千岛等。因此，长期保存和利用野生大豆珍贵资源具有深远的意义。

长久以来，国内外对于野生大豆的遗传完整性研究甚少，而对于其繁殖更新停留在随手撒播，任其自生自灭，居群内混合收获的状态，没有加以规范化和系统化。野生大豆种质在繁殖更新时因其生活力下降、繁殖地点、繁殖群体量、授粉和收获方式等不同，而丧失其遗传完整性。且野生大豆种子存在硬实现象，在自然条件下休眠期长，发芽率低，出苗也不整齐。因此，针对野生大豆在繁殖更新时容易发生遗传完整性变化的实际情况，制定出一套科学合理的用于野生大豆种质遗传完整性分析的繁殖更新方法已迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法，该方法完整可行且系统规范，可应用本发明方法对库存的高生活力野生大豆进行繁殖更新以更好的维持其遗传完整性。

为此，本发明提供一种用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法，包括亲代繁殖更新和子代繁殖更新。

所述亲代繁殖更新：将亲代种子经过人工老化处理后进行生活力检测，按照发芽率分组，选取不同发芽率梯度的亲代处理；各处理种子破除硬实后进行育苗，然后移栽至大田中；单株收获。

所述子代繁殖更新：将各个子代处理，按照与亲代处理同样的步骤进行育苗、移栽、形态性状调查、单株收获。

所述子代单株与其亲代是一一对应关系，即子代的各个处理每个单株的编号与其亲代单株是一一对应的。

亲代和子代繁殖更新期间，进行形态标记分析及SSR分子标记分析以检测其遗传完整性。形态标记分析时，从亲代和子代的每个处理中按照编号选出30个单株，对其进行11个形态性状调查。进行性状调查的30个单株，亲代与子代的编号一一对应。同样，进行SSR标记分析时亲代及子代均取96个单株(包括形态性状调查的30个单株)，子代采集叶片的单株与其亲代编号也是一一对应关系。

具体地，本发明用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法，步骤如下：

(一)亲代繁殖更新

1、繁殖地点选择

选择种质原产地或与原产地生态环境条件相似地区的地势平坦、地力均匀、形状规则、排灌方便且最少两年未种植野生大豆的田块；

2、种子老化及生活力检测

(1)种子人工老化：将播种、收获整齐度一致的同一份材料的野生大豆种子，破除硬实后，放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件为45％RH，26℃，30天，使处理种子的含水量处于7.5％±0.1％；然后用铝箔袋真空密封分装，平均分成若干份，放置于人工老化箱内40℃恒温老化；放置顺序采用倒序法，即人工老化时间最长的处理先放入进行老化，人工老化时间最短的最后放入进行老化，试验结束时一起取出；人工老化结束后在25℃下，将所有处理密封平衡2天。以未经过人工老化的处理为对照。

(2)生活力检测：参考农作物种子检验规程GB/T3543.4中的标准条件，将对照与经过不同老化时间的处理的野生大豆种子，破除硬实后，进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数。

所述破除硬实的方法如下：按以下比例：壳梭孢菌素6～7mg/L、柠檬草水提取物20～30mg/L，用35～50℃的温水配制成溶液。把野生大豆投入该溶液中浸泡并超声波处理10～15分钟。超声波处理结束后取出种子晾干即可。

3、育苗及移栽

按照遗传完整性分析的试验要求，选取包括对照在内的4～5个适合的发芽率梯度的野生大豆亲代处理进行育苗。

(1)破除硬实：将野生大豆种子破除硬实，方法如上所述；

(2)制备育苗培养基质：将砂壤土、草炭土、蛭石和珍珠岩按照体积比为4：3：2：1比例混合，加入复合肥(N：P₂O₅：K₂O＝15：15：15)，比例为每kg基质加入5g复合肥，加入破除硬实时超声结束后剩余的溶液，和适量的水搅拌混匀后，制得育苗培养基质。

(3)播种定盘：即将种子播种于育苗盘的过程。

(4)温室育苗：将步骤(3)中的育苗盘放入温室中，其上覆盖地膜保湿，温度控制在24.5～25.5℃，相对湿度为74.5～75.5％，种子出苗后将地膜掀掉。待幼苗长至三叶期后即可进行移栽。

(5)移栽大田：亩施农家肥1000～2000kg，磷酸二铵15kg。野生大豆每个处理田间定植100株，行距为50cm，株距为30cm，挖移栽穴，深10cm，将育苗盘中的幼苗移栽到大田中，及时填土浇水。

4、田间管理

(1)搭架：待幼苗长至20cm高时，用竹竿进行搭架。

(2)挂牌编号：待幼苗长至50cm高时，将定植于大田中每个处理的植株进行单株挂牌编号。

(3)栽培措施：常规管理即可。

5、形态性状调查及去杂

繁殖更新期间，从每个处理中按照编号选出30个单株，对其进行11个形态性状调查，这些性状包括：花色、粒色、粒形、脐色、茸毛色、荚色、结荚习性、株高、单株粒数、单株荚数和每荚粒数。并去除杂株。

6、收获、脱粒、干燥和保存

每个处理按照编号进行单株收获，脱粒，干燥至种子含水量8.0％以下，清选后保存。

(二)子代繁殖更新

1、繁殖地点选择：将野生大豆不同生活力的亲代各个处理繁殖更新所收获的种子次年原地进行繁殖更新。子代处理的繁殖的试验地及配套条件与其亲代一致。

2、生活力检测：子代处理繁殖更新时不需要经过种子老化。参考农作物种子检验规程GB/T3543.4中的标准条件，将各个子代处理进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数。破除硬实方法同上。

3、育苗及移栽：为保证与亲代各个处理的生长环境条件及种植密度一致，对子代处理进行育苗及移栽。破除硬实、培养基质、播种定盘、温室育苗和移栽大田过程与亲代一致。子代各个处理在育苗时，每格播种的种子是其亲代处理每个单株收获的种子，即育苗时每格长出的幼苗编号与其亲代单株是一一对应关系。每格播种2粒种子以保证成苗率。移栽时每格优选健壮的幼苗进行移栽。

4、田间管理：子代各个处理田间管理过程与其亲代一致。

5、形态性状调查及去杂：子代各个处理调查的形态性状与亲代完全一致。子代各个处理调查的每个单株与其亲代的每个单株也是一一对应关系，同样也是调查30个单株。去杂过程与亲代一致。

6、收获、脱粒、干燥和保存：子代处理的收获、脱粒、干燥和保存等程序与其亲代一致。

本发明提出了一整套完整可行且系统规范的用于野生大豆遗传完整性分析时的繁殖更新方法，特别是提出将不同生活力的亲代处理进行育苗移栽，对亲代处理的单株进行编号，并进行单株形态性状调查与收获，子代繁殖更新及形态性状调查时与其亲代处理是一一对应关系等技术创新。综合采用形态标记与SSR分子标记相结合的分析方法对提出的繁殖更新方法与常规的繁殖更新方法进行了遗传完整性对比分析，从而进一步验证了本发明提出的繁殖更新方法的可靠性和准确性。

本发明关键技术点及其有益效果如下：

1、本发明提出的繁殖更新方法重点之一在于繁殖更新时子代单株与其亲代单株的一一对应关系，即子代育苗时的各个处理每个单株的编号与其亲代单株是一一对应的；进行形态性状调查时，子代各个处理调查的单株与其亲代单株也是一一对应关系，其目的是为了在进行大豆及野生大豆遗传完整性分析时明确子代与其亲代的遗传对应关系，使得出的试验数据具有更高的可靠性和准确性，得出的试验结论具有更强的说服力。

2、将不同生活力的亲代处理进行育苗移栽：由于野生大豆种子经过人工老化后，其种子活力较差，若是直播种子，田间出苗率很低，不能保证每个处理的种植密度一致，因此本发明采用先育苗，然后移栽的方法，每个处理定植100株，以保证种植密度一致，使得形态性状调查数据可靠准确，避免了因种植密度不一致而造成形态性状调查数据失真。

3、本发明方法针对野生大豆需要破除硬实的问题，设计了一种配方独特的溶液，该溶液既能破除硬实又能用于制备育苗基质为其提供养分。本发明用温热的溶液浸种，配合超声波处理，较现有常规方法可以简单、快速、有效的破除硬实。且在基质中加入该溶液可以更好的促进野生大豆的发芽生根，提高育苗效果，且由于该溶液中具备抑菌成分，因此育苗基质中无需加入多菌灵等，减少了农药的使用，更为环保。

本发明所用柠檬草水提取物为柠檬草提取精油后的水提取物：柠檬草提取精油为常规技术，如，将干燥的柠檬草粉碎，取100g，按照1:15的料液比，放置在1L的蒸馏烧瓶内，浸泡12h，然后再用水蒸气蒸馏法蒸馏4h，得到柠檬草精油。所剩余的溶剂水及内含物部分，通过浓缩干燥后得到粉末，即本发明所述柠檬草水提取物。

柠檬草的化学成分主要是柠檬醛、月桂稀、β-蒎稀、C-β-罗勒烯、芳樟醇、香茅醛、香叶醇等。柠檬草作为一种重要的芳香植物，其精油在香精香料以及合成行业得到了很大的关注。柠檬草精油的提取多采用水蒸气蒸馏法，在传统工艺中，只收取精油部分，而将剩下的非挥发性水溶成分丢弃，浪费了其中的有效成分。研究发现提取精油后剩下的非挥发性水溶成分中包含黄酮类物质、单宁等，对于微生物具有广谱抗性，除了对植物致病菌外，对动物体内和其他环境中多种微生物的生长都能产生明显的抑制作用，具有良好的抑菌效果。

壳梭菌素是具有680分子量的碳三环二萜烯糖苷，壳梭菌素对植物的主要生理效应是：刺激细胞伸长生长，开启气孔增强蒸腾，打破种子休眠促进萌发以及成根诱导等等。它的显著特性之一是急剧提高细胞膜内的透性。还具有与植物激素类似的功能：增强节间和胚芽鞘的生长，诱导根的形成和活化H⁺/K⁺，刺激子叶生长和开启气孔，刺激种子发芽力和提高出苗率。

本发明经过试验，研究发现壳梭菌素与柠檬草水提取物可以应用于野生大豆破除硬实，而且柠檬草水提取物还具有显著的抑菌效果，将其用于育苗基质中，可以替代多菌灵等化学杀菌剂，起到生物杀菌抑菌的效果，更绿色环保。壳梭菌素用于育苗基质中可以促进种子发芽和提高出苗率。本发明采用此溶液一举多得，不仅提供了一种更有效的破除硬实的方法，而且还起到育苗基质消毒除菌的作用，同时还有促进发芽提高出苗率的效果。

附图说明

图1为本发明野生大豆亲代繁殖更新与子代繁殖更新时单株的一一对应关系示意图。

其中A表示进行人工老化；B表示田间繁殖过程(子代单株与亲代单株是一一对应关系)。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一应用本发明方法和常规方法对野生大豆进行繁殖更新并进行遗传完整性分析

(一)试验材料：以崂山野生大豆种子为试验材料。

(二)试验方法：

1、方法一：利用本发明提供的方法对崂山野生大豆进行繁殖更新。步骤如下：

(1)崂山野生大豆亲代处理繁殖更新

①繁殖地点选择：

a、繁殖地区：选择种质原产地。由于崂山野生大豆原产地为山东省青岛市崂山区，因此在当地找到一农户，租赁其土地进行繁殖更新，能够满足繁殖更新材料的生长发育及其性状的表达。

b、试验地：地势平坦、地力均匀、形状规则、排灌方便且两年内未种植野生大豆；远离污染源、无人畜侵扰、附近无高大建筑；避开了病虫害多发区、重发区和检疫对象发生区。试验地块为每个小区宽1.5m，长30m，一个小区内进行一个处理的繁殖更新。

c、配套条件：具备了育苗、收获、晾晒、贮藏等试验条件和设施。

②种子老化及生活力检测

a、种子人工老化：将播种、收获整齐度一致的崂山野生大豆亲代种子5000粒，破除硬实，放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件为45％RH，26℃，30天，使处理种子的含水量处于7.5％±0.1％；然后用铝箔袋真空密封分装，平均分成若干份，放置于人工老化箱内40℃恒温老化；放置顺序采用倒序法，即人工老化时间最长的处理先放入进行老化，人工老化时间最短的最后放入进行老化，试验结束时一起取出；人工老化结束后在25℃下，将所有处理密封平衡2天。以未经过人工老化的处理为对照。

b、生活力检测：参考农作物种子检验规程GB/T3543.4中的标准条件，将对照与经过不同老化时间的处理进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数(表1)。野生大豆发芽前需破除硬实，方法同上。

所述破除硬实的方法如下：按以下比例：壳梭孢菌素6～7mg/L、柠檬草水提取物20～30mg/L，用35～50℃的温水配制成溶液。把野生大豆投入该溶液中浸泡并超声波处理10～15分钟。超声波处理结束后取出种子晾干即可。

③育苗及移栽：

按照遗传完整性分析的试验要求，选取包括对照在内的4个适合的发芽率梯度的亲代处理，即处理g_p-ck₁、g_p-i₁、g_p-ii₁和g_p-iii₁进行育苗。由于野生大豆种子经过人工老化后，其种子活力较差，若是直播种子，田间出苗率很低，不能保证每个处理的种植密度一致，因此需要预先进行育苗，然后移栽到大田中，每个处理定植100株，以保证种植密度一致，使得形态性状调查数据可靠准确，否则会因种植密度不一致而造成形态性状调查数据失真。育苗步骤如下：

a、破除硬实：方法同上。

b、制备育苗培养基质：将砂壤土、草炭土、蛭石和珍珠岩按照体积比为4：3：2：1比例混合，加入复合肥(N：P₂O₅：K₂O＝15：15：15)，比例为每kg基质加入5g复合肥，加如破除硬实步骤中超声结束后剩余的溶液，和适量的水搅拌混匀后，制得育苗培养基质。

c、播种定盘：即将种子播种于育苗盘的过程。利用5×10格育苗盘育苗，将步骤a制备的培养基质填充于育苗盘中，填实抹平后，用喷壶均匀洒水，1～2小时后，用圆头小木棍或镊子等器具在每个育苗盘格子上打孔，直径1cm，深度2cm。将不同生活力处理的野生大豆亲代种子播种于小孔中，播种前需要破除硬实，方法同上。发芽率在80％以上的处理，每格播种1粒；发芽率在50～80％的处理，每格播种2粒；发芽率在30～50％的处理，每格播种3粒；发芽率在30％以下的处理，每格播种4粒。播种后用培养基质覆盖压实，再次洒水浇透即可。共育苗2盘。

d、温室育苗：将步骤b中的育苗盘放入温室中，其上覆盖地膜保湿，温度控制在24.5～25.5℃，相对湿度为74.5～75.5％，待种子出苗后将地膜掀掉。带幼苗长至三叶期后即可进行移栽。

e、移栽大田：幼苗移栽前，需造墒，精细整地，重施底肥，一般亩施农家肥1000～2000kg，磷酸二铵15kg。大豆每个处理田间定植200株。行距为50cm，株距为30cm，挖移栽穴，深10cm，将育苗盘中的幼苗移栽到大田中，及时填土浇水。移栽最好在下午进行，提高幼苗成活率。

④田间管理

a、搭架：由于野生大豆是无限生长蔓生型，因此必须搭架以满足生长要求。待幼苗长至20cm高时，便用竹竿进行搭架。架子形式为三角架，距离地面1.8m的架子顶端为一横梁竹竿，其上系麻绳，间距与株距相同为30cm，麻绳末端系一根竹筷或木棍，插入植株主茎附近的地面上，麻绳必须拉直，以便野生大豆向上攀爬。

b、挂牌编号：待幼苗长至50cm高时，将定植于大田中每个处理的植株进行单株挂牌编号。

c、栽培措施：封垄前及时进行中耕除草、培土；加强花荚期管理，争取多花多荚，防花荚脱落，花荚期施肥可根据长势酌情处理，如长势弱，花期可适当追肥，壮苗不追肥防止徒长，花荚期和鼓粒期可要适当浇水，防止受旱，以免影响百粒重及产量。需要注意地是每个处理的浇水施肥量必须相同，以免产生系统误差。适时除草，适期防病，科学治虫。播后芽前进行土壤封闭除草；如出现病虫害，要及时用药物防治。

⑤形态性状调查及去杂

a、性状调查：在崂山野生大豆亲代处理繁殖更新期间，从每个处理中按照编号选出30个单株，对其进行11个形态性状调查，这些性状包括：花色、粒色、粒形、脐色、茸毛色、荚色、结荚习性、株高、单株粒数、单株荚数和每荚粒数。

b、去杂：在形态性状调查期间，核对每个单株的生育期、花色、茸毛色、叶形、生长习性、结荚习性和株高等主要性状与主体类型明显不一致的个体，当作杂株拔除。

⑥收获、脱粒、干燥和保存

a、收获：适时收获。对每个处理按照编号进行单株收获，每个单株的种子收获后进行编号，以便繁殖其子代。

b、脱粒：每个处理每个单株收获的种子在脱粒前，必须打扫干净脱粒场地、机械、用具等，严防混杂；将每个单株的种子单粒脱，单袋装；种子袋标签编号须与每个处理的每个单株编号一致，袋内外各附标签，避免写(挂)错标签。

c、干燥：脱粒装袋后及时晾晒，防止发热霉变。干燥至种子含水量8.0％以下，可停止干燥。

d、清选：去除破损粒、病虫粒和泥沙等杂质。

e、保存：将清选过的种子用铝箔袋密封包装后保存于-4℃中期库内。

(2)崂山野生大豆子代处理繁殖更新

①繁殖地点选择：将崂山野生大豆的亲代各个处理繁殖更新所收获的种子次年原地进行繁殖更新。子代处理的繁殖的试验地及配套条件与其亲代一致。

②生活力检测：子代处理繁殖更新时不需要经过种子老化。子代处理的繁殖更新程序与其亲代大体一致，但不需要经过种子老化。参考农作物种子检验规程GB/T3543.4中的标准条件，将各个子代处理，即处理g_f1-ck₁、g_f1-i₁、g_f1-ii₁和g_f1-iii₁进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数(表1)。

表1崂山野生大豆发芽数据统计(方法一)

③育苗及移栽：为保证与亲代各个处理的生长环境条件及种植密度一致，对子代处理进行育苗及移栽。破除硬实、培养基质、播种定盘、温室育苗和移栽大田过程与亲代一致。子代各个处理在育苗时，每格播种的种子是其亲代处理每个单株收获的种子，即育苗时每格长出的幼苗编号与其亲代单株是一一对应关系。每格播种2粒种子以保证成苗率。移栽时每格优选健壮的幼苗进行移栽。

④田间管理：子代各个处理田间管理过程与其亲代一致。

⑤形态性状调查及去杂：子代各个处理调查的形态性状与亲代完全一致。子代各个处理调查的每个单株与其亲代的每个单株也是一一对应关系，同样也是调查30个单株。去杂过程与亲代一致。

⑥收获、脱粒、干燥和保存：子代处理的收获、脱粒、干燥和保存等程序与其亲代一致。

本发明中，子代繁殖更新时单株与其亲代是一一对应关系，即子代育苗时的各个处理每个单株的编号与其亲代单株是一一对应的，进行形态性状调查时，子代各个处理调查的单株与其亲代单株也是一一对应关系，其目的是为了在进行崂山野生大豆遗传完整性分析时明确子代与其亲代的遗传对应关系，使得出的试验数据具有更高的可靠性和准确性，得出的试验结论具有更强的说服力。亲代与子代各个处理关系如图1所示。

2、方法二：利用常规方法对崂山野生大豆进行繁殖更新。步骤如下：

(1)崂山野生大豆亲代处理繁殖更新

①繁殖地点选择：为保证对比试验的准确性和可靠性，繁殖地区、试验地和配套条件与方法一相同。

②种子老化及生活力检测：种子人工老化的材料、程序、方法与方法一相同，即同一批亲代处理种子。生活力检测的数据，包括发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数与方法一相同(表2)。

③播种：常规繁殖更新方法中没有育苗及移栽的步骤，而是将亲代处理种子直播，直播前用液氮法破除硬实(用布袋包裹野生大豆种子，放入液氮中浸泡4分钟，然后将种子取出来在室温25℃下使其自然升温，达到热平衡)。根据遗传完整性分析的试验要求，选取包括对照在内的4个适合的发芽率梯度的大豆，即处理g_P-ck₂、g_P-i₂、g_P-ii₂和g_P-iii₂进行直播。试验地块大小与方法一相同。每个小区根据发芽率播种，保证定苗100株。

④田间管理：播种前造墒，精细整地，重施底肥，一般亩施农家肥1000～2000kg，磷酸二铵15kg。出苗前后进行查苗，补苗，及时补种，但由于经过人工老化后，其活力较低，补苗后仍然出苗较差，因此不能保证种植密度一致。其余栽培措施与方法一相同。需要注意地是每个处理的浇水施肥量必须相同，以免产生系统误差。与方法一不同，对单株不进行编号。

⑤形态性状调查及去杂：在崂山野生大豆亲代处理繁殖更新期间，从每个处理中随机选出30个单株，对其进行11个形态性状调查，这些性状包括：花色、粒色、粒形、脐色、茸毛色、荚色、结荚习性、株高、单株粒数、单株荚数和每荚粒数。去杂过程与方法一相同。

⑥收获、脱粒、干燥和保存：收获方式为按照处理进行混合收获，即以处理为单位进行收获，以便繁殖其子代。脱粒方式为以处理为单位进行混合脱粒，纱网袋装，标签编号与处理编号一致，袋内外各附标签。干燥和清选方式与方法一相同。用纱网袋盛装后保存于-4℃中期库内。

(2)崂山野生大豆子代处理繁殖更新

将亲代各个处理繁殖更新所收获的子代种子次年原地进行繁殖更新。子代处理的繁殖更新程序与其亲代大体一致，但不需要经过种子老化。参考农作物种子检验规程GB/T3543.4中的标准条件，将各个子代处理，即处理g_f1-ck₂、g_f1-i₂、g_f1-ii₂和g_f1-iii₂进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数(表2)。

表2崂山野生大豆发芽数据统计(方法二)

本发明中利用方法一与方法二进行繁殖更新的不同生活力亲代处理是同一批材料，因此生活力检测数据是一致的。

(3)利用形态标记对经过两种方法繁殖更新的崂山野生大豆进行遗传完整性分析

本发明所统计形态标记性状如前所述共11个，包括：花色、粒色、粒形、脐色、茸毛色、荚色、结荚习性、株高、单株粒数、单株荚数和每荚粒数。按照方法一和方法二给出的程序进行形态性状调查，方法一和方法二每个处理的样本量均为30个单株；样本量为30在统计学中算作大样本，两组采用同样的样本量，可以有效地消除系统误差，使数据更加准确可靠。方法一是按照编号调查且亲代处理与其子代处理调查的单株是一一对应关系，方法二则是随机调查，亲代处理与其子代处理没有一一对应关系。

形态性状多样性的计算采用Shannon-Weaver信息指数，即H’＝-∑PilnPi，Pi为某性状第i个代码值出现的概率。质量性状如花色、粒色和粒形等予以赋值(表3)。将数量性状如株高、单株粒数、单株荚数和每荚粒数进行10级分类，1级<X-2δ，10级≥X+2δ，中间每级间差0.5δ，X为平均值，δ为标准差。11个形态性状数据按不同的变异类型分别转换成AA、BB和CC等字母格式，利用生物统计软件Popgene等计算不同形态性状变异的Shannon-Weaver指数。然后利用SAS V9.1将两种方法繁殖更新的各个亲代处理的Shannon-Weaver指数与各自对照进行显著性t检验(表4)。

表3崂山野生大豆形态性状鉴定项目及标准

表4经过两种方法繁殖更新的崂山野生大豆Shannon-Weaver指数t检验

注：^*表示5％水平上显著差异；^**表示1％水平上显著差异

结果显示，方法一繁殖更新的亲代处理中，发芽率为79.0％的处理g_p-i₁，其Shannon-Weaver指数与对照g_p-ck₁相比差异不显著，发芽率58.0％和27.0％的处理g_p-ii₁和g_p-iii₁，其Shannon-Weaver指数与对照g_p-ck₁相比差异显著或极显著。这表明，较高生活力的处理(发芽率≥79.0％)与对照相比，其遗传完整性得到了较好的保持，而较低生活力的处理(发芽率≤58.0％)与对照相比，其遗传完整性发生了极显著变化。子代中各个处理(包括g_f1-ck₁、g_f1-i₁、g_f1-ii₁和g_f1-iii₁)的发芽率均为90.0％左右，其Shannon-Weaver指数与对照相比差异均不显著，特别是处理g_f1-ck₁与对照g_p-ck₁相比几乎没有任何差异，表明高生活力的子代群体，与对照相比其遗传完整性得到了较好的保持。这说明形态多样性与生活力密切相关，原因是形态多样性主要是数量性状造成的，而质量形状的差异很小，高生活力子代群体的数量性状与对照群体的差异较小，而低生活力子代群体的数量性状与对照群体的差异较大。

方法二繁殖更新的亲代处理中，发芽率同为79.0％的处理g_p-i₂，其Shannon-Weaver指数与对照g_p-ck₂相比差异显著，发芽率58.0％和30.0％的处理G_P-II₂和G_P-III₂，其Shannon-Weaver指数与对照G_P-CK₂相比差异极显著。这表明由于繁殖方法不当较高生活力的亲代处理(发芽率≥79.0％)与对照相比，其遗传完整性就发生了显著变化，而较低生活力的处理(发芽率≤58.0％)与对照相比，其遗传完整性发生了极显著变化。子代中处理g_f1-ck₂的发芽率为88.0％，与对照g_p-ck₂相比差异不显著，但t值和概率值显示，与方法一相比，经过方法二繁殖更新的子代处理，虽然其亲代生活力很高，为91.0％，但是其子代仍然发生了形态多样性变化；处理g_f1-i₂的发芽率为86.0％，与方法一相比，其发芽率有所下降，而Shannon-Weaver指数与对照g_p-ck₂相比，处理g_f1-i₂差异虽不显著，但其概率值已接近0.05，其差异水平快要达到显著水平；处理g_f1-ii₂和g_f1-iii₂的发芽率为85.0％和84.0％，其Shannon-Weaver指数与对照g_p-ck₂相比差异显著，表明其遗传完整性就发生了显著变化。

以上数据表明，由于繁殖方法不当，较高生活力的子代处理(发芽率≥84.0％)，其遗传完整性也发生了显著变化。推其原因：首先，亲代处理中由于种子活力下降而导致田间成苗率下降，造成种植密度不一致，一些单株长得过于高大，其形态性状，特别是数量性状发生较大变化；其次，由于活力较差，田间成苗率大幅下降，亲代传递给子代的遗传多样性降低，出现所谓的“奠基者效应”，导致子代的遗传完整性发生显著变化。说明本发明繁殖更新方法较常规方法更适合用于遗传完整性分析。

(4)利用SSR分子标记对经过两种方法繁殖更新的崂山野生大豆进行遗传完整性分析

①分析样本：

a、方法一：不同生活力亲代处理及其子代处理在田间繁殖更新期间，选取96个单株(包括形态性状调查的30个单株)，采集幼嫩叶片，-80℃下保存备用。子代采集叶片的单株与其亲代也是一一对应关系。

b、方法二：不同生活力亲代处理及其子代处理在田间繁殖更新期间，随机选取96个单株(不一定包括形态性状调查的30个单株)，采集幼嫩叶片，-80℃下保存备用。子代采集叶片的单株与其亲代不存在一一对应关系。

②基因组DNA提取：采用SDS法单株提取上述两种方法繁殖更新的亲代及子代各个处理的基因组DNA。

③SSR引物扩增及聚丙烯酰氨凝胶检测：采用40对SSR核心引物(选取自王栋等，SSR标记分析种子老化及繁殖世代对大豆种质遗传完整性的影响，植物遗传资源学报2010,11(2)：192-199。每个连锁群上分布两个位点，如表5所示)，对上述两种方法繁殖更新的上述两种方法繁殖更新的亲代及其子代各个处理基因组DNA进行PCR扩增，采用6％聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，功率75W，时间为50min，电泳结束后采用常规银染法检测。

表5崂山野生大豆遗传完整性分析40对SSR核心引物

a、PCR扩增反应体系为：Premix Taq^TM(TaKaRa Taq^TM Version2.0)10.0μL，5.0μmol/LPrimer pairs(1.0+1.0)μL，20.0ng/μL DNA 5.0μL，ddH₂O 3.0μL，总体系为20.0μL。

b、PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；95℃变性45s，47℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。温度降至4℃时取出，4℃冰箱内保存备用。

⑦结果统计及分析：根据检测结果，利用POPGENE version 1.31和PowermarkerV3.25等软件对崂山野生大豆经过上述两种方法繁殖更新的亲代及其子代各个处理进行遗传结构分析，计算出各个处理的各位点等位基因频率、每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数，并利用SAS 9.1对各处理群体与对照群体之间的各位点等位基因频率进行χ²检验，对每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数进行显著性t检验。

a、等位基因频率差异分析

表6崂山野生大豆处理间等位基因频率差异分析(方法一)

从表6可以看出，方法一繁殖更新的亲代处理g_p-i₁、g_p-ii₁和g_p-iii₁与对照g_p-ck₁的等位基因频率显著差异和极显著差异的位点个数以及占总位点个数百分比，随着生活力的下降而增加，其中发芽率为27.0％的处理g_p-iii₁的显著和极显著差异位点个数最多，分别为9个和6个，占总位点的个数的百分比分别为22.50％和15.00％，发芽率为58.0％的处理g_p-ii₁次之，分别为6和4个，占总位点的个数的百分比分别为15.00％和10.00％，发芽率为83.0％的处理g_p-i₁最少，分别为1个和0个，占总位点的个数的百分比分别为2.50％和0，这表明生活力下降显著地影响了野生大豆种质材料群体内的等位基因频率分布。由对照g_p-ck₁繁殖的处理g_f1-ck₁与对照g_p-ck₁相比，无显著差异位点，由处理g_p-i₁繁殖的处理g_f1-i₁与对照g_p-ck₁相比，显著或极显著差异的位点个数与处理g_p-i₁持平，同为为1个和0个，占总位点的个数的百分比分别为2.50％和0，这表明发芽率为91.0％和79.0％的野生大豆经过方法一繁殖更新后，各位点的等位基因频率与对照相比几乎没有差异。由处理g_p-ii₁和g_p-iii₁繁殖的处理g_f1-ii₁和g_f1-iii₁，这2个处理与对照g_p-ck₁显著或极显著差异的位点个数较多，分别为7个和4个，10个和7个，占总位点的个数的百分比分别为17.50％和10.00％，25.00％和17.50％，且子代处理比相应亲代处理的显著或极显著差异位点数要高，表明发芽率为58.0％和27.0％的野生大豆种质材料子代处理各位点的等位基因频率与对照相比差异显著，且生活力水平愈低差异愈大。方法一结果表明，生活力下降对崂山野生大豆的等位基因频率分布影响甚大。

表7崂山野生大豆处理间等位基因频率差异分析(方法二)

从表7可以看出，与方法一相比，方法二繁殖更新的各个处理与对照g_p-ck₂的等位基因频率显著差异和极显著差异的位点个数以及占总位点个数百分比普遍增加。亲代处理g_p-i₂、g_p-ii₂和g_p-iii₂与对照g_p-ck₂的显著和极显著差异位点个数，同样也随着生活力的下降而增加，与方法一不同的是，发芽率为79.0％的处理g_p-i₂的显著和极显著差异位点个数分别为5个和3个，占总位点的个数的百分比分别为12.50％和7.50％，而方法一相应的显著和极显著差异位点个数为1个和0个，占总位点的个数的百分比分别为2.50％和0，表明经过方法二繁殖更新的较高生活力群体内的等位基因频率分布发生了显著变化。发芽率为58.0％和27.0％的处理g_p-ii₂和g_p-iii₂与对照g_p-ck₂相比，其显著和极显著差异位点个数分别为10个和6个，14个和10个，占总位点的个数的百分比分别为25.00％和20.00％，35.00％和25.00％，都明显高于方法一相对应的数据。方法二繁殖更新的处理g_f1-ck₂与对照相比，其显著和极显著差异位点个数分别为5个和4个，占总位点的个数的百分比分别为12.50％和10.00％，而方法一相应的显著和极显著差异位点个数分别为0个，占总位点的个数的百分比也是0，这表明发芽率为91.0％的处理经过方法二繁殖更新后，其等位基因频率分布与对照相比也产生了显著差异。由处理g_p-i₂、g_p-ii₂和g_p-iii₂繁殖的处理g_f1-i₂、g_f1-ii₂和g_f1-iii₂，这3个处理与对照g_p-ck₂显著或极显著差异的位点个数较多，分别为8个和6个，11个和9个以及15个和11个，占总位点的个数的百分比分别为20.00％和15.00％，27.50％和22.50％以及40.00％和27.50％，与方法一的相应数据相比，都明显高出甚多。以上数据说明方法二繁殖更新的各个处理(包括高生活力处理)的等位基因频率分布与对照之间的差异明显高于方法一。

b、群体遗传结构分析

表8崂山野生大豆群体遗传结构(方法一)

注：^*表示5％水平上显著差异；^**表示1％水平上显著差异

从表8中可以看出，亲代处理g_p-i₁、g_p-ii₁、g_p-iii₁及其子代处理g_f1-i₁、g_f1-ii₁和g_f1-iii₁，其各项遗传多样性参数均低于对照g_p-ck₁，而且随老化时间的延长，生活力水平愈低，其各项遗传多样性参数也愈低。t检验结果显示，由对照g_p-ck₁繁殖的处理g_f1-ck₁，其各项遗传多样性参数与对照g_p-ck₁相比几乎没有差异，表明发芽率为91.0％的处理经过方法一繁殖更新后，其群体遗传结构得到了较好的保持。处理g_p-i₁的A、H和I等3项遗传多样性参数与对照相比无显著差异，而其子代处理g_f1-i₁的各项遗传多样性参数与对照相比虽有所下降但没有达到显著差异水平。处理g_p-ii₁和g_p-iii₁的A、H和I等3项遗传多样性参数与对照g_p-ck₁相比差异显著或极显著，其子代处理g_f1-ii₁和g_f1-iii₁的A、H和I等3个遗传多样性参数与对照相比差异极显著，表明更新发芽率分别为58.0％和27.0％的处理因生活力水平下降，其自身及子代群体内的遗传多样性低于对照处理遗传多样性。方法一结果表明，生活力下降对崂山野生大豆的群体遗传结构影响显著。

表9崂山野生大豆群体遗传结构(方法二)

注：*表示5％水平上显著差异；**表示1％水平上显著差异

从表9中可以看出，与方法一相比，方法二繁殖更新的各个处理包括对照的各项遗传多样性参数均有所下降。亲代处理g_p-i₂、g_p-ii₂、g_p-iii₂及子代处理g_f1-ck₂、g_f1-i₂、g_f1-ii₂和g_f1-iii₂，其各项遗传多样性参数均低于对照g_p-ck₂，而且生活力水平愈低，其各项遗传多样性参数也愈低。t检验结果显示，与方法一相比，由对照g_p-ck₂繁殖的处理g_f1-ck₂，其各项遗传多样性参数与对照g_p-ck₂相比差异虽未达到显著水平，但下降的较多，表明发芽率为91.0％的处理经过方法二繁殖更新后，其群体遗传结构有所改变，但未达到显著水平。处理g_p-i₂及其子代处理g_f1-i₂的A、H和I等3项遗传多样性参数与对照g_p-ck₂相比差异显著，这点与方法一不同，表明发芽率为83.0％的处理经过方法二繁殖更新后，其群体遗传结构发生了显著变化。处理g_p-ii₂和g_p-iii₂及其子代处理g_f1-ii₂和g_f1-iii₂的A、H和I等3项遗传多样性参数与对照g_p-ck₂相比差异极显著，表明更新发芽率分别为58.0％和27.0％的处理因生活力水平下降，其自身及子代群体内的遗传多样性低于对照的遗传多样性，这方面两种方法是一致的。以上结果表明，方法二繁殖更新的各个处理(包括高生活力处理)的群体遗传结构与对照之间的差异明显高于方法一，其群体内的遗传多样性降低较多。

综合崂山野生大豆形态标记分析和SSR标记分析的实验结果可得出以下结论：方法一繁殖更新的野生大豆种质材料，当更新发芽率高于79.0％时，亲代及其子代在形态性状水平及DNA分子水平上，其遗传完整性都得到了较好的保持；更新发芽率低于58.0％时，亲代及其子代在DNA分子水平上的遗传完整性明显改变。以此推荐其更新发芽率最低不得低于58.0％。方法二繁殖更新的大豆种质材料，即使更新发芽率为79.0％时，亲代及其子代在形态性状水平及DNA分子水平上，其遗传完整性都发生了显著变化，且得出的群体内遗传多样性低于方法一。因此，方法一较方法二更有利于大豆遗传完整性的保持，建议采用方法一，即本发明提供方法对野生大豆种质遗传完整性分析时进行繁殖更新。

实施例二野生大豆破除硬实方法比较

(一)试验材料与方法

1、试验材料

试验材料为成熟的一年生野生大豆种子，2014年采集自青岛市崂山区，即崂山野生大豆。

2、方法

(1)种子水分和千粒重测定

参照农作物种子检验规程GB/T3543.4进行。

(2)种子硬实率测定

随机取100粒×2野生大豆种子在室温下清水浸种24h，统计未吸胀种子的粒数，计算硬实率。

(3)破除硬实的方法

①本发明方法：按以下比例：壳梭孢菌素6～7mg/L、柠檬草水提取物20～30mg/L，用35～50℃的温水配制成溶液。将野生大豆投入该溶液中浸泡并超声波处理10～15分钟。超声波处理结束后取出种子晾干。

②对比方法

参考《合肥地区野生大豆硬实破除方法的研究》(陈辉等，种子，第2008年02期，29-32.)中所采用的方法。

a、低温冷胀处理：取适量种子于冰箱内(-6～-10℃)进行冷冻处理3天，取出恢复至室温。

b、高温水浴处理:取适量种子95℃水浴2min，取出冷却至室温。

c、浓硫酸腐蚀处理：取适量种子放入98％浓硫酸中处理50分钟，处理后用清水反复冲洗。

d、砂纸打磨+高锰酸钾(5×10^-6)：用砂纸将种子表明打磨2min，放入高锰酸钾(浓度为5×10^-6)浸泡消毒1min。

以未处理种子做为对照。

(二)结果与分析

1、供试种子水分、千粒重和硬实率

供试种子水分、千粒重和硬实率测定结果分别为8.7％，16.7g和95.8％。

2、各种方法破除硬实效果对比

进行幼苗生长测定：参照农作物种子检验规程GB/T3543.4进行纸床发芽试验，每重复50粒净种子，4次重复。智能人工气候箱中培养(20～30℃，光照8h/d)，调查种子发芽数、发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、根伤害率等(表10)。

表10不同破除硬实方法比较

由表10可以看出，本发明方法破除硬实效果最好：种子具有很高的发芽势，发芽率也达到了91.31％，发芽指数和活力指数很高，且不会对根造成任何伤害。

由于野生大豆种子硬实程度较高，在进行相关研究之前需要先破除硬实。目前通常采用机械摩擦、加温和酸处理等方法，以损坏种皮，增加种皮的透气和透水能力，打破休眠和促进发芽。本发明综合比较了本发明方法和低温冷胀处理、高温水浴处理、浓硫酸腐蚀处理、砂纸打磨+高锰酸钾处理，发现低温冷胀处理耗时较长，效果也最差；高温水浴处理发芽率和发芽势也不高，且处理时间也不宜过长；浓硫酸酸蚀处理对破除硬实效果最明显，然而对根的伤害较大。前人研究也表明，随着酸蚀时间的增长，根损害率显著增加。砂纸打磨+高锰酸钾复合处理，由于经过机械损伤，会对野生大豆种子的胚造成一定的影响，化学试剂也对机械损伤的种子有一点的毒害作用，根损害率比较高。而本发明方法可以克服上述方法存在的问题，一方面可以有效的破除硬实，发芽势和发芽率仅次于浓硫酸处理的，而且对根无伤害。其原理推测可能是由于壳梭菌素具有类似赤霉素的作用，可以有效打破种子休眠，而柠檬草水提取物其成分复杂，推测其可能是在超声时有利于破坏种皮外面的不透水层或果胶质，增强种皮透气透水能力。由此可见，本发明破除硬实方法，破除硬实效果显著，保证了种子发芽一致，出苗整齐，且不会对根造成伤害。

Claims (1)

1.一种用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法，其特征是，包括亲代繁殖更新和子代繁殖更新；

所述亲代繁殖更新：将亲代种子经过人工老化处理后进行生活力检测，按照发芽率分组，选取不同发芽率梯度的亲代处理；各处理种子破除硬实后进行育苗，然后移栽至大田中；单株收获；

所述子代繁殖更新：将各个子代处理，按照与亲代处理同样的步骤进行育苗、移栽、形态性状调查、单株收获；

所述子代单株与其亲代是一一对应关系，即子代的各个处理每个单株的编号与其亲代单株是一一对应的；

所述破除硬实的方法是，按以下比例：壳梭孢菌素6～7mg/L、柠檬草水提取物20～30mg/L，用35～50℃的温水配制成溶液；把野生大豆投入该溶液中浸泡并超声波处理10～15分钟；超声波处理结束后取出种子晾干即可；

所述用于野生大豆遗传完整性分析的繁殖更新方法步骤如下：

(一)亲代繁殖更新

(1)繁殖地点选择

选择种质原产地或与原产地生态环境条件相似地区的地势平坦、地力均匀、形状规则、排灌方便且最少两年未种植野生大豆的田块；

(2)种子老化及生活力检测

①种子人工老化：将野生大豆种子，破除硬实后，进行人工老化；

②生活力检测：将经过不同老化时间处理的野生大豆种子，破除硬实后，进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数；

(3)育苗及移栽

①破除硬实；

②制备育苗培养基质：将砂壤土、草炭土、蛭石和珍珠岩按照体积比为4：3：2：1比例混合，加入复合肥(N：P₂O₅：K₂O＝15：15：15)，比例为每kg基质加入5g复合肥，加入破除硬实步骤中超声结束后剩余的溶液，和适量的水搅拌混匀后，制得育苗培养基质；

③播种定盘：将种子播种于育苗盘内；

④温室育苗：将步骤②中的育苗盘放入温室中，其上覆盖地膜保湿，温度控制在24.5～25.5℃，相对湿度为74.5～75.5％，种子出苗后将地膜掀掉；待幼苗长至三叶期后即可进行移栽；

⑤移栽大田：亩施农家肥1000～2000kg，磷酸二铵15kg；野生大豆每个处理田间定植100株，行距为50cm，株距为30cm，挖移栽穴，深10cm，将育苗盘中的幼苗移栽到大田中，及时填土浇水；

(4)田间管理

①搭架：待幼苗长至20cm高时，用竹竿进行搭架；

②挂牌编号：待幼苗长至50cm高时，将定植于大田中每个处理的植株进行单株挂牌编号；

③栽培措施：常规管理即可；

(5)形态性状调查及去杂

繁殖更新期间，从每个处理中按照编号选出30个单株，对其进行11个形态性状调查；并去除杂株；

(6)收获、脱粒、干燥和保存

每个处理按照编号进行单株收获，脱粒，干燥至种子含水量8.0％以下，清选后保存；

(二)子代繁殖更新

(1)繁殖地点选择：次年原地进行繁殖更新；子代处理的繁殖的试验地及配套条件与其亲代一致；

(2)生活力检测：破除硬实后，进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数；

(3)育苗及移栽：为保证与亲代各个处理的生长环境条件及种植密度一致，对子代处理进行育苗及移栽；破除硬实、制备培养基质、播种定盘、温室育苗和移栽大田过程与亲代一致；子代各个处理在育苗时，每格播种的种子是其亲代处理每个单株收获的种子，即育苗时每格长出的幼苗编号与其亲代单株是一一对应关系；

(4)田间管理：子代各个处理田间管理过程与其亲代一致；

(5)形态性状调查及去杂：子代各个处理调查的形态性状与亲代完全一致；子代各个处理调查的每个单株与其亲代的每个单株也是一一对应关系，同样也是调查30个单株；去杂过程与亲代一致；

(6)收获、脱粒、干燥和保存：子代处理的收获、脱粒、干燥和保存程序与其亲代一致。

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