CN106353207A - 一种水稻脆性的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水稻脆性的定量检测方法。本发明的原理是通过选择适当生育期的各脆性待检测材料，进行预处理后，选择特定的水稻器官和部位、采用特定的鉴定技术进行检测，根据各脆性待检测材料多重复的检测均值作为量化评价该水稻脆性水平的数值指标。利用本方法评价水稻脆性表型，既可以解决脆性多基因突变体基因定位和脆性基因聚合育种中脆性表型差异度甄别方法的难题，又可以节约分子检测的劳动力和成本，实现了水稻脆性表型差异度显著而又准确的定量检测。

Description

一种水稻脆性的定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种水稻脆性的定量检测方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

众所周知，茎秆强度是植物机械强度的外在直接体现者，而茎秆性状则是影响水稻产量和品质的重要因素，也是筛选抗倒伏水稻品种的主要考察性状。脆茎突变是指植物茎秆脆性增加，通常是根、茎、叶、茎节等器官呈现脆性增加、易折的表型，是植物中一类比较常见的突变类型，该突变在水稻、拟南芥、玉米和大麦等植物中均有报道过。与野生型相比，脆性突变体普遍具有纤维素含量降低、木质素含量增加、细胞壁结构组成改变等显著特点，有利于选育“粮-饲”兼用稻，即既可以收获粮食，又能将稻秆作为饲料资源用于畜牧养殖，还能减少稻秆焚烧造成的环境污染。

而近几年来，随着农村经济的发展、技术进步以及农民生活条件的改善，曾经被农民广泛用作燃料、饲料和肥料的水稻秸秆失去了往日的利用优势，大量水稻秸秆被焚烧，这不仅造成严重的环境污染，还能直接烧死、烫死土壤中的有益微生物，影响农作物对土壤养分的充分吸收，破坏土壤的结构，造成耕地质量的下降。目前，已有部分地区开展水稻秸秆还田试验，但普通水稻秸秆柔韧，机械难以粉碎，机收后如果不加处理，秸秆长期不腐解，秸秆还田效果较差。另外一方面，现有水稻良种茎秆的细胞壁结构非常致密、秸秆品质差、营养成分含量低，而稻草的前处理操作复杂、成本高且效果不佳，限制了其在畜牧生产上的应用，使得水稻秸秆被农民朋友也将之看成一大障碍，与传统水稻相比，脆茎水稻品种最主要特点是茎秆机械强度低，秸秆细胞壁厚度和纤维素含量下降，同时半纤维素、木质素含量上升，营养价值提高，并且适口性好。因此，脆茎水稻品种不仅容易被粉碎，而且还可以作为动物饲料直接进行回收利用。中科院合肥物质研究院对离子束诱变获得的脆性突变体开展了田间生产试验，结果发现其具有生长能力强、脆而抗倒的特点，秸秆易粉碎，适宜家畜饲用，并且产量增加5%左右。中国水稻研究所采用辐射诱变技术获得1株水稻脆秆突变体fp1，培育出粗纤维含量比较低的常规水稻品系嫩稻1号，粗蛋白质含量提高了60%，粗脂肪含量增加了一倍，可取代一定数量的玉米干粉用于育肥阶段瘦弱猪的饲料混配。汪海峰等将脆茎水稻全株应用到生长肥育猪口粮的试验中，结果显示脆茎水稻饲料降低了猪体内的脂肪沉积，从而能提高胴体瘦肉率，使得胴体长度增加。福建农林大学通过常规育种的方法，选育出稻谷产量较高、至成熟期茎叶仍能保持绿色、稻草蛋白质含量显著提高的谷秆两用稻东南201、202，用于猪、鱼等的饲养试验，取得了极佳的效果。

水稻脆性性状的研究，对于粮食产量安全、分子育种及饲料新能源等应用都意义重大。近年来，许多水稻脆性突变体材料的发现，目前报道的与水稻脆性性状相关的基因主要有BC1-8、BC10-12、BC14-15等，大部分都已得到精细定位。其中BC7、BC11位于第1染色体，BC3、BC5、BC14位于第2染色体，BC1位于第3染色体，BC2、BCIO位于第5染色体，BC4位于第6染色体，BC8位于第7染色体，BC6、BC12、BC15位于第9染色体。脆茎突变基因的定位和克隆为研究水稻次生细胞壁形成的分子机理、结构组成和植株机械强度的调控途径等发挥了重要作用。研究者对大量水稻脆性性状形成的分子机理、基因定位与克隆、脆性基因的遗传分析等方面进行了深入研究，取得了一些显著的进展。研究发现，脆茎突变水稻的茎秆及其他组织器官主要由于细胞壁脆性改变。植物细胞壁的结构和成分与茎秆的机械强度直接相关，脆茎突变植物细胞壁厚度减小、纤维素含量降低是导致其脆性增加的最直接的原因。研究发现，脆茎突变体水稻的粗纤维含量显著低于野生型水稻。扫描电镜观察发现，脆茎突变体水稻的维管束内纤维细胞细胞壁比野生型对照薄，表皮细胞外的硅质也显著减少；对比不同生长时期、不同组织器官的脆性，脆茎水稻在不同生长时期、不同组织器官其脆性均有显著的存在。正是由于水稻脆性性状具有广阔的市场价值和生态价值，脆性性状己引起研究者的重视，进行了一系列脆性基因功能与分子调控机理研究并取得了显著的进展。水稻脆性性状相关基因BC1、BC3、BC6、BC7、BCIO-12、BC14、BC15等的功能均已得到明确解析，分子机理研究表明水稻脆性基因大多数通过编码各种代谢酶类，尤其是纤维素代谢酶类来发挥调节作用的，但错综复杂的调控途径还需深入解析。

然而，虽然水稻脆性性状的研究，与粮食产量安全、稻米品质改良、分子育种、开发饲料新能源等方面都意义重大，但迄今为止，还没有出现大面积推广的脆茎水稻品种，其主要原因还是水稻脆性基因是数量性状遗传控制的，各脆性突变体虽然表现显著，但大都是单基因突变，单基因脆性突变体的表现型也各不相同。比如水稻脆性突变材料的饲用，虽然营养价值、牲畜适口性均提高，机械加工性能增强，抵抗反刍动物消化的硅质层破碎效果得到改良，但是目前的各脆性突变体水稻秸秆还不能完全作为青储饲料，也不能全部采用脆性水稻秸秆作为牲畜饲料。因此，虽然脆性水稻饲用的研究表明其巨大的产业潜值，但是还要继续加大脆茎性状的基因定位开发和数量性状的聚合，进一步增强脆性水稻饲用性能、机械粉碎性能，才能真正发挥其广阔的市场价值和生态价值。

虽然脆茎水稻的性状很容易和其他常规水稻品种进行定性区别，只要用手掰折茎秆或叶片，就能直观判断，但是脆性程度却无法定量统计，这给多基因脆性突变体的基因定位和脆性基因的多基因聚合育种过程中带来了困扰。脆性数量基因聚合育种中尤其需要鉴别脆性水稻的表型差异度，以确定脆性基因聚合程度。脆性表型定量检测方法的建立将给脆性基因聚合育种带来极大的便利和辅助，同时也大大减少分子检测劳动力和费用，节约成本。

利用本方法定量评价水稻脆性突变体的脆性表型，既可以解决脆性多基因突变体基因定位和脆性基因聚合育种中脆性表型差异度甄别方法的难题，又可以节约分子检测的劳动力和成本，实现了水稻脆性表型的定量检测。这一鉴定方法除了可以应用于水稻脆性表型评价、脆性特种水稻育种外，亦可以应用于脆性基因定位的表型鉴定和脆性基因遗传规律研究等众多领域。

发明内容

本发明的目的是针对脆性水稻多基因突变体的基因定位和多基因聚合育种中数量性状的甄别仅有常规的定性鉴定而缺乏定量检测方法，提供一种水稻脆性的定量检测方法，该定量检测方法通过鉴别脆性材料与普通品种差异度的最显著的检测器官、部位和检测时期，通过特定的前处理手段和检测方法，最终通过具体的数值指标实现了对脆性水稻材料的表型差异度进行显著而又准确的定量评价。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种水稻脆性的定量检测方法，其特征在于：通过选择适当生育期的各脆性待检测材料，进行预处理后，选择特定的水稻器官和部位、采用特定的鉴定技术进行检测，根据各脆性待检测材料多重复的检测均值作为量化评价该水稻脆性水平的数值指标。

所述的适当生育期的各脆性待检测材料为水稻抽穗期的脆性待检测材料，其具体获取方法为：

2.1）水稻单株第一穗穗尖露出叶鞘1cm记为该单株抽穗，待该脆性待检测材料大田抽穗单株的比例为30%-60%时，选择抽穗单株比例与大田长势相近的健壮植株，从根部整株挖取，洗净根部泥土，晾干后冷藏于-20℃冰箱中，不同抽穗期的水稻材料依次取材，分类标记冷藏；

2.2）待抽穗期最迟的脆性待检测材料取材冷藏一天后，同时取出各份材料，室温自然解冻，去除每株第一穗穗尖露出叶鞘长度不足1cm的分蘖，即为水稻抽穗期的脆性待检测材料。

所述的预处理方法为：剥除包裹水稻茎秆的稻叶，获得裸露的水稻茎秆。

所述的特定的水稻器官为剥叶后裸露的水稻茎秆；所述的特定的部位为茎秆根基部以上第一节间中间位置。

所述的特定的鉴定技术为：采用穿刺仪器在各脆性待检测材料的茎秆上进行同位置穿刺，并记录每次穿刺刺穿瞬间的压强值。

所述的穿刺仪器采用杭州托普仪器有限公司生产的YYD-1A型便携式植物抗倒伏测定仪。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种水稻脆性的定量检测方法，该定量检测鉴定方法的步骤如下：

（1）选择水稻抽穗期的脆性待检测材料，具体获取方法为：1.1）水稻单株第一穗穗尖露出叶鞘1cm记为该单株抽穗，待该脆性待检测材料大田抽穗单株的比例为30%-60%时，选择抽穗单株比例与大田长势相近的健壮植株，从根部整株挖取，洗净根部泥土，晾干后冷藏于-20℃冰箱中，不同抽穗期的水稻材料依次取材，分类标记冷藏；1.2）待抽穗期最迟的脆性待检测材料取材冷藏一天后，同时取出各份材料，室温自然解冻，去除每株第一穗穗尖露出叶鞘长度不足1cm的分蘖，即为水稻抽穗期的脆性待检测材料。（2）剥除包裹水稻茎秆的稻叶，获得裸露的水稻茎秆。（3）采用杭州托普仪器有限公司生产的YYD-1A型便携式植物抗倒伏测定仪，在各脆性待检测材料的剥叶后裸露的水稻茎秆的根基部以上第一节间中间位置茎秆上进行同位置穿刺，并记录每次穿刺刺穿瞬间的压强值。（4）取各脆性待检测材料多重复穿刺实验的压强值的平均值作为量化评价该水稻脆性水平的数值指标。

该定量检测方法通过鉴别脆性材料与普通品种差异度的最显著的检测器官、部位和检测时期，通过特定的前处理手段和检测方法，最终通过具体的数值指标实现了对脆性水稻材料的表型差异度进行显著而又准确的定量评价。

下面通过具体实施例来进一步说明本发明提供的水稻脆性的定量检测方法。

实施例一 新鲜冷藏的抽穗期脆茎突变体材料与常规水稻品种穿刺实验与压折实验的对比

分别取新鲜冷藏的抽穗期脆茎突变体材料与常规水稻品种镇稻88、连粳7号，分别进行了剥叶穿刺、非剥叶穿刺与压折实验，实验仪器采用浙江托普仪器公司的YYD-1A型植物抗倒伏仪测量数据。实验方法和结果分别如下：

穿刺实验：分别取新鲜冷藏的抽穗期脆茎突变体材料与常规水稻品种镇稻88、连粳7号进行非剥叶穿刺实验、剥叶穿刺实验，穿刺的具体位置限定为茎秆上邻近根基部的第一茎间中间位置，选择10根不同分蘖的新鲜茎秆进行同位置穿刺，记录每次穿刺时该脆茎突变体材料刺穿瞬间的压强值，单位为kPa；

压折实验：分别取新鲜冷藏的抽穗期的新鲜的脆茎突变体材料与常规水稻品种镇稻88、连粳7号，选择邻近根基部的第一茎节起向上15cm长的茎段，将该茎段的两端在一定高度架空，植物抗倒伏测定仪从茎段中间从上而下缓缓压折，记录折断瞬间的受力值，单位为N；选择10根不同分蘖的新鲜冷藏茎秆进行10次重复压折实验。

从压折实验可知，脆茎材料压折瞬间受力为64.2N，而常规主栽品种镇稻88、连粳7号压折瞬间受力为79.0N和81.7N，这表明脆茎突变体材料抗压能力要比对照品种镇稻88、连粳7号略低，这反映了脆茎材料比常规品种抗倒伏能力有所下降，但是下降不是非常明显，常规品种连粳7号抗倒伏能力高于镇稻88。

分别取新鲜冷藏的抽穗期材料进行穿刺实验，结果可知，脆茎材料未剥叶刺穿瞬间压强值为122.9kPa，而常规主栽品种镇稻88、连粳7号刺穿瞬间压强值分别为166.5 kPa和169.6 kPa，表明脆茎突变体材料茎秆的硬度比对照品种镇稻88、连粳7号显著降低。计算压折实验和未剥叶穿刺实验中脆茎材料和常规品种测量数值差异度，压折实验中，脆茎/镇稻88=64.2/79.0=0.81，脆茎/连粳7号=64.2/81.7=0.79；而茎秆未剥叶穿刺实验中，脆茎/镇稻88=122.9/166.5=0.74，脆茎/连粳7号=122.9/169.6=0.72。由此可以发现，采用未剥叶穿刺实验进行测量，脆茎材料与常规品种间的对比更加显著，更有利于脆茎突变体材料定量检测。

通过进一步的剥叶穿刺实验发现，剥离茎秆外包稻叶后对茎秆的穿刺，脆茎/镇稻88=61.3/105.9=0.58，脆茎/连粳7号=61.3/109.5=0.56，剥叶穿刺实验中脆茎材料与常规品种间的对比更加显著，所以采用剥叶穿刺实验更有利于脆茎突变体材料的定量检测。

另外分析剥叶穿刺与未剥叶穿刺的标准差发现，剥叶穿刺的标准差较未剥叶穿刺的标准差显著降低，表明脆茎与常规品种茎秆的硬度比较稳定，所以采用剥叶穿刺实验更有利于脆茎突变体材料定量检测。

实施例二 新鲜冷藏的抽穗期脆茎突变体材料与常规水稻品种剑叶穿刺与剥叶茎秆穿刺的对比

分别取新鲜冷藏的抽穗期脆茎突变体材料与常规水稻品种镇稻88、连粳7号，分别进行了同位置剑叶穿刺和剥叶茎秆穿刺实验，实验方案参照实施例一种的穿刺实验方案，实验结果如下表2所示。

计算剑叶穿刺和剥叶穿刺实验中脆茎材料和常规品种测量数值差异度的结果发现，采用剑叶穿刺，脆茎材料/镇稻88=11.5/14.0=0.82，脆茎/连粳7号=11.5/14.7=0.78；而剥叶穿刺，脆茎/镇稻88=0.53，脆茎/连粳7号=0.51，所以采用剥叶穿刺实验比剑叶穿刺更有利于脆茎突变体材料的定量检测。

实施例三 不同时期新鲜冷藏的脆茎突变体材料与常规水稻品种剥叶茎秆穿刺的对比

分别取新鲜冷藏的分蘖期、抽穗期、完熟期的脆茎突变体材料与常规水稻品种镇稻88、连粳7号进行同位置剥叶茎秆穿刺实验，实验方案参照实施例一，实验结果如下表3所示。

通过新鲜冷藏的不同时期脆茎突变体材料与常规水稻品种剥叶茎秆穿刺对比实验发现，分蘖期脆茎材料与常规品种的剥叶茎秆穿刺对比分别为39.8/61.6=0.65和39.8/62.3=0.64；抽穗期脆茎材料与常规品种的剥叶茎秆穿刺对比分别为0.53、0.51；完熟期脆茎材料与常规品种的剥叶茎秆穿刺对比分别为66.9/109.0=0.61和66.9/111.1=0.60。由此可以看出，抽穗期材料进行穿刺实验，脆茎材料与常规品种间的对比更加显著，更有利于脆茎突变体材料的定量检测。

实施例四 新鲜冷藏的完熟期不同节间脆茎突变体材料与常规水稻品种烘干后剥叶茎秆穿刺的对比

分别取新鲜冷藏的完熟期脆茎突变体材料与常规水稻品种镇稻88、连粳7号的第一节间、第二节间、第三节间烘干后进行剥叶茎秆穿刺实验，穿刺的具体位置限定为茎秆上邻近根基部的第一茎节、第二茎节、第三茎节的中间位置，实验仪器采用浙江托普仪器公司的YYD-1A型植物抗倒伏仪测量数据，记录每次穿刺时该脆茎突变体材料刺穿瞬间的压强值，单位为kPa；实验结果如下表4所示。

由表4计算得知，不同节间脆茎突变体与常规品种的对比分别为：第一节间66.0/93.4=0.71，66.0/94.4=0.70；第二节间62.5/82.9=0.75，62.5/84.1=0.74；第三节间61.5/79.2=0.78，61.5/82.5=0.75。对比发现，采用第一节间进行剥叶测量，比采用更上部位剥叶测量，脆茎突变体与常规品种的对比略高，而又由于采用第一节间检测的数值标准差相对后二者小，表明根基部第一节间茎秆硬度比较稳定，更有利于脆茎突变体材料的定量检测。

实施例五 烘干处理与新鲜冷藏脆茎突变体材料与常规品种剥叶茎秆穿刺的对比

如表3中完熟期新鲜稻秆脆茎突变体材料与常规水稻品种剥叶茎秆穿刺中，脆茎材料与常规水稻品种剥叶茎秆穿刺对比分别为0.61和0.60；而如上表4烘干处理完熟期稻秆脆茎突变体材料与常规水稻品种剥叶茎秆穿刺中，脆茎材料与常规水稻品种剥叶茎秆穿刺对比分别为0.71和0.70。由此可以发现，采用新鲜材料进行穿刺实验，脆茎材料与常规品种间的对比更加显著，更有利于脆茎突变体材料的定量检测。

由以上五个实施例可知，本发明所提供的水稻脆性的定量检测方法能够对脆性水稻的表型差异度进行显著而又准确的定量评价。

本发明通过选取抽穗期新鲜冷藏的脆茎突变体材料并剥除包裹茎秆的稻叶进行穿刺试验，穿刺的部位限定后茎秆上邻近根基部的第一茎节中间位置，在不同分蘖的新鲜冷藏茎秆上进行同位置穿刺并记录每次穿刺时刺穿瞬间的压强值，取上述压强值的平均值作为量化评价该水稻脆性水平的数值指标；该鉴定方法用于评价水稻脆性表型，既可以解决脆性多基因突变体基因定位和脆性基因聚合育种中脆性表型差异度甄别方法的难题，又可以节约分子检测的劳动力和成本，实现了水稻脆性表型的定量检测；这一鉴定方法除了可以应用于水稻脆性表型评价、脆性特种水稻育种外，亦可以应用于脆性基因定位的表型鉴定和脆性基因遗传规律研究等众多领域。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (6)

1.一种水稻脆性的定量检测方法，其特征在于：通过选择适当生育期的各脆性待检测材料，进行预处理后，选择特定的水稻器官和部位、采用特定的鉴定技术进行检测，根据各脆性待检测材料多重复的检测均值作为量化评价该水稻脆性水平的数值指标。

2.根据权利要求1所述的水稻脆性的定量检测方法，其特征在于：所述的适当生育期的各脆性待检测材料为水稻抽穗期的脆性待检测材料，其具体获取方法为：

2.1）水稻单株第一穗穗尖露出叶鞘1cm记为该单株抽穗，待该脆性待检测材料大田抽穗单株的比例为30%-60%时，选择抽穗单株比例与大田长势相近的健壮植株，从根部整株挖取，洗净根部泥土，晾干后冷藏于-20℃冰箱中，不同抽穗期的水稻材料依次取材，分类标记冷藏；

2.2）待抽穗期最迟的脆性待检测材料取材冷藏一天后，同时取出各份材料，室温自然解冻，去除每株第一穗穗尖露出叶鞘长度不足1cm的分蘖，即为水稻抽穗期的脆性待检测材料。

3.根据权利要求1所述的水稻脆性的定量检测方法，其特征在于：所述的预处理方法为：剥除包裹水稻茎秆的稻叶，获得裸露的水稻茎秆。

4.根据权利要求1所述的水稻脆性的定量检测方法，其特征在于：所述的特定的水稻器官为剥叶后裸露的水稻茎秆；所述的特定的部位为茎秆根基部以上第一节间中间位置。

5.根据权利要求1所述的水稻脆性的定量检测方法，其特征在于：所述的特定的鉴定技术为：采用穿刺仪器在各脆性待检测材料的茎秆上进行同位置穿刺，并记录每次穿刺刺穿瞬间的压强值。

6.根据权利要求5所述的水稻脆性的定量检测方法，其特征在于：所述的穿刺仪器采用杭州托普仪器有限公司生产的YYD-1A型便携式植物抗倒伏测定仪。