CN106324175B - 一种筛选羟自由基清除剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选羟自由基清除剂的方法，该方法包括：将供试样品溶液点样于薄层板上；将薄层板浸渍于由Fe2+‑显色剂‑络合剂形成的底物溶液中，然后取出在30～45℃下反应5～20分钟；所述的显色剂为羟自由基能使其褪色的试剂；再将薄层板浸渍于H2O2反应溶液中，然后取出在40～55℃下反应20～40分钟；在可见光下观察薄层板的显色情况：出现的在白色背景下为所述显色剂本身颜色的斑点即为羟自由基清除剂。本发明方法具有操作简单、易于实现、灵敏度和专属性高、受试样品的选择范围广、可适用于成分复杂的提取物等优点。

Description

一种筛选羟自由基清除剂的方法
技术领域
本发明涉及一种筛选羟自由基清除剂的方法，属于生化分析技术领域。
背景技术
自由基对生物体的影响具有双重性。一方面，适量的自由基是生物体正常生理功能所必需的，如可以调节某些生理活性物质的代谢；另一方面，高浓度的自由基能够破坏细胞成分，从而引起脑缺血、帕金森氏症、风湿性关节炎、呼吸窘迫综合症、心血管疾病和癌症等疾病(Halliwe ll B.Role of free radicals in the neurodegenerative diseases：therapeutic implications for antioxidant treatment[J].Drugs Aging，2001，18：685－716)。生物体可以通过自身的酶系统如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等清除体内不断产生的自由基，使自由基的产生和清除保持相对平衡。
羟自由基是产生于生物体内的一种具有强氧化能力的自由基，可以发生电子转移、羟基化、夺取氢原子等反应。羟自由基极易氧化各种生物体内的有机物和无机物，所以羟自由基与生物体内很多有害反应有关，例如：与氨基酸和脂类受到损伤破坏、核酸断裂、蛋白质和糖类分解活性氧等有关；同样也与机体的肿瘤、衰老、辐射损伤和细胞吞噬有关；并且与脑缺血、帕金森氏症、风湿性关节炎、呼吸窘迫综合症、心血管疾病和癌症等疾病的产生有关。因此，生物体内羟自由基的研究是现代医学、生物学和生物化学的重要课题，羟自由基的测定方法以及其清除剂的筛选方法的研究备受关注，尤其是从天然药物中寻找有效、低毒、价廉的羟自由基清除剂成为主要方向。
目前，临床上用于检测羟自由基的方法有：电子自旋共振法、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、荧光法、分光光度法等。但上述方法均存在不足之处，例如：电子自旋共振法、高效液相色谱法对设备的要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及；化学发光法、比色法、荧光法等虽然不需要昂贵的仪器，但是在测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响，因此使用受到限制；分光光度法是比较常用的方法，与上述方法相比，具有操作简单、准确度和灵敏度较高的优点，但是，由于在试管中进行反应，因此耗费样品与溶剂，同时还会受到溶剂的干扰影响，从而限制了样品的溶剂选择，使供试样品的范围受到限制。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种具有操作简单、易于实现、灵敏度和专属性高、受试样品的选择范围广、可适用于成分复杂的提取物的筛选羟自由基清除剂的方法，为筛选羟自由基清除剂提供一条便捷途径。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种筛选羟自由基清除剂的方法，包括如下步骤：
a)将供试样品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂或/和用展开剂展开后挥干溶剂；
b)将经步骤a)处理后的薄层板浸渍于由Fe2+-显色剂-络合剂形成的底物溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在30～45℃下反应5～20分钟；所述的显色剂为羟自由基能使其褪色的试剂；
c)将经步骤b)反应后的薄层板浸渍于H2O2反应溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在40～55℃下反应20～40分钟；
d)在可见光下观察薄层板的显色情况：出现的在白色背景下为所述显色剂本身颜色的斑点即为羟自由基清除剂。
所述的供试样品可为提取物，也可为单体化合物；所述的供试样品溶液是采用可溶解供试样品的适宜溶剂配制而成。
作为优选方案，所述供试样品溶液的浓度为1～30mg/mL。
所述的薄层板可选用硅胶板、聚酰胺板、纤维素板等，优选为硅胶板。
所述的显色剂优选为苋菜红或甲苯胺蓝。
所述的络合剂优选为乙二胺四乙酸(EDTA)。
所述的Fe2+来源于水溶性亚铁盐，例如：七水合硫酸亚铁。
作为优选方案，所述底物溶液中：Fe2+的浓度为8.0～15.0mmol/L，显色剂的浓度为1.5～3.5mmol/L，络合剂的浓度为0.01～0.15mmol/L。
所述的H2O2反应溶液优选为质量分数为1～8％H2O2水溶液。
本发明提供的筛选羟自由基清除剂的方法，是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的筛选方法，是基于Fe2+与H2O2反应生成羟自由基，并选用羟自由基能使其褪色的显色剂(例如：苋菜红/甲苯胺蓝)，若不发生褪色反应，即可判定为是羟自由基清除剂。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
1、本发明方法操作简单，只需要极少的样品(2μL即可)，无需复杂的仪器和设备，易于实现；
2、本发明方法可实现高通量筛选不同试样，且筛选结果形象直观，易于辨识和记忆；
3、本发明方法灵敏度和专属性高，不受溶剂和样品浓度的影响，可适用于成分复杂的提取物样品，也可适用于单体化合物，使得受试样品的选择范围更为广泛。
总之，本发明提供了一种具有操作简单、易于实现、灵敏度和专属性高、受试样品的选择范围广、可适用于成分复杂的提取物的筛选羟自由基清除剂的方法，为筛选羟自由基清除剂提供了一条便捷途径，具有显著性应用价值。
附图说明
图1为实施例1的筛选结果图；
图2为实施例2的筛选结果图；
图3为实施例3中的筛选结果图；
图4为实施例4的筛选结果图；
图5为实施例5的筛选结果图；
图6为实施例6中的筛选结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案做进一步详细、完整地说明。但本发明的内容不仅仅限于下面的实施例，下面实施例所用的实验方法无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
1、溶液的配制
反应溶液：用58.0mL去离子水稀释2.0mL质量分数为30％的过氧化氢水溶液，使配制成质量分数为1％的过氧化氢水溶液。
底物溶液：使150.0mg七水合硫酸亚铁、60.0mg苋菜红及1.0mg EDTA溶解于60mL去离子水中，配制成Fe2+的浓度为9.0mmol/L、显色剂苋菜红的浓度为1.6mmol/L，络合剂EDTA的浓度为0.04mmol/L的底物溶液。
样品溶液：使10.0mg甘露醇粉末溶解于1mL乙醇水溶液中(去离子水与95％乙醇的体积比为2：3)，配制成质量浓度为10mg/mL的甘露醇溶液，临用前现配。
2、活性测定
a)将上述样品溶液点样于3cm×4cm的薄层板上(平行点样3个点，点与点之间相隔1cm，每个点样量均为2μL)，挥干溶剂；
b)将经步骤a)处理后的薄层板浸渍于上述底物溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在30℃下反应8分钟；
c)将经步骤b)反应后的薄层板浸渍于上述反应溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在40℃下反应20分钟；
d)在可见光下观察薄层板的显色情况。
图1为本实施例得到的薄层板显色结果图，由图1可见：3个点样点均出现了在白色背景下的所述显色剂本身颜色(红色)的斑点，说明甘露醇为羟自由基清除剂，与现有研究结果一致，从而验证了本发明方法具有可行性。
实施例2
1、溶液的配制
反应溶液：用56.0mL去离子水稀释4.0mL质量分数为30％的过氧化氢水溶液，使配制成质量分数为2％的过氧化氢水溶液。
底物溶液：使160.0mg七水合硫酸亚铁、35.0mg甲苯胺蓝及2.4mg EDTA溶解于60mL去离子水中，配制成Fe2+的浓度为9.5mmol/L、显色剂甲苯胺蓝的浓度为1.9mmol/L，络合剂EDTA的浓度为0.12mmol/L的底物溶液。
样品溶液：使12.0mg甘露醇粉末溶解于1mL乙醇水溶液中(去离子水与95％乙醇的体积比为2：3)，配制成质量浓度为12mg/mL的甘露醇溶液，临用前现配。
2、活性测定
a)将上述样品溶液点样于4cm×7cm的薄层板上(平行点样3个点，点与点之间相隔1cm，每个点样量均为2μL)，挥干溶剂；
b)将经步骤a)处理后的薄层板浸渍于上述底物溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在35℃下反应15分钟；
c)将经步骤b)反应后的薄层板浸渍于上述反应溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在50℃下反应25分钟；
d)在可见光下观察薄层板的显色情况。
图2为本实施例得到的薄层板显色结果图，由图2可见：3个点样点均出现了在白色背景下的所述显色剂本身颜色(蓝色)的斑点，说明甘露醇为羟自由基清除剂，与现有研究结果一致，进一步验证了本发明方法具有可行性。
实施例3
1、溶液的配制
反应溶液：用50.0mL去离子水稀释10.0mL质量分数为30％的过氧化氢水溶液，使配制成质量分数为5％的过氧化氢水溶液。
底物溶液：使240.0mg七水合硫酸亚铁、100.0mg苋菜红及1.8mg EDTA溶解于60mL去离子水中，配制成Fe2+的浓度为14.0mmol/L、显色剂苋菜红的浓度为2.8mmol/L，络合剂EDTA的浓度为0.09mmol/L的底物溶液。
样品溶液：使1.0mg山奈酚溶解于1mL无水乙醇中，配制成质量浓度为1.0mg/mL的山奈酚溶液，临用前现配。
对照品溶液：使21.0mg甘露醇粉末溶解于1mL乙醇水溶液中(去离子水与95％乙醇的体积比为2：3)，配制成质量浓度为21mg/mL的甘露醇溶液，临用前现配。
2、活性测定
a)在4cm×6cm的薄层板上，将上述样品溶液和对照品溶液分别平行点样3个点，点与点之间均相隔1cm，每个点样量均为2μL，挥干溶剂；
b)将经步骤a)处理后的薄层板浸渍于上述底物溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在33℃下反应12分钟；
c)将经步骤b)反应后的薄层板浸渍于上述反应溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在42℃下反应32分钟；
d)在可见光下观察薄层板的显色情况。
图3为本实施例得到的薄层板显色结果图，由图3可见：6个点样点均出现了在白色背景下的所述显色剂本身颜色(红色)的斑点，说明山奈酚具有羟自由基清除剂的活性，与现有研究结果一致，从而验证了本发明方法可适用于单体化合物。
实施例4
1、溶液的配制
反应溶液：用48.0mL去离子水稀释12.0mL质量分数为30％的过氧化氢水溶液，使配制成质量分数为6％的过氧化氢水溶液。
底物溶液：使200.0mg七水合硫酸亚铁、110.0mg苋菜红及1.6mg EDTA溶解于60mL去离子水中，配制成Fe2+的浓度为12.0mmol/L、显色剂苋菜红的浓度为3.0mmol/L，络合剂EDTA的浓度为0.08mmol/L的底物溶液。
样品溶液：使1.0mg维生素C(VC)溶解于1mL无水乙醇中，配制成质量浓度为1.0mg/mL的VC溶液，临用前现配。
对照品溶液：使21.0mg甘露醇粉末溶解于1mL乙醇水溶液中(去离子水与95％乙醇的体积比为2：3)，配制成质量浓度为21mg/mL的甘露醇溶液，临用前现配。
2、活性测定
a)在4cm×6cm的薄层板上，将上述样品溶液和对照品溶液分别平行点样3个点，点与点之间均相隔1cm，每个点样量均为2μL，挥干溶剂；
b)将经步骤a)处理后的薄层板浸渍于上述底物溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在42℃下反应5分钟；
c)将经步骤b)反应后的薄层板浸渍于上述反应溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在47℃下反应37分钟；
d)在可见光下观察薄层板的显色情况。
图4为本实施例得到的薄层板显色结果图，由图4可见：6个点样点均出现了在白色背景下的所述显色剂本身颜色(红色)的斑点，说明VC具有羟自由基清除剂的活性，与现有研究结果一致，从而验证了本发明方法可适用于单体化合物。
实施例5
1、溶液的配制
反应溶液：用52.0mL去离子水稀释8.0mL质量分数为30％的过氧化氢水溶液，使配制成质量分数为4％的过氧化氢水溶液。
底物溶液：使210.0mg七水合硫酸亚铁、90.0mg苋菜红及2.0mg EDTA溶解于60mL去离子水中，配制成Fe2+的浓度为12.5mmol/L、显色剂苋菜红的浓度为2.5mmol/L，络合剂EDTA的浓度为0.1mmol/L的底物溶液。
样品溶液：使30.0mg杏鲍菇提取物溶解于1mL无水乙醇中，配制成质量浓度为30.0mg/mL的杏鲍菇提取物溶液，临用前现配。
对照品溶液：使21.0mg甘露醇粉末溶解于1mL乙醇水溶液中(去离子水与95％乙醇的体积比为2：3)，配制成质量浓度为21mg/mL的甘露醇溶液，临用前现配。
2、活性测定
a)在4cm×6cm的薄层板上，将上述样品溶液和对照品溶液分别平行点样3个点，点与点之间均相隔1cm，每个点样量均为2μL，挥干溶剂；
b)将经步骤a)处理后的薄层板浸渍于上述底物溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在40℃下反应20分钟；
c)将经步骤b)反应后的薄层板浸渍于上述反应溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在55℃下反应35分钟；
d)在可见光下观察薄层板的显色情况。
图5为本实施例得到的薄层板显色结果图，由图5可见：6个点样点均出现了在白色背景下的所述显色剂本身颜色(红色)的斑点，说明杏鲍菇提取物具有羟自由基清除剂的活性，与现有研究结果一致，从而进一步验证了本发明方法可适用于成分复杂的提取物。
实施例6
1、溶液的配制
反应溶液：用46.0mL去离子水稀释14.0mL质量分数为30％的过氧化氢水溶液，使配制成质量分数为7％的过氧化氢水溶液。
底物溶液：使195.0mg七水合硫酸亚铁、120.0mg苋菜红及1.2mg EDTA溶解于60mL去离子水中，配制成Fe2+的浓度为11.7mmol/L、显色剂苋菜红的浓度为3.3mmol/L，络合剂EDTA的浓度为0.07mmol/L的底物溶液。
样品溶液：称取圣地红景天药材细粉20g，加入200mL体积分数为95％的乙醇水溶液中，冷浸24小时后过滤，浓缩滤液，冷冻干燥；称取所得浸膏10mg，用1mL体积分数为50％的乙醇水溶液溶解，得到圣地红景天供试品溶液。
2、活性测定
a)将上述样品溶液点样于2cm×10cm的薄层板上，点样量为20μL，挥干溶剂后置入由体积比为35:1的三氯甲烷与乙酸乙酯形成的展开剂中，待展开后，取出薄层板并充分挥干展开剂；
b)将经步骤a)处理后的薄层板浸渍于上述底物溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在45℃下反应7分钟；
c)将经步骤b)反应后的薄层板浸渍于上述反应溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在41℃下反应27分钟；
d)在可见光下观察薄层板的显色情况。
图6为本实施例得到的薄层板显色结果图，由图6可见：点样点出现了在白色背景下的所述显色剂本身颜色(红色)的斑点，说明本发明方法可适用于从复杂基质中快速锁定具有羟自由基清除剂活性的斑点，从而寻找到具有活性的化合物。
由上述实施例可以看出，本发明方法可以快速筛选羟自由基清除剂，灵敏度和专属性高，不受溶剂和样品浓度的影响，可适用于成分复杂的提取物样品，也可适用于单体化合物，受试样品的选择范围非常广泛。另外，本发明方法操作简单，只需要极少的样品(2μL即可)，无需复杂的仪器和设备，易于实现；且可实现高通量筛选不同试样，且筛选结果形象直观，易于辨识和记忆；为筛选羟自由基清除剂提供了一条便捷途径，具有显著性应用价值。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种筛选羟自由基清除剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将供试样品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂或/和用展开剂展开后挥干溶剂；
b)将经步骤a)处理后的薄层板浸渍于由Fe2+-显色剂-络合剂形成的底物溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在30～45℃下反应5～20分钟；所述的显色剂为羟自由基能使其褪色的试剂；所述的络合剂选用乙二胺四乙酸(EDTA)；
c)将经步骤b)反应后的薄层板浸渍于H2O2反应溶液中；取出薄层板拭去其表面多余液滴，然后在40～55℃下反应20～40分钟；
d)在可见光下观察薄层板的显色情况：出现的在白色背景下为所述显色剂本身颜色的斑点即为羟自由基清除剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述供试样品溶液的浓度为1～30mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的薄层板选用硅胶板、聚酰胺板或纤维素板。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的显色剂选用苋菜红或甲苯胺蓝。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Fe2+来源于水溶性亚铁盐。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述底物溶液中：Fe2+的浓度为8.0～15.0mmol/L，显色剂的浓度为1.5～3.5mmol/L，络合剂的浓度为0.01～0.15mmol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的H2O2反应溶液选用质量分数为1～8％的H2O2水溶液。
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