CN106282239A - miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法 - Google Patents
miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种本发明的miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法，包括以下步骤：(1)miRNAs在健康人HSC和慢性期CML病人LSC中的差异表达研究；(2)miR-21在调控LSC对IM原发性耐药中的作用；(3)miR-21调控LSC对IM原发性耐药的分子机制研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地说是一种miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法。
背景技术
慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)是一种起源于多能造血干细胞并严重威胁人类健康的恶性增殖性疾病，占我国慢性白血病的90％以上，在所有的急、慢性白血病中约占18％左右，居白血病的第三位。CML起病缓慢，约75％～85％的慢粒患者在1～5年由稳定期转入急变期。一旦急变后，半数以上病例在3个月内死亡，仅个别病例生存期能超过1年。目前唯一能根治CML的方法是异基因造血干细胞移植，但因供者来源有限、医疗费用高等因素最终只有不到20％患者能够进行异基因造血干细胞移植。由于超过90％的病人在确诊为CML时均处于慢性期，因此，针对慢性期的治疗对于控制病情恶化和延长患者寿命极其重要。格列卫是目前治疗慢性期CML的特效药，然而，格列卫尽管有效却依然无法治愈CML，患者必须长期服药以控制病情，给患者造成沉重的经济负担。越来越多的研究已经显示，白血病干细胞对格列卫原发性耐药是格列卫无法根治CML的根本原因，因此，阐明白血病干细胞对格列卫原发性耐药的分子机制将为制定根除白血病干细胞进而根治CML的治疗策提供重要的参考资料和科学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法。
本发明的miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法，包括以下步骤：
(1)miRNAs在健康人HSC和慢性期CML病人LSC中的差异表达研究
①HSC和LSC的分离、分选和鉴定：通过骨髓穿刺获得健康人和CML病人骨髓血(5-10ml)，用含500U/ml肝素的生理盐水抗凝。采用Percoll非连续密度梯度离心法从骨髓血分离单形核细胞，然后用流式细胞仪分选出LSC(Lin-CD34+CD38-)细胞。纯化的LSC通过双色双融合荧光原位杂交方法检测BCR-ABL融合基因。
②miRNAs在HSC和LSC中的表达分析与鉴定：采用Ambion公司的mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取纯化的HSC和LSC的小分子RNA，反转录后通过基于TaqMan探针定量PCR的方法对上述两组样品的324个成熟miRNA进行了检测。以RNU48为内参计算各个miRNA的相对表达量，再将五名CML病人的miRNA相对表达量与五名健康人对应miRNA的平均相对表达量进行比较(≥3名病人的miRNA表达水平上调或下调5倍以上被定义为表达发生明显变化)，鉴定在LSC中表达明显上调或下调的miRNAs。
(2)miR-21在调控LSC对IM原发性耐药中的作用
①构建miR-21抑制剂表达载体及检测其抑制效率和时效：根据成熟miR-21分子的序列构建基于逆转录病毒的miR-21抑制剂表达载体(MSCV-miR-21-inhibitor)。用MSCV-miR-21-inhibitor转染LSC不同时间，然后通过定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21的表达水平，与MSCV-control转染组(对照组)相比较，评价MSCV-miR-21-inhibitor对miR-21的抑制效率和时效。
②抑制miR-21对IM抑制LSC和HSC克隆形成以及诱导其凋亡的影响：将MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC和HSC一定时间后(根据上述时效检测结果)，然后用终浓度为5μM的IM(此浓度为CML病人在IM用药后体内血浆的峰值和体外有效抑制BCR-ABL激酶活性的浓度)处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况，评价miR-21抑制剂和IM联合作用于LSC的特异性。
③抑制LSC的miR-21表达对IM治疗人白血病移植瘤模型的作用：应用NOD/SCID小鼠建立人白血病移植瘤模型(NOD/SCID小鼠既缺乏T和B淋巴细胞功能，又有先天免疫缺陷，是一种免疫缺陷更严重的动物模型，异种移植物更易在其身上移植成功。)选取6至8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成四组：LSC，LSC+IM，LSC(转染MSCV-control)+IM，LSC(转染MSCV-miR-21-inhibitor)+IM。移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过尾静脉将转染和未转染的LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入小鼠。移植1个月后以尾静脉注射的方式进行IM治疗(200mg/kg/d)，连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸润情况。
(3)miR-21调控LSC对IM原发性耐药的分子机制研究
①检测HSC和LSC中PTEN和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平：首先将新鲜分离的HSC和LSC进行固定，然后分别与PTEN和PDCD4蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察HSC和LSC中PTEN和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价HSC和LSC中PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化情况。
②抑制miR-21表达对PTEN蛋白表达以及AKT和S6磷酸化水平的影响：用MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC不同时间后(根据上述时效检测结果)，将LSC进行固定，然后分别与PTEN蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC中PTEN蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价抑制miR-21表达对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。
③过表达PTEN对AKT和S6磷酸化水平的影响以及对IM抑制LSC克隆形成和诱导LSC凋亡的影响：根据PTEN基因的序列构建基于逆转录病毒的PTEN表达载体(MSCV-PTEN)。用MSCV-PTEN转染LSC不同时间后通过Western blot检测PTEN的表达水平，与MSCV转染组(对照组)相比较，评价MSCV-PTEN的表达效率和时效。用MSCV或MSCV-PTEN分别转染LSC一定时间后(根据时效检测结果)进行以下实验：(1)将LSC进行固定，然后分别与AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC中PTEN蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价过表达PTEN对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。(2)加入终浓度为5μM的IM或对照溶剂处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况。
④阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM抑制LSC和HSC克隆形成和诱导其细胞凋亡的影响：不同浓度的PI3K特异性抑制剂(LY294002：1，5和10μM和雷帕霉素：0.02，0.1和0.5μM)预处理LSC两小时，然后加入终浓度为5μM的IM或对照溶剂处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况，评价PI3K和mTOR抑制剂与IM联合作用于LSC的特异性。
⑤阻断LSC的PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM治疗人白血病移植瘤模型的作用：选取6至8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成6组：LSC，LSC+IM(200mg/kg/d)，LSC+Wortmannin(2mg/kg/d)，LSC+雷帕霉素(4mg/kg/d)，LSC+Wortmannin+IM，LSC+雷帕霉素+IM。移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过尾静脉将LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入小鼠。移植1个月后以尾静脉注射的方式进行IM、Wortmannin和雷帕霉素单独或联合治疗，连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸润情况。
本发明的研究方法通过比较miRNAs在正常造血干细胞和LSC中的表达，鉴定在LSC中发生明显表达变化的miRNAs，深入研究其调控LSC对格列卫原发性耐药过程中的作用及其分子调控机制调控机制，为解决LSC对格列卫原发性耐药发现潜在的作用靶点。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步具体描述，但本发明的实施方式不限于此。
miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法，包括以下步骤：
(1)miRNAs在健康人HSC和慢性期CML病人LSC中的差异表达研究
①HSC和LSC的分离、分选和鉴定：通过骨髓穿刺获得健康人和CML病人骨髓血(5-10ml)，用含500U/ml肝素的生理盐水抗凝。采用Percoll非连续密度梯度离心法从骨髓血分离单形核细胞，然后用流式细胞仪分选出LSC(Lin-CD34+CD38-)细胞。纯化的LSC通过双色双融合荧光原位杂交方法检测BCR-ABL融合基因。
②miRNAs在HSC和LSC中的表达分析与鉴定：采用Ambion公司的mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取纯化的HSC和LSC的小分子RNA，反转录后通过基于TaqMan探针定量PCR的方法对上述两组样品的324个成熟miRNA进行了检测。以RNU48为内参计算各个miRNA的相对表达量，再将五名CML病人的miRNA相对表达量与五名健康人对应miRNA的平均相对表达量进行比较(≥3名病人的miRNA表达水平上调或下调5倍以上被定义为表达发生明显变化)，鉴定在LSC中表达明显上调或下调的miRNAs。
(2)miR-21在调控LSC对IM原发性耐药中的作用
①构建miR-21抑制剂表达载体及检测其抑制效率和时效：根据成熟miR-21分子的序列构建基于逆转录病毒的miR-21抑制剂表达载体(MSCV-miR-21-inhibitor)。用MSCV-miR-21-inhibitor转染LSC不同时间，然后通过定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21的表达水平，与MSCV-control转染组(对照组)相比较，评价MSCV-miR-21-inhibitor对miR-21的抑制效率和时效。
②抑制miR-21对IM抑制LSC和HSC克隆形成以及诱导其凋亡的影响：将MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC和HSC一定时间后(根据上述时效检测结果)，然后用终浓度为5μM的IM(此浓度为CML病人在IM用药后体内血浆的峰值和体外有效抑制BCR-ABL激酶活性的浓度)处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况，评价miR-21抑制剂和IM联合作用于LSC的特异性。
③抑制LSC的miR-21表达对IM治疗人白血病移植瘤模型的作用：应用NOD/SCID小鼠建立人白血病移植瘤模型(NOD/SCID小鼠既缺乏T和B淋巴细胞功能，又有先天免疫缺陷，是一种免疫缺陷更严重的动物模型，异种移植物更易在其身上移植成功。)选取6至8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成四组：LSC，LSC+IM，LSC(转染MSCV-control)+IM，LSC(转染MSCV-miR-21-inhibitor)+IM。移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过尾静脉将转染和未转染的LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入小鼠。移植1个月后以尾静脉注射的方式进行IM治疗(200mg/kg/d)，连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸润情况。
(3)miR-21调控LSC对IM原发性耐药的分子机制研究
①检测HSC和LSC中PTEN和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平：首先将新鲜分离的HSC和LSC进行固定，然后分别与PTEN和PDCD4蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察HSC和LSC中PTEN和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价HSC和LSC中PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化情况。
②抑制miR-21表达对PTEN蛋白表达以及AKT和S6磷酸化水平的影响：用MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC不同时间后(根据上述时效检测结果)，将LSC进行固定，然后分别与PTEN蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC中PTEN蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价抑制miR-21表达对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。
③过表达PTEN对AKT和S6磷酸化水平的影响以及对IM抑制LSC克隆形成和诱导LSC凋亡的影响：根据PTEN基因的序列构建基于逆转录病毒的PTEN表达载体(MSCV-PTEN)。用MSCV-PTEN转染LSC不同时间后通过Western blot检测PTEN的表达水平，与MSCV转染组(对照组)相比较，评价MSCV-PTEN的表达效率和时效。用MSCV或MSCV-PTEN分别转染LSC一定时间后(根据时效检测结果)进行以下实验：(1)将LSC进行固定，然后分别与AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC中PTEN蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价过表达PTEN对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。(2)加入终浓度为5μM的IM或对照溶剂处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况。
④阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM抑制LSC和HSC克隆形成和诱导其细胞凋亡的影响：不同浓度的PI3K特异性抑制剂(LY294002：1，5和10μM和雷帕霉素：0.02，0.1和0.5μM)预处理LSC两小时，然后加入终浓度为5μM的IM或对照溶剂处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况，评价PI3K和mTOR抑制剂与IM联合作用于LSC的特异性。
⑤阻断LSC的PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM治疗人白血病移植瘤模型的作用：选取6至8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成6组：LSC，LSC+IM(200mg/kg/d)，LSC+Wortmannin(2mg/kg/d)，LSC+雷帕霉素(4mg/kg/d)，LSC+Wortmannin+IM，LSC+雷帕霉素+IM。移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过尾静脉将LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入小鼠。移植1个月后以尾静脉注射的方式进行IM、Wortmannin和雷帕霉素单独或联合治疗，连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸润情况。
Claims (1)
1.miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法，包括以下步骤：
(1)miRNAs在健康人HSC和慢性期CML病人LSC中的差异表达研究
①HSC和LSC的分离、分选和鉴定：通过骨髓穿刺获得健康人和CML病人骨髓血(5-10ml)，用含500U/ml肝素的生理盐水抗凝。采用Percoll非连续密度梯度离心法从骨髓血分离单形核细胞，然后用流式细胞仪分选出LSC(Lin-CD34+CD38-)细胞。纯化的LSC通过双色双融合荧光原位杂交方法检测BCR-ABL融合基因。
②miRNAs在HSC和LSC中的表达分析与鉴定：采用Ambion公司的mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取纯化的HSC和LSC的小分子RNA，反转录后通过基于TaqMan探针定量PCR的方法对上述两组样品的324个成熟miRNA进行了检测。以RNU48为内参计算各个miRNA的相对表达量，再将五名CML病人的miRNA相对表达量与五名健康人对应miRNA的平均相对表达量进行比较(≥3名病人的miRNA表达水平上调或下调5倍以上被定义为表达发生明显变化)，鉴定在LSC中表达明显上调或下调的miRNAs。
(2)miR-21在调控LSC对IM原发性耐药中的作用
①构建miR-21抑制剂表达载体及检测其抑制效率和时效：根据成熟miR-21分子的序列构建基于逆转录病毒的miR-21抑制剂表达载体(MSCV-miR-21-inhibitor)。用MSCV-miR-21-inhibitor转染LSC不同时间，然后通过定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21的表达水平，与MSCV-control转染组(对照组)相比较，评价MSCV-miR-21-inhibitor对miR-21的抑制效率和时效。
②抑制miR-21对IM抑制LSC和HSC克隆形成以及诱导其凋亡的影响：将MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC和HSC一定时间后(根据上述时效检测结果)，然后用终浓度为5μM的IM(此浓度为CML病人在IM用药后体内血浆的峰值和体外有效抑制BCR-ABL激酶活性的浓度)处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况，评价miR-21抑制剂和IM联合作用于LSC的特异性。
③抑制LSC的miR-21表达对IM治疗人白血病移植瘤模型的作用：应用NOD/SCID小鼠建立人白血病移植瘤模型(NOD/SCID小鼠既缺乏T和B淋巴细胞功能，又有先天免疫缺陷，是一种免疫缺陷更严重的动物模型，异种移植物更易在其身上移植成功。)选取6至8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成四组：LSC，LSC+IM，LSC(转染MSCV-control)+IM，LSC(转染MSCV-miR-21-inhibitor)+IM。移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过尾静脉将转染和未转染的LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入小鼠。移植1个月后以尾静脉注射的方式进行IM治疗(200mg/kg/d)，连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸润情况。
(3)miR-21调控LSC对IM原发性耐药的分子机制研究
①检测HSC和LSC中PTEN和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平：首先将新鲜分离的HSC和LSC进行固定，然后分别与PTEN和PDCD4蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察HSC和LSC中PTEN和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价HSC和LSC中PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化情况。
②抑制miR-21表达对PTEN蛋白表达以及AKT和S6磷酸化水平的影响：用MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC不同时间后(根据上述时效检测结果)，将LSC进行固定，然后分别与PTEN蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC中PTEN蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价抑制miR-21表达对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。
③过表达PTEN对AKT和S6磷酸化水平的影响以及对IM抑制LSC克隆形成和诱导LSC凋亡的影响：根据PTEN基因的序列构建基于逆转录病毒的PTEN表达载体(MSCV-PTEN)。用MSCV-PTEN转染LSC不同时间后通过Western blot检测PTEN的表达水平，与MSCV转染组(对照组)相比较，评价MSCV-PTEN的表达效率和时效。用MSCV或MSCV-PTEN分别转染LSC一定时间后(根据时效检测结果)进行以下实验：(1)将LSC进行固定，然后分别与AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC中PTEN蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价过表达PTEN对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。(2)加入终浓度为5μM的IM或对照溶剂处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况。
④阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM抑制LSC和HSC克隆形成和诱导其细胞凋亡的影响：不同浓度的PI3K特异性抑制剂(LY294002：1，5和10μM和雷帕霉素：0.02，0.1和0.5μM)预处理LSC两小时，然后加入终浓度为5μM的IM或对照溶剂处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况，评价PI3K和mTOR抑制剂与IM联合作用于LSC的特异性。
⑤阻断LSC的PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM治疗人白血病移植瘤模型的作用：选取6至8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成6组：LSC，LSC+IM(200mg/kg/d)，LSC+Wortmannin(2mg/kg/d)，LSC+雷帕霉素(4mg/kg/d)，LSC+Wortmannin+IM，LSC+雷帕霉素+IM。移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过尾静脉将LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入小鼠。移植1个月后以尾静脉注射的方式进行IM、Wortmannin和雷帕霉素单独或联合治疗，连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸润情况。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109234389A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-18 | 浙江大学 | 一种hsa-miR-146a-5p基因PCR检测试剂盒及应用 |
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2015
- 2015-06-24 CN CN201510353188.2A patent/CN106282239A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109234389A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-18 | 浙江大学 | 一种hsa-miR-146a-5p基因PCR检测试剂盒及应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170104 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |