CN106259307A - 一种马精子低温及冷冻保存稀释液 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及动物精液低温和冷冻保存液的制作，特别涉及一种马用精子低温及冷冻保存稀释液，所述精子低温保存稀释液由碳酸氢钠，羟乙基哌嗪乙磺酸，二水合柠檬酸钠,一水合柠檬酸钾,氢氧化钠,乳糖,葡萄糖，肌醇、庆大霉素、新霉素、安普霉素、粘菌素、两性霉素、焦磷酸钠、酪蛋白酸钠、乳清蛋白、抗氧化剂及去离子水组合而成。本发明能有效提高马精液低温和冷冻解冻后的精子活率及配种受胎率。与常规方法比，该方法操作简单、稳定，技术效果尤其显著。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及动物精液低温和冷冻保存液的制作，特别涉及一种马用精子低温及冷冻保存稀释液。
背景技术
我国是养马业大国，马匹数量居世界第二位。作为一种主要的大家畜，马曾经与人类生产生活息息相关，机械工业兴起后，马的役用价值弱化，逐渐淡出人们生活。近些年，随着我国人民生活水平的提高，以产品、文化休闲为主的现代马业在我国悄然兴起，现代马业的发展迫切需要采用人工授精的方式进行马匹改良，精液的体外保存(低温及冷冻保存)是目前马匹人工授精过程中的技术核心。
自从1950年Czechoslovakia首次报道了将煮沸的牛奶用于精液体外保存后，这一简单易于获取的天然精液稀释液被广泛的用于牛、山羊、绵羊及马的精液保存。直到今天，几乎所有的马精液保存液均以脱脂奶作为其主要成分。然而这种基于奶的精液稀释液存在如下几个问题，第一，不同个体、不同产奶期乳成分变异较大，由此导致稀释液批次间不稳定，无法实现标准化生产；第二，奶中除了对精子保存有利的物质外，还含有某些对精子保存不利的成分，不做区分的应用脱脂乳会对精子保存产生一定的负面影响；第三，天然奶是一种胶体溶液，其主要成分酪蛋白均以酪蛋白颗粒的形式存在，这种颗粒在长期低温储存和冷冻条件下易于聚合产生沉淀，这一性质导致以天然奶为基础的精液稀释储存期较短。
1949年英国科学家Polge、Smith和Parkes等发现甘油对低温冷冻精液的保护作用后，家畜精液冷冻技术才出现重大突破。但以甘油作为抗冻剂应用于马精子冷冻并未取得理想效果。已经意识到相同冷冻剂对不同的细胞组织的冷冻保护效果存在显著差异，因此,针对马精子细胞应该寻找更加适合的抗冻剂进行冷冻保护。
普通体细胞主要依靠周围环境和胞内的抗氧化酶和天然抗氧化剂清除多余活性氧。精子作为一类高度分化的特殊细胞，极具简化的细胞质使其丧失了携带大量抗氧化剂和自身修复氧化损伤的能力。因此精子抗氧化途径主要依靠周围环境中的抗氧化物。精子体外保存过程中稀释液即为其所处的环境，因此稀释液中抗氧化剂对保护精子免受氧化损伤至关重要意义。
为了克服以上基于天然奶或奶成分制备的精液稀释液的缺点，研制具有自主知识产权的精液稀释液，我们研究团队从2012年至今开展了系列研究发明了一种马用精子低温和冷冻保存稀释液，其应用效果优于国内外同类产品。
相关检索未发现与本专利权利要求相似的报道。
发明内容
本发明目的在于针对目前精液保存稀释液的不足之处，提供一种用于精液低温和冷冻保存的稀释液及其制备方法，能有效提高马精液低温和冷冻解冻后的精子活率及配种受胎率。与常规方法比，该方法操作简单、稳定，技术效果尤其显著。
实现上述目的的技术方案是：
一种马精子低温及保存稀释液，所述精子低温保存稀释液由糖盐溶液焦磷酸钠、酪蛋白酸钠(sodium caseinate，SC)、乳清蛋白(whey protein，WP)、抗氧化剂、组合抗生素及去离子水组合而成。
所述糖盐溶液制作方法及添加量：称量碳酸氢钠0.33g，羟乙基哌嗪乙磺酸4.766g，二水合柠檬酸钠0.375g,一水合柠檬酸钾0.615g,氢氧化钠0.2g,乳糖27g,葡萄糖18.27g，肌醇0.01g溶解于800ml去离子水中，再用1000ml容量瓶加去离子水定容至1000ml。每1000ml所述马精子低温保存液中添加该糖盐溶液999ml。
所述组合抗生素制作方法及添加量：称量庆大霉素2g、新霉素6g、安普霉素6.8g、粘菌素2.4g、两性霉素0.01g溶解于40ml去离子水中。每1000ml所述马精子低温保存液中加入1ml混合抗生素。
所述焦磷酸钠添加量为：每1000ml所述马精子低温保存液中加入0.02g。
所述酪蛋白酸钠添加量为：每1000ml所述马精子低温保存液中加入10-40g。
所述乳清蛋白添加量为：每1000ml所述马精子低温保存液中加入5-10g。
所述抗氧化剂及其添加量为，每1000ml所述马精子低温保存液中添加甘氨酸(Gly)1g、牛磺酸(Tau)3g、甲流氨酸(Met)3.75g、维生素E(Ve)0.5ml。
一种用于马精子冷冻保存的稀释液，所述精子冷冻保存的稀释液由上述马精子低温保存液、抗冻剂和鸡卵黄组合而成。
所述马精子低温保存稀释液的添加量为：每1000ml所述马精子冷冻保存液中添加865ml。
所述抗冻剂包含单一抗冻剂或组合抗冻剂。
所述单一抗冻剂为：甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺，每1000ml所述马精子冷冻保存液中添加35ml甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺。
所述组合抗冻剂的制作方法及添加量为：
组合1：1/3甘油与2/3甲基甲酰胺；
组合2：2/3甘油与1/3甲基甲酰胺；
组合3：1/3甘油与2/3二甲基甲酰胺；
组合4：2/3甘油与1/3二甲基甲酰胺；
组合5：1/3甲基甲酰胺与2/3二甲基甲酰胺；
组合6：1/3二甲基甲酰胺与2/3甲基甲酰胺；
组合7：1/3甘油1/3甲基甲酰胺与2/3二甲基甲酰胺；
每1000ml所述马精子冷冻保存液中添加35ml组合抗冻剂。
所述鸡卵黄的添量为：每1000ml所述马精子冷冻保存液中添加100ml。
下面结合实施例对发明作进一步的描述。
实施例1混合抗生素的制备
称量庆大霉素2g、新霉素6g、安普霉素6.8g、粘菌素2.4g、两性霉素0.01g溶解于40ml去离子水中，置于4℃冰箱中备用。
实施例2组合抗冻剂的制备
组合1：1/3甘油与2/3甲基甲酰胺
组合2：2/3甘油与1/3甲基甲酰胺
组合3：1/3甘油与2/3二甲基甲酰胺
组合4：2/3甘油与1/3二甲基甲酰胺
组合5：1/3甲基甲酰胺与2/3二甲基甲酰胺
组合6：1/3二甲基甲酰胺与2/3甲基甲酰胺
组合7：1/3甘油1/3甲基甲酰胺与2/3二甲基甲酰胺
实施例3糖盐溶液
称量碳酸氢钠0.33g，羟乙基哌嗪乙磺酸4.766g，二水合柠檬酸钠0.375g,一水合柠檬酸钾0.615g,氢氧化钠0.2g,乳糖27g,葡萄糖18.27g，肌醇0.01g溶解于800ml去离子水中，添加1ml混合抗生素，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶加去离子水定容至1000ml，置于4℃冰箱中备用。
实施例4酪蛋白酸钠的保护作用
称量酪蛋白酸钠1g溶解于800ml糖盐溶液中，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶加糖盐溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中备用。
实施例5乳清蛋白的保护作用
称量乳清蛋白1g溶解于800ml糖盐溶液中，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶加糖盐溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中备用。
实施例6酪蛋白酸钠和乳清蛋白的协同保护作用
称量酪蛋白酸钠1g及乳清蛋白1g溶解于800ml糖盐溶液中，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶加糖盐溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中备用。
实施例7不同浓度的酪蛋白酸钠和乳清蛋白的协同保护作用
称量酪蛋白酸钠1、2或4g及乳清蛋白0.5、1或2g按照表1分别溶解于800ml糖盐溶液中，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶糖盐溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中备用。
表1不同浓度的酪蛋白酸钠和乳清蛋白的协同保护作用分组配置表
注释：酪蛋白酸钠(sodium caseinate，SC)，乳清蛋白(whey protein，WP)
实施例8焦磷酸钠的作用
称量酪蛋白酸钠4g，乳清蛋白1g，焦磷酸钠0.004g,0.02g或0.04g溶解于800ml糖盐溶液中，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶加糖盐溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中备用。
实施例9抗氧化剂的作用
称量酪蛋白酸钠4g，乳清蛋白1g，焦磷酸钠0.02g溶解于800ml糖盐溶液中，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶加糖盐溶液定容至1000ml；分成5份，向其中分别加入1g甘氨酸或3g牛磺酸或3.75g甲硫氨酸或0.5ml维生素E，置于4℃冰箱中备用。
实施例10单一抗冻剂的抗冻保护作用
称量酪蛋白酸钠4g，乳清蛋白1g，焦磷酸钠0.02g，甘氨酸1g，牛磺酸3g，甲硫氨酸3.75g和维生素E 0.5ml溶解于800ml去离子水中，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶加糖盐溶液定容至1000ml；量取865ml，向其中加入100ml鸡卵黄和35ml甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺，搅拌均匀，置于4℃冰箱中备用。
实施例11组合抗冻剂的抗冻保护作用
称量酪蛋白酸钠4g，乳清蛋白1g，肌醇0.01g，焦磷酸钠0.02g，甘氨酸1g，牛磺酸3g，甲硫氨酸3.75g和维生素E 0.5ml溶解于800ml糖盐溶液中，搅拌均匀后，再用1000ml容量瓶加糖盐溶液定容至1000ml；量取865ml，向其中加入100ml鸡卵黄和35ml 7种组合抗冻剂之一，搅拌均匀，置于4℃冰箱中备用。
试验例1
下面结合试验例对酪蛋白酸钠和乳清蛋白在马精子低温保存中的作用对本发明进行说明。
(一)精液采集
6匹英纯血种公马被用于进行精液保存实验，用母马诱情，当公马勃起爬跨时，采精员手持假阴道把柄处，站立于台马右或左后侧，将假阴道平放于母马尻侧，并迅速将阴茎导入假阴道。种公马射精后，采精员顺势使阴茎从假阴道中退出，将假阴道集精杯端缓慢下倾，将采集到的精液用一次性纱布过滤后备用。本方法精子采集的过程遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式。
(二)精液处理
1不浓缩精液低温保存(含有25％精清)
将过滤后精液用与马精液低温保存稀释液做1:3稀释后置于5℃储存，48h后检测精液活力参数。
2浓缩后精液低温保存(不含精清)
过滤后精液置于50ml离心管中，600×g离心力，离心10分钟，收集下层精子，用马精液低温保存稀释液稀释至50×106个/ml浓度置于5℃储存，48h后检测精液活力参数。
(三)精液质量评价
用计算机辅助精子分析仪检测精子运动参数。取5μl解冻后精液滴加于Leja玻片检测腔室中(腔室深度/高度固定为20μl)，置于配备有37℃恒温载物台的计算机精子辅助分析仪下，进行精液质量评价，评价参数主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路径速率(average path velocity,VAP)，快速运动精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子质量评定结果
当保存液中不含精清时，糖盐溶液中添加乳清粉组和乳清粉+酪蛋白酸钠组TM、PM、VAP及RAP显著高于对照组；当保存液中含有25％浓度精清时，糖盐溶液中添加酪蛋白酸钠和乳清粉+酪蛋白酸钠组TM、PM及RAP值显著高于对照组。
试验例1结果如下表所示
注释：同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)。
试验例2
下面结合试验例对不同浓度酪蛋白酸钠和乳清蛋白在马精子低温保存中的作用对本发明进行说明。
(一)精液采集
6匹英纯血种公马被用于进行精液保存实验，用母马诱情，当公马勃起爬跨时，采精员手持假阴道把柄处，站立于台马右或左后侧，将假阴道平放于母马尻侧，并迅速将阴茎导入假阴道。种公马射精后，采精员顺势使阴茎从假阴道中退出，将假阴道集精杯端缓慢下倾，将采集到的精液用一次性纱布过滤后备用。本方法精子采集的过程遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式。
(二)精液处理
将过滤后精液用与马精液低温保存稀释液做1:3稀释后置于5℃储存，48h后检测精液活力参数。
(三)精液质量评价
用计算机辅助精子分析仪检测精子运动参数。取5μl解冻后精液滴加于Leja玻片检测腔室中(腔室深度/高度固定为20μl)，置于配备有37℃恒温载物台的计算机精子辅助分析仪下，进行精液质量评价，评价参数主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路径速率(average path velocity,VAP)，快速运动精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子质量评定结果
低温保存48h后检测结果表明：SC 4+Whey 1和SC 2+Whey 1组TM值显著高于其他四组；SC 4+Whey 1组PM值显著高于其他五组；SC 4+Whey 1组RAP值显著高于其他五组，SC1+Whey 2组RAP值显著低于SC 0.5+Whey 1和SC 2+Whey 1组。这一结果表明在糖盐溶液中同时添加1g/mL浓度乳清粉和4g/mL浓度的酪蛋白酸钠可以获得最佳的保存效果。
试验例2结果如下表所示
注释：同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)
试验例3
下面结合试验例对焦磷酸钠在马精子低温保存中的作用对本发明进行说明。
(一)精液采集
6匹英纯血种公马被用于进行精液保存实验，用母马诱情，当公马勃起爬跨时，采精员手持假阴道把柄处，站立于台马右或左后侧，将假阴道平放于母马尻侧，并迅速将阴茎导入假阴道。种公马射精后，采精员顺势使阴茎从假阴道中退出，将假阴道集精杯端缓慢下倾，将采集到的精液用一次性纱布过滤后备用。本方法精子采集的过程遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式。
(二)精液处理
将过滤后精液用与马精液低温保存稀释液做1:3稀释后置于5℃储存，48h后检测精液活力参数。
(三)精液质量评价
用计算机辅助精子分析仪检测精子运动参数。取5μl解冻后精液滴加于Leja玻片检测腔室中(腔室深度/高度固定为20μl)，置于配备有37℃恒温载物台的计算机精子辅助分析仪下，进行精液质量评价，评价参数主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路径速率(average path velocity,VAP)，快速运动精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子质量评定结果
低温保存48h后检测结果表明：添加4、20及40mg/L浓度焦磷酸钠组精子TM、PM、VAP及RAP均高于对照。
试验例3结果如下表所示
注释：同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)
试验例4
下面结合试验例对四种抗氧化剂在马精子低温保存中的作用对本发明进行说明。
(一)精液采集
6匹英纯血种公马被用于进行精液保存实验，用母马诱情，当公马勃起爬跨时，采精员手持假阴道把柄处，站立于台马右或左后侧，将假阴道平放于母马尻侧，并迅速将阴茎导入假阴道。种公马射精后，采精员顺势使阴茎从假阴道中退出，将假阴道集精杯端缓慢下倾，将采集到的精液用一次性纱布过滤后备用。本方法精子采集的过程遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式。
(二)精液处理
将过滤后精液用与马精液低温保存稀释液做1:3稀释后置于5℃储存，48h后检测精液活力参数。
(三)精液质量评价
用计算机辅助精子分析仪检测精子运动参数。取5μl解冻后精液滴加于Leja玻片检测腔室中(腔室深度/高度固定为20μl)，置于配备有37℃恒温载物台的计算机精子辅助分析仪下，进行精液质量评价，评价参数主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路径速率(average path velocity,VAP)，快速运动精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子质量评定结果
低温保存72h后检测结果表明：添加甘氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸及维生素E四组精子TM、PM、VAP及RAP均高于对照。
试验例4结果如下表所示
注释：甘氨酸Gly；甲硫氨酸Met；牛磺酸Tau；维生素E Ve；同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)
试验例5
下面结合试验例对不同抗冻剂在马精子低温保存中的作用对本发明进行说明。
(一)精液采集
6匹英纯血种公马被用于进行精液保存实验，用母马诱情，当公马勃起爬跨时，采精员手持假阴道把柄处，站立于台马右或左后侧，将假阴道平放于母马尻侧，并迅速将阴茎导入假阴道。种公马射精后，采精员顺势使阴茎从假阴道中退出，将假阴道集精杯端缓慢下倾，将采集到的精液用一次性纱布过滤后备用。本方法精子采集的过程遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式。
(二)精液处理
过滤后精液置于50ml离心管中，600×g离心力，离心10分钟，收集下层精子，用马精液冷冻保存液稀释至200×106个/ml浓度，装入0.5ml细管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷冻仪中以60℃/min速率降温至-110℃，投入液氮中保存。
(三)精液质量评价
用计算机辅助精子分析仪检测精子运动参数。取5μl解冻后精液滴加于Leja玻片检测腔室中(腔室深度/高度固定为20μl)，置于配备有37℃恒温载物台的计算机精子辅助分析仪下，进行精液质量评价，评价参数主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路径速率(average path velocity,VAP)，快速运动精子比例(Rapid motility,RAP)。
精子质膜完整性(viability)用SYBR14/PI荧光染色试剂盒进行检测(Invitrogen，L-7011)。具体方法为：精液解冻后用PBS 1:1稀释液后，650×g离心7min，离心完成后弃上清，添加1ml HEPES缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,10％BSA,pH 7.4),添加5μL SYBR 14(0.02mM)，36℃孵育10min，然后再添加5μL 2.4mM浓度的PI(propidiumiodide)，36℃孵育8min，孵育完成后650×g离心7min，离心完成后弃上清，添加1ml PBS稀释后滴片置于荧光显微镜(OLYMPUS,ONIX992-IX71)下观测。每个实验组解冻3支细管，每支细管取3个观察视野，每个样本计数精子个数不少于500个。
用JC-1(Invitrogen,M34152)荧光染料染色检测精子线粒体膜电势(mitochondrion membranes potential，HMP)。精液解冻后用PBS 1:1稀释液后，650×g离心7min，离心完成后弃上清，添加1ml PBS洗涤1次。添加10μL JC-1(200μM)至1mL稀释后精液样品中，36℃孵育10min，滴片观察，每个视野在荧光下对染色精子进行计数，然后转换至可见光下对总精子数进行计数。每个实验组解冻3支细管，每支细管取3个观察视野，每个样本计数精子个数不少于500个。
精子顶体缺损率(Defect Acrosome)用FITC-PNA(lectin agglutinin ofarachis Hypogaea,L-7381,Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)荧光染料染色观测。精液解冻后用PBS1:1稀释液后，650×g离心7min，离心完成后弃上清，添加1ml PBS洗涤1次。添加20μL FITC-PNA(1.125mg/mL)至1mL稀释后精液样品中，36℃孵育10min，滴片用荧光显微镜观察。每个实验组解冻3支细管，每支细管取3个观察视野，每个样本计数精子个数不少于500个。
(四)精子质量评定结果
比较三种不同浓度甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺与常规抗冻剂甘油、乙二醇及二甲基亚砜对马精子冷冻效果的影响。结果显示3.5％的甲基甲酰和二甲基甲酰胺冻后精子质量最好。
试验例5结果如下表所示
注释：同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)
试验例6
下面结合试验例对7种不同抗冻剂组合在马精子低温保存中的作用对本发明进行说明。
(一)精液采集
6匹英纯血种公马被用于进行精液保存实验，用母马诱情，当公马勃起爬跨时，采精员手持假阴道把柄处，站立于台马右或左后侧，将假阴道平放于母马尻侧，并迅速将阴茎导入假阴道。种公马射精后，采精员顺势使阴茎从假阴道中退出，将假阴道集精杯端缓慢下倾，将采集到的精液用一次性纱布过滤后备用。本方法精子采集的过程遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式。
(二)精液处理
过滤后精液置于50ml离心管中，600×g离心力，离心10分钟，收集下层精子，用马精液冷冻保存液稀释至200×106个/ml浓度，装入0.5ml细管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷冻仪中以60℃/min速率降温至-110℃，投入液氮中保存。
(三)精液质量评价
用计算机辅助精子分析仪检测精子运动参数。取5μl解冻后精液滴加于Leja玻片检测腔室中(腔室深度/高度固定为20μl)，置于配备有37℃恒温载物台的计算机精子辅助分析仪下，进行精液质量评价，评价参数主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路径速率(average path velocity,VAP)，快速运动精子比例(Rapid motility,RAP)。
精子质膜完整性(viability)用SYBR14/PI荧光染色试剂盒进行检测(Invitrogen，L-7011)。具体方法为：精液解冻后用PBS 1:1稀释液后，650×g离心7min，离心完成后弃上清，添加1ml HEPES缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,10％BSA,pH 7.4),添加5μL SYBR 14(0.02mM)，36℃孵育10min，然后再添加5μL 2.4mM浓度的PI(propidiumiodide)，36℃孵育8min，孵育完成后650×g离心7min，离心完成后弃上清，添加1ml PBS稀释后滴片置于荧光显微镜(OLYMPUS,ONIX992-IX71)下观测。每个实验组解冻3支细管，每支细管取3个观察视野，每个样本计数精子个数不少于500个。
用JC-1(Invitrogen,M34152)荧光染料染色检测精子线粒体膜电势(mitochondrion membranes potential，HMP)。精液解冻后用PBS 1:1稀释液后，650×g离心7min，离心完成后弃上清，添加1ml PBS洗涤1次。添加10μL JC-1(200μM)至1mL稀释后精液样品中，36℃孵育10min，滴片观察，每个视野在荧光下对染色精子进行计数，然后转换至可见光下对总精子数进行计数。每个实验组解冻3支细管，每支细管取3个观察视野，每个样本计数精子个数不少于500个。
精子顶体缺损率(Defect Acrosome)用FITC-PNA(lectin agglutinin ofarachis Hypogaea,L-7381,Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)荧光染料染色观测。精液解冻后用PBS1:1稀释液后，650×g离心7min，离心完成后弃上清，添加1ml PBS洗涤1次。添加20μL FITC-PNA(1.125mg/mL)至1mL稀释后精液样品中，36℃孵育10min，滴片用荧光显微镜观察。每个实验组解冻3支细管，每支细管取3个观察视野，每个样本计数精子个数不少于500个。
(四)精子质量评定结果
7种组合抗冻剂对马精子冷冻效果的显示：组合1冻后精子活率显著高于组合5、组合7、甘油组及甲基甲酰胺组(P<0.05)。组合2冻后PM值显著高于二甲基甲酰胺和组合5(P<0.05)。
试验例6结果如下表所示
注释：同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)
试验例7
下面结合试验例低温和冷冻保存后精液受胎率对本发明进行说明。
(一)精液采集
母马诱情，当公马勃起爬跨时，采精员手持假阴道把柄处，站立于台马右或左后侧，将假阴道平放于母马尻侧，并迅速将阴茎导入假阴道。种公马射精后，采精员顺势使阴茎从假阴道中退出，将假阴道集精杯端缓慢下倾，将采集到的精液用一次性纱布过滤后备用。本方法精子采集的过程遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式。
(二)精液处理
1.低温保存
将过滤后精液分成两份，一份用自配液稀释3倍，另一份用进口商品马专用稀释液稀释3倍，置于5℃储存8-12h后用于输精实验。
2.精液冷冻
过滤后精液置于50ml离心管中，600×g离心力，离心10分钟，收集下层精子，用马精液冷冻保存液稀释至200×106个/ml浓度，装入0.5ml细管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷冻仪中以60℃/min速率降温至-110℃，投入液氮中保存，配种前37℃水浴30s解冻,评价精液活力参数。
(四)精子受胎率验证
1.低温保存后精液的受胎验证
4匹英纯血种公马按顺序轮流采精，每匹公马每周采精2-3次。精液采集后离心浓缩处理，用本专利低温保存液和对照稀释液(马专用进口商品稀释液)稀释至2亿/ml，5℃保存8-12h后，用于输精验证受胎效果。
供试母马共计114匹，其中71匹母马用对照稀释液保存后的精液输精，另外43匹母马用本专利低温保存液稀释保存后的精液输精。母马的发情鉴定和输精时间的确定采用直肠触摸检查卵巢的方式实施。当卵泡发育至3期卵泡时进行一次输精，间隔大约24小时再进行卵巢检查，未排卵则再输精一次，直至排卵，每次输精所用公马精液由输精当天公马的轮序决定。采用子宫角输精法，每次输入1个亿有效精子，排卵后13天B超检查妊娠结果。
2.冻精受胎验证
2匹英纯血种公马按上述所述冷冻方法，解冻后输精进行受胎验证。供试母马30匹，采用B超探测结合激素诱导确定输精时间，每天7点和19点B超检查母马卵泡发育情况，当卵泡大于35×35mm时注射5000IU单位人绒毛膜促性腺激素(HCG)，于注射激素24h后，每间隔6-12h B超探测(卵泡大小)结合触摸卵泡质地(软硬)综合确定输精时间，每次输入6-8支0.5ml细管精液，总前进精子数约为200～300×106个总精子。
应当强调的是，对本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
(四)受胎率评定结果
专利低温保存稀释液与进口商品低温保存稀释液保存马精子8-12h后，人工授精验证受胎率，结果表明本专利稀释液情期受胎率为67.7％(29/43)，进口商品稀释液情期受胎率为57.7％(41/71)，表明本专利稀释液保存效果优于进口商品液，彰显了技术进步。
用本专利冷冻稀释液进行精液冷冻，解冻后进行受胎率验证，情期受胎率达到了50％(15/30)。这一受胎率略高于国际上报道的40-50％情期受胎率，彰显了技术进步。
Claims (3)
1.一种马精子低温及冷冻保存稀释液，其特征在于，所述精子低温保存稀释液由碳酸氢钠，羟乙基哌嗪乙磺酸，二水合柠檬酸钠, 一水合柠檬酸钾, 氢氧化钠, 乳糖, 葡萄糖，肌醇、庆大霉素、新霉素、安普霉素、粘菌素、两性霉素、焦磷酸钠、酪蛋白酸钠、乳清蛋白、抗氧化剂及去离子水组合而成；其添加量及添加方法为：称量碳酸氢钠 0.33g，羟乙基哌嗪乙磺酸4.766 g，二水合柠檬酸钠 0.375 g, 一水合柠檬酸钾 0.615 g, 氢氧化钠 0.2 g,乳糖 27 g, 葡萄糖 18.27 g，肌醇 0.01g，焦磷酸钠 0.004-0.04g，酪蛋白酸钠10-40g，乳清蛋白5-10g溶解于800 ml去离子水中，再用1000 ml容量瓶加去离子水定容至1000 ml，每1000 ml所述马精子低温保存液中添加该糖盐溶液999 ml；所述抗生素的添加量及添加方法为：称量庆大霉素2 g、新霉素 6 g、安普霉素 6.8 g、粘菌素 2.4 g、两性霉素 0.01 g溶解于40 ml去离子水中；每1000 ml所述马精子低温保存液中加入1ml混合抗生素；所述的抗氧化剂为每1000 ml所述马精子低温保存液中添加甘氨酸 1 g、牛磺酸 3 g、甲流氨酸3.75 g或维生素E 0.5 ml。
2.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述稀释液中还含有抗冻剂和鸡卵黄。
3.根据权利要求2所述的稀释液，其特征在于，每1000 ml所述稀释液中添加有35ml单一抗冻剂或组合抗冻剂；所述单一抗冻剂为甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺；所述组合抗冻剂共有7种，分别为:
组合1：1/3 甘油与2/3 甲基甲酰胺；
组合2：2/3 甘油与1/3 甲基甲酰胺；
组合3：1/3 甘油与2/3 二甲基甲酰胺；
组合4：2/3 甘油与1/3 二甲基甲酰胺；
组合5：1/3甲基甲酰胺与2/3 二甲基甲酰胺；
组合6：1/3二甲基甲酰胺与2/3甲基甲酰胺；
组合7：1/3 甘油1/3甲基甲酰胺与2/3 二甲基甲酰胺。
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| CN113115766A (zh) * | 2019-12-31 | 2021-07-16 | 中国农业大学 | 一种提高精液保存品质的精液保存液及其制备方法与应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN101220345A (zh) * | 2008-01-23 | 2008-07-16 | 西北农林科技大学 | 一种牛冷冻精液稀释液及其制备方法 |
| CN103704202A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-04-09 | 广西大学 | 一种矮马精液冷冻保存的方法 |
| CN105519521A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-04-27 | 内蒙古农业大学 | 一种马精液冷冻保存液及其配制方法 |
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