CN106255551B - 创新纳米孔测序技术 - Google Patents

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Abstract

用于长阅读、无标记、光学纳米孔长链分子测序的方法和设备。总体来说，本公开描述新颖测序技术，其基于并入纳米通道以使用宽间隔(>波长)、～1‑nm孔径“曲折”纳米孔来递送单一长链分子，所述纳米孔充分地减缓易位以便使用光学技术来提供大规模并行、单一碱基解析。使用简单胶状纳米颗粒的新颖、定向自组装纳米制造方案用于在纳米通道顶上形成纳米孔阵列，从而使长链分子展开。在纳米颗粒阵列的表面，工程化等离子/极化声子结构中的强烈局部电磁场允许使用光学技术来进行单一碱基解析。

Description

创新纳米孔测序技术
发明背景
人基因组是二倍体，并且除非所有多态性或变体得以定型并指派至具体染色体，否则基因组序列是不完整的。另外，整个染色体景观必须加以解码，包括基因组中的复杂结构变体(即，非整倍性、易位、倒置、重复、损失杂合性等)。举例来说，平衡易位发生于500个个体中的约1个个体，三体性21发生于650个活产中的多达1个活产，并且广泛基因组不稳定性发生于许多癌症中30-32。因此，完全基因组测序必须能够识别所有复杂基因组变体。
许多超高通量测序技术可利用(例如，Illumina/Solex1、SOLiD2,3、Roche/4544、PacBio5-9、Ion Torrent10-12等9)和在研发中[例如，ZS Genetics9、IBM13GE(美国专利号7264934)、Oxford Nanopore14、Noblegen15、Bionanomatrix16和GnuBIO9。虽然测序成本已经极大地降低，但是此技术仍然不能完全将人基因组测序。在由249个支架组成的GRCh37版本的基因组中，仍然有未测序的人基因组的许多区域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/data.shtml)17-19。另外，所有当前商用技术需要参考基因组以便高质量组装。虽然使用短阅读技术，重新基因组组装是可能的，但是相对于重测序工程来说，质量较低。20这些问题限制下一代测序平台识别某些变体，诸如较大结构变化和重复区域的能力。
高通量、长阅读测序技术对于解析人基因组的复杂性是必不可少的。人基因组是二倍体，意味着存在各自22个常染色体的两个拷贝和性别染色体的两个拷贝(XX或XY)。长阅读对于定型每个同源染色体独有的遗传变体来说是必需的。另外，基因组中的重复区域使得通过短阅读来测序是不可能的。
下一代测序技术的最近进展，与稳健分析方法的研发，给予研究人员确定序列变化在各种人疾病中的作用的能力。然而，绝大多数这些方法产生的结果限于发现多态性，而忽视单倍体型的重要性。现在最常研究的变化是单核苷酸多态性(SNP)以及小插入和缺失(InDel)。这是因为虽然当前世代测序方法精通于识别杂合基因座，但是不能将多态性指派至两个同源染色体中的一个，由此使基因/疾病关联的研究复杂化。HapMap和其它工程正在开发单倍体型图谱21-23，但是需要新的方法来解决变体中的发生于罕见基因型(例如，新颖体细胞突变)或变化基因组(例如，癌症)中的顺式和反式关系。
缺乏从当前测序方法获得的单倍体型信息限制科学家得出重要生物和医学结论的能力，也就是说，因为多态性列表分类为纯合或杂合，所以其忽视每个多态性情况的重要性。因此，研究人员经常只关注于出现在蛋白质编码区域(外显子组)中的变体，因为仅其重要性可预测。在不知道是否基因间区域的变体在顺式中和/或经由远距离染色质相互作用与患病基因有联系的情况下，不可能预测这些变体是否有害。单倍体型解析测序优于标准全基因组测序(WGS)的主要优势是将所有多态性指派至具体染色体(例如，母系相比于父系)，并且在远端调控元件中的突变(或变体)与同一染色体上的顺式连接基因之间建立联系。
与直接单倍体型测序相关联的限制主要围绕相对短阅读长度和当前平台的‘定型不灵敏性’。24-26存在产生单倍体型解析序列的少许方法，但是这些方法不符合$1,000基因组目标，这是由于与测序上游过程相关联的复杂性和额外成本。27-29
纳米孔DNA测序技术是有吸引力的，因为其提供DNA序列信息的直接访问，而不需要序列信息的扩增或复杂后处理，并且有希望高速执行长阅读。33,34存在研究与开发各种纳米孔技术的较长历史。然而，上述希望仍未完全实现，并且事实上，除了特别构建的测试DNA样品的阅读以外，还未报告任何阅读。(与Jeremy一起检查此叙述)另外，未报道使用纳米孔技术来进行单一碱基解析。在以前研究中确定的问题包括：
1.～1碱基/μs的转导速度(需要较高带宽电学检测，伴随有噪声和统计波动问题)。
2.大于单一碱基的纵向解析度(对于生物孔，通常～4个碱基)35。
3.使用电读出机制很难进行大规模并行应用。
已经研究生物和固态纳米孔技术。对于生物系统，α-溶血素36和遗传工程化MspA37是最常见纳米孔，并且已经展示减缓DNA易位的各种技术，涉及使用酶38或与dsDNA区域一起拾取的ssDNA链的修饰或减缓易位的其它干扰39。然而，与纳米孔内的碱基的较大数目相关联的难题仍然存在。35
对于固态孔，最常见材料是氮化硅和蓝宝石，其使用离子或电子射束技术来形成纳米级孔。石墨烯是另一种吸引很多关注的材料40,41。原子层沉积可在刻蚀后用于细化孔尺寸。42也有人研究了固态孔添加生物结构的混合技术。43尽管所有此类活动，纳米孔技术的希望仍未实现。
所有这些方法的一个最终难题是需要调整至大规模并行应用，以便成本有效制造。目前制造方法由直接写入技术(电子射束和离子射束刻蚀)主导，这些技术不可调整至大规模并行架构，也与低成本地广泛采用此技术不相容。电学测量不容易调整至在离子流体环境中进行并行测量，光学测量提供并行处理的最有希望的途径，此议题提供必需单一碱基解析。
发明概要
本公开提供用于长阅读、无标记、光学纳米孔长链分子测序的方法和设备。总体来说，本公开描述新颖测序技术，其基于并入纳米通道以使用宽间隔(>波长)、～1-nm孔径“曲折”纳米孔递送单一长链分子，所述纳米孔充分地减缓易位以便使用光学技术来提供大规模并行、单一碱基解析。使用简单胶状纳米颗粒的新颖、定向自组装纳米制造方案用于在纳米通道顶上形成纳米孔阵列，从而展开长链分子。在纳米颗粒阵列的表面，工程化等离子/极化声子结构中的强烈局部电磁场允许使用光学技术来进行单一碱基解析。表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱学(SECARS)是具有不需要将碱基标记的优势的一种这类技术。具有标记碱基的荧光技术提供替代可能性。
附图简述
图1是纳米通道制造的示例性方法的示意图。
图2是展示形成具有1μm间距的纳米通道的光致抗蚀剂图案的SEM图像。
图3是展示使用本文所述技术所形成的1D封闭通道的SEM图像。
图4是通过50-nm直径二氧化硅纳米颗粒形成的500nm宽通道壁的SEM图像。
图5是使用本文所述技术形成的100nm宽通道的SEM图像。
图6是展示使用本文所述技术形成的多层纳米通道的SEM图像。
图7是包括中断纳米通道的多孔屏障的如本文描述结构的示意图。
图8是穿过图7的纳米通道的样品流的顶部示意图。
图9是穿过图7的纳米通道的样品流的侧视图。
图10是使用本文提供方法制造的纳米通道顶盖的高解析度SEM图像。
图11是在沉积Si3N4CVD层之后图10的顶盖的高解析度SEM图像(在右侧部分蚀刻以形成储槽)。白色圆圈标识恰好在蚀刻进行时出现的孔。
图12是如本文描述纳米通道结构的示意图，其展示越过在纳米通道中形成的屏障，液体渗透穿过顶盖。
图13是具有纳米通道和一个3μm屏障的样品的图像。
图14是展示在施加电场的情况下沿着三个3-μm宽屏障的流体液滴的图像。
图15是本公开的纳米孔结构的示意图，其具有在曲折纳米孔结构的顶盖上组装的至少一个制造纳米孔。
图16是其中将曲折纳米孔结构施加至现有纳米孔结构的实施方案的示意图。
图17A是展示在将液滴安置于顶盖上之后大约15秒来自安置于HfO2ALD纳米通道的顶盖顶部的缓冲液/λDNA液滴的荧光的图像。
图17B是将液滴安置于顶盖上之后5分钟图17A的液滴的图像。
图17C是将液滴安置于顶盖上之后10分钟图17A的液滴的图像。
图18是展示为了实现可见性的光谱偏移的图。四个虚线标识独特光谱识别符。(图根据参考57中展示的版本来修改)
图19是根据本公开的检测方案的示意图，其中泵和斯托克斯激发射束使用Ti:蓝宝石激光和非线性过程来产生。
图20A描绘根据本公开的一个实施方案的DNA操控的示例性方法。
图20B是图20A展示的结构的特写以更好地示出金属绝缘体金属(MIM)结构的位置和存在。
图21是其中含有DNA的溶液直接施加至纳米通道阵列的入口的典型实验的示意图。
图22是展示图21的纳米通道中的DNA渗透的示意图。
图23是在施加电压时进入纳米通道的DNA的图像。
图24是在逆转电压时从纳米通道移出的DNA的图像。
图25是展示在DNA移动方向上施加的电场使分子朝向正电极伸展几十μm的图像。
图26是展示在相反方向上(相对于图25)施加的电场将DNA压缩至2μm的图像。
图27示出证明可使用本文描述的纳米通道通过在装置两端施加不同电位来实现的DNA移动和伸展的数据。
图28是经工程化具有在正交方向上定位的不同层的两层纳米通道的示意图。
图29是展示两层纳米通道结构的层级之间的λDNA扩散的图像。
图30是根据本公开的实施方案的纳米通道的侧视图。
图31是展示纳米通道内的屏障处的DNA积累的图像。
图32是展示DNA穿过屏障移动的图像。
图33是可用于本文描述结构的电学设计的示意图。
图34是并入纳米通道和本文描述其它结构的可能芯片实验室设计的图像。
发明详述
根据第一实施方案，本公开提供纳米通道，其包括具有部分密封多孔顶盖的曲折纳米孔系统。根据另一个实施方案，纳米通道还包括整合金属-绝缘体-金属(MIM)等离子或极化声子结构，其增强样品内的可检测元件的光学检测并且提供必要空间定位。根据另一个实施方案，本公开提供长阅读、无标记、光学纳米孔长链分子测序的方法和设备。合适长链分子(有时在本文中称为“分子”或“所关注的分子”)包括DNA、RNA、蛋白质等。当然应了解虽然各种实施方案和实例可涉及特定类型长链分子，诸如DNA，但是除非另外特别说明，否则本公开设想这些实施方案和实例类似地可适用于其它类型长链分子包括，但是不一定限于RNA和蛋白质。
根据一些实施方案，本文描述测序技术能够以～$100的成本在一天以内测序完整人基因组。根据各种实施方案，本文描述技术利用以下一个或多个：纳米通道的整合系统；大于光学波长的间距下的曲折(延伸和回旋)纳米孔；金属-绝缘体-金属(MIM)等离子或极化声子结构，或如本文描述的其它光学检测增强结构；和光学读出机制诸如表面增强相干反斯托克斯拉曼散射或标记荧光技术。
根据更进一步实施方案，本公开提供利用以上中的每一个的方法。根据一些实施方案，只需要～1μm的容易接近间距下的单一、简单刻蚀步骤。根据各种实施方案，纳米级特征通过定向自组装过程来产生，此过程为廉价和现场可更换技术。
根据各种实施方案，本公开利用从纳米颗粒形成的纳米通道。根据一个实施方案，自组装纳米通道可通过在光致抗蚀剂壁上定向旋转涂布纳米颗粒(～50nm直径或更小)来形成，这些壁通过包括如本领域中熟知的曝光、显影和蚀刻的一些适当变体的一系列刻蚀步骤来形成，以使得纳米颗粒“堆叠”来形成纳米通道壁和顶盖。形成纳米颗粒的合适材料包括在移除光致抗蚀剂的方法中存在的材料。此外，应了解在其中纳米通道用于核酸的那些实施方案中，材料应亲水以使得能够用溶液填充纳米孔并且带负电荷以使得核酸能够易位穿过纳米孔。根据特定实施方案，发现二氧化硅纳米颗粒满足所有以上识别要求。在旋转涂布步骤之后进行“脱蜡”煅烧步骤，其烧尽光致抗蚀剂，烧结纳米颗粒以提供机械强度，并且提供亲水表面以便流体引入。替代过程诸如溶剂移除可用于移除光致抗蚀剂和ARC层。形成这些纳米通道的更多细节可见于美国专利号7,825,037中，其据此通过引用并入。
现在转向图1，其为纳米通道制造的示例性方法的示意图，可以看出在所描绘实施方案中，纳米通道制造包括多个步骤。首先，将衬底(例如，石英或熔融二氧化硅)旋转涂布底部抗反射涂层，然后涂布光致抗蚀剂层。随后，对于光致抗蚀剂层执行刻蚀以界定具有大于读出系统的光学解析度的间隔的纳米通道(参见，例如，图2)。举例来说，可以使用～1μm的周期和10-至100-nm的线宽。然而，应认识到更小和更大周期和线宽易于得到。根据图2示出的实施方案，干涉刻蚀可用于形成纳米通道，并且这些尺寸完全在甚至上一代或上两代刻蚀工具的能力范围内，从而为扩展至大量制造提供准备。随后，将抗反射层蚀刻以暴露衬底。然后，将胶状纳米颗粒(例如，二氧化硅纳米颗粒)旋转涂布于光致抗蚀剂图案上，由此将其首先以叠层方式沉积于光致抗蚀剂线之间的间隙中以形成纳米通道侧壁，并且最后延伸至光致抗蚀剂上以形成纳米通道顶盖。
如图3-5中容易发现，纳米颗粒形成纳米通道的侧壁和顶盖，并且顶盖中的纳米颗粒形成曲折纳米孔，如果将样品安置于纳米通道中，DNA分子必须横穿孔以便到达顶盖并且反之亦然。根据一些实施方案，使用50-nm直径二氧化硅纳米颗粒，但是大小和材料结构均是可变通的。沉积期间的毛细管力迫使纳米颗粒(NP)成为六边形的紧密堆积几何形状。作为粗略估计，此意味着纳米颗粒之间的间隙为～NP直径/3或～17nm。这些孔是复杂、3D路径，类似于当桔子堆积于本地超市中时产生的间隔和开放路径。然而，应了解归因于在纳米通道制造者控制下的纳米颗粒大小的显著分散度，实际结构是非常复杂的。出于本公开目的，我们将由纳米颗粒产生的间隔和开放路径称为“曲折纳米孔”。在叠层沉积中，归因于NP大小分散度的空间效应产生一系列纳米孔大小。
在旋转涂布纳米颗粒之后，然后将结构煅烧(在空气环境中，～800℃)以移除其余烃膜，将纳米颗粒烧结以获得额外机械强度，并且将纳米颗粒制备成亲水状态，从而允许用缓冲液/样品溶液来简单毛细管填充纳米通道。
容易了解这是非常灵活的纳米通道制造过程。对于二氧化硅纳米颗粒，简单干燥蚀刻步骤允许产生具有通往纳米通道入口的通路的储槽并且提供用于电泳转移和伸展的电极。额外特征是能够仅通过重复以上过程来堆叠具有平行或垂直纳米通道方向的多个纳米通道。参见，例如，图6，其示出堆叠纳米通道。除了纳米通道结构以外，经常需要引入与纳米通道顶盖间隔开的次级顶盖。这确保从纳米通道移动至顶盖的缓冲溶液的平坦表面，提供使目标分子从孔中流动开来的通道并且允许用于控制易位速度的额外电极。
此外，旋转涂布步骤之前的简单光学曝光使得能够沿着纳米通道来引入多孔区域(屏障)。如图7-9中示出，这些屏障可用于积聚样品中的所关注的分子并且将那些分子经由顶盖的易位局部化。
应认识到利用上述纳米通道的一些应用将受益于特别控制纳米通道顶盖中的纳米孔密度的能力。举例来说，可能需要减少纳米孔的密度，以便减少或消除样品不必要的漏泄或转移穿过顶盖和/或能够实现所关注的特定长链分子包括例如单链DNA(ssDNA)、RNA和蛋白质的易位、转移或识别。因此，本公开有利于形成曲折纳米孔，这些孔在纳米通道顶盖中形成并且可进一步通过标准膜沉积过程诸如电子束蒸发、溅射、CVD和/或共形原子层沉积(ALD)来减少大小和密度。(膜沉积闭合一些孔，降低密度，并且还减少其余孔的大小，从而每次只允许单一长链分子穿越。)
根据各种实施方案，在曲折纳米孔在顶盖中自组装之后，顶盖部分密封，这意味着通过纳米颗粒的自组装和煅烧来形成的一些而非所有外部可接近孔是封闭的。根据各种实施方案，孔可使用CVD、ALD或这两者的组合来密封。举例来说，如下文更详细描述，CVD与ALD的组合可用于封闭最小孔以防止样品漏泄或渗透穿过顶盖，控制孔密度，并且确保与光学解析度的相容性。
图10是多孔顶盖的高解析度SEM图像；而图11是沉积等离子体增强CVD氮化硅膜之后的多孔顶盖的高解析度SEM图像。在图11中，此结构在右侧部分蚀刻以形成储槽并且提供通往纳米通道侧面的通路。白色圆圈标识恰好在蚀刻进行时出现的孔。用于CVD的沉积工具在NP上敷设多孔层，如同一层厚厚的雪花。此过程可通过改变沉积条件来针对不同程度的膜孔隙率进行调整。用于氮化硅的CVD沉积的过程参数实例包括：T＝300℃；600毫托的压力；50W的RF功率；和[SiH4]30ccm、[NH3]50ccm、[N2]15ccm的流动速率。对于如此沉积的顶盖，纳米颗粒大小的分散度和纳米孔大小的分散度都是明显的。重要的是应紧记这是曲折纳米孔，并且开口尺寸不一定是沿着孔的最狭窄处。如可以在图11中看出，CVD膜基本上覆盖较大标度(～几十nm线性尺寸)纳米通道孔，但是在如此沉积与蚀刻区域之间的过渡区域，一些较大孔开始变得明显，如通过白色圆圈来标记。这些孔的密度和尺寸可通过以下各项来控制：1)调整NP大小分散度，2)在CVD步骤之前使用ALD来密封NP顶盖中的大部分孔，3)使用不同覆盖层(在活性金属层之前，其为电介质或金属)。甚至在未尝试优化的此第一实施例中，纳米孔密度接近于～λ的所需间距以允许每个曲折纳米孔出口的远场解析。缓冲溶液从顶盖蒸发是顶盖多孔的证据，并且对于以下概述的沉积和ALD步骤，此蒸发时间在多个数量级内加以控制。当偏压施加于纳米通道两端时，尤其使用屏障时，存在从孔中出现并且装饰顶盖顶部的分离流体液滴(和DNA)(图12-14)。注意液滴不是连续的，表明最大孔完全分离。
根据各种实施方案，具有至少一个制造纳米孔的纳米孔结构可组装于曲折纳米孔结构的顶盖上。这可为密集纳米孔结构诸如石墨烯薄片或稀疏纳米孔结构诸如氮化物膜，其中在将膜施加至曲折纳米孔结构之前或之后，例如通过离子研磨来制造在纳米孔。由于目标是阅读长DNA(以及RNA和蛋白质)分子，多达～50,000个碱基或～10μm天然长度，曲折纳米孔结构减少穿过常规配准纳米孔的DNA易位速度(图15)。
替代实施方案是施加曲折纳米孔至现有纳米孔结构，例如氮化物膜中的离子或电子研磨孔(图16)。这可通过施加纳米颗粒悬浮液至孔的一侧并且允许它干燥以形成DNA或类似长链分子的曲折途径来进行。可调整现有纳米孔直径以使得ALD可用于限制经由贯穿纳米颗粒的曲折途径的易位并且减小膜中的纳米孔的直径。膜中的孔可在形成曲折途径之前或之后制成。
从孔中的蒸发率提供孔密度的便利量度。对于如此制造的纳米通道(在CVD和ALD处理之前)，当将缓冲溶液液滴引入储槽中时，在流体蒸发之前，流体只在纳米通道中渗透<1mm的较小距离(在低实验室湿度下)。在以下论述的处理之后，在孔中的渗透距离增加至～1cm。
除了调整纳米孔密度和孔径以外，添加与多孔顶盖紧邻的无孔次级光学透明顶盖提供调整局部湿度并由此控制纳米通道中的蒸发率的手段。这顶盖可为装置提供多个增强：1)它可在缓冲液/分子溶液离开纳米孔时提供微观或宏观流道以允许将其从孔区域移除并且控制纳米孔处的局部湿度；2)它可提供远场光学测量的光学质量表面；并且3)在添加透明电极诸如ITO，或网格电极结构的情况下，它可允许进一步操控曲折纳米孔附近的准静态电场以控制易位速度。(参见例如图33。)
各种方法可用于降低这些孔的密度并且因此降低从通道的蒸发率。示例性方法利用SiO2CVD与原子层沉积(ALD)的组合。蒸发可通过液体渗透穿过通道的距离来估计。如果我们将液滴安放在多孔顶盖上，我们可发现液体穿过通道渗透大约1.5-至2.5-mm并且在相同距离下，DNA溶液容易渗透穿过具有～15nm孔的顶盖。如果我们将液滴安放至孔中，我们观察到溶液和DNA的相同渗透距离。在顶盖上化学气相沉积(CVD)80-至120-nm Si3N4或SiO2膜减少蒸发并提供具有DNA的溶液多达3-至4-mm的渗透。在CVD沉积物上进一步施加二氧化硅(SiO2)或氧化铝(Al2O3)的10-至20-nm厚原子层沉积(ALD)进一步减少顶盖孔径并提供多达5-8mm的液体渗透。
其它成功方法利用HfO2和Al2O3，其可例如使用ALD的标准半导体方案来沉积。图15A-15C示出在渗透顶盖时来自安置于HfO2ALD纳米通道的顶盖顶部的缓冲液/λDNA液滴的荧光。图17A示出在安置于顶盖上之后大约15秒的液滴。图17B示出5分钟之后的液滴并且图17C示出10分钟之后的液滴。λDNA渗透穿过顶盖中的其余孔，然后通过扩散沿着纳米通道散布。注意此分布进展的多达10min的较长时间标度。这暗示：1)孔的密度可大致上减少，而大小足够用于较长dsDNA渗透，2)存在个别λDNA分子易位的证据，并且3)由于曲折途径，易位时间(在没有任何施加偏压的情况下)对于测序是足够长的。
当然应认识到目前描述装置的许多即使不是大多数应用将实施检测所关注分子的检测机构并且许多合适机制为熟知的并且可用于目前描述装置。然而，还了解尤其DNA测序应用需要能够实现单一碱基解析的非常严格的检测方法，因此本公开提供新颖结构并且在适合于DNA测序应用的水平下增强并实现检测。
如熟知，使用远场光学技术来实现单一碱基灵敏度和解析度的难题与光子的较大尺寸相关联，所述光子尺寸可集中于～300nm光学波长～1/2的标度，比每个DNA碱基的～0.3nm线性尺寸大大约两个数量级。这可通过增加小体积中的局部场强度的场增强结构来解决。典型地这些场增强结构是金属，其中表面等离子体极化声子的激发导致较小局部区域中的较强场增强。这是已经研究许多年的表面增强拉曼散射的基础。
作为局部化并增强光子场的第一实施方案，金属膜可沉积于纳米通道顶盖顶部。如果膜通过定向过程诸如但不限于电子束蒸发来沉积，膜将与顶盖的精细结构共形，并且尤其具有与曲折纳米孔出口对齐并且与处于曲折纳米孔出口标度上的孔洞。这是由定向沉积和纳米通道顶盖的拓扑来引导的自动对齐过程，因此不需要刻蚀步骤。
替代局部金属结构是：偶极结构(指向彼此的两个金属三角形，在其之间具有较小间隙)或“C”孔(具有较小间隙的金属环)。这些结构中的每一个在光激发下产生间隙中的较大场。这些结构由刻蚀步骤界定，因此其适合于纳米孔的位置事先已知的情况，诸如在通过诸如电子射束刻蚀或离子射束研磨的过程来产生的制造纳米孔的情况下。
如上所述，根据另一个实施方案，碱基水平光学解析可由工程化多层级金属-绝缘体-金属(MIM)等离子结构来提供，所述结构自组装至纳米孔中，提供简单、廉价和自动对齐的制造过程。<1nm绝缘体厚度提供必要碱基水平解析度并且宽孔间隔允许独立远场光学读出，从而提供大规模并行测序能力。此外，标记(荧光)和未标记(SECARS)光学读出机制可用于此系统。这与产生单一分子拉曼散射检测的聚集胶状Au与Ag纳米颗粒之间的较小间隙有关。在这里，将间隙工程化以与纳米通道顶盖上的曲折纳米孔出口对齐。
MIM可通过各向异性和各向同性沉积过程的组合来沉积并且可自动对齐至纳米孔。举例来说，薄金属膜可首先通过电子束蒸发或溅射来沉积，这是不封闭纳米孔的定向过程。然后薄(例如，～1nm)绝缘体膜可通过原子层沉积来沉积，这是进一步减少纳米孔直径的共形沉积过程。最后，第二金属膜可通过定向过程来沉积。这提供自动对齐、大规模并行纳米制造技术，省略任何高解析度、～1-nm刻蚀的需要并且允许以必要解析度对近场过程进行远场光记录。MIM结构提供允许单一分子检测的强烈增强电磁场，以及用于解析例如单链DNA(ssDNA)中的个别碱基所必需的近场纳米级解析度。根据各种实施方案，样品经由纳米通道和纳米孔的运行由于纳米孔的曲折性而放缓并且可通过施加至通道、MIM和控制电极的电压来进一步控制，所述控制电极可安置于例如纳米通道顶盖上方。
因此，在其中使用基于拉曼光谱学的检测方法的那些实施方案中，上述技术可用于形成拉曼“热点”。表面增强拉曼散射(SERS)和表面增强相干反斯托克斯拉曼散射(SECARS)是已经展示单一分子水平灵敏度的提供增强信号水平的潜力的相关技术。52-56这两种技术依赖于经常在金属颗粒之间的间隙处(例如在胶状聚集体中)的局部“热点”。这些热点满足两个必需用途：1)确保提供单一分子灵敏度的较大电磁场(SERS，两光子过程，标度为～E4和SECARS，四波混合过程，标度为～E8)和2)将相互作用体积局部化于单一碱基水平尺寸，比λ3小许多数量级，从而提供必需单一碱基解析度。此分离可通过如上所述MIM结构来工程化。因此，对于纳米结构金属相当合理的30的场增强导致～106的拉曼增强和1012的SECARS增强。简单地陈述，拉曼散射是频率ω1下的入射光子与频率ν下的分子振动之间的混合，提供ω1+ν下的反斯托克斯信号和ω1-ν下的斯托克斯信号。反斯托克斯信号的强度与分子振动的占用数目成比例，并且总体上在室温下较小其中κT≤ν，其中κ是波兹曼常数并且T是绝对温度(开氏温标)。使用频率ω1和ω1-ν下的两个相干来源来相干性地驱动激发并且检测ω1+ν下的信号提供拉曼信号的另一种增强。这被称为相干反斯托克斯拉曼散射或CARS。通过使用宽频带第二(较低)激光频率(例如超连续谱)，我们可同时探测所有四个碱基。CARS是四波混合过程(通过第三阶非线性感受率χ(3)来描述)。替代方法是提供直接激发振动模式的声子来源。这些技术在一些情况下可为优选的，因为其无标记并且在测序之前不需要未知DNA的任何操控。四个DNA碱基中的每一个的拉曼光谱为熟知的57，并且提供容易分离的信号，如图18中示出(由参考57中的图修改而来)。荧光标记技术已经得以展示58并且可用作替代测序方法。作为自发拉曼散射(SERS)的荧光涉及两个光子，并且得到增强(E4)并通过等离子效应而局部化。59
示意性光学方案在图19中示出。根据一个实施方案，泵和斯托克斯激发射束可使用Ti:蓝宝石激光器和非线性过程诸如光学参量振荡器或超连续谱产生方案来产生。超连续谱的优势是所有四个碱基可同时探测(使用，例如，电介质滤波器来分离反斯托克斯波长)。根据示例性布置，激光照射至纳米通道衬底，以使得大多数泵光由MIM结构反射，从而简化SECARS信号的分离。由于装置探测各自定位于比光学波长小得多的解析度的一组单一碱基，因此没有如在传统CARS中的相位匹配要求，并且辐射在偶极子辐射图型中发出。合理选择照明几何形状62抑制来自衬底和纳米通道材料的非谐振四波混合信号，增强所需SECARS探测能力。根据一个实施方案，SECARS信号可对于高NA目标来进行收集并且成像至单一检测器上以便光子计数或成像至高灵敏度摄像机上以便大规模并行多孔分析。由于按照设计，孔分离超过目标的解析限度，因此每个通道的测量是光学独立的。
根据各种实施方案，总体上需要拉曼热点足够小并且与曲折纳米孔出口对齐以使得碱基依序穿越热点。目前描述技术利用自动对齐制造技术来确保此重叠。沉积过程诸如电子束蒸发和溅射是定向的，以使得在应用于我们的ALD涂布纳米颗粒顶盖的粗糙表面时，正好在孔位置处的沉积金属膜中形成孔洞，从而用来界定热点位置。额外定位可通过制造MIM结构来实施。这可使用ALD来完成以便在金属上依序沉积极薄电介质层(例如，～0.5至1nm)，随后使用ALD或使用定向沉积来沉积第二金属层。高度非线性SECARS过程进一步减少热点范围，提供所需单一碱基解析。由于孔径的随机分布，可能存在一些孔允许一个以上分子，例如同时一个以上ssDNA链，或残留dsDNA链的易位。幸运地，这些可通过同一位置上的两个碱基的阅读的时间重合来检测，并且这些孔可在计算上忽略，而不需要任何硬件修改。
根据各种实施方案，SECARS能够实现纳米级水平辨别，甚至在ssDNA中的碱基之间。虽然产生拉曼信号的相互作用由于MIM中的孔的较小尺寸和两个金属膜之间的间隔而被限制于近场中，但是读出是在远场中，从而提供大规模并行读出，其中每个摄像机像素可独立并同时地定址个别纳米孔。在完全工程化系统中，利用间隔超过观察显微术的解析单元的多达一百万个纳米孔和以30框架/s操控的摄像机进行长阅读(>50千碱基)以给出每小时多达1011碱基的通量是可能的。此外，流控芯片可廉价生产并且被设计成现场可更换的。
如上所述，根据一些实施方案，目前公开设备可用于快速和廉价分离、转移、检测和/或测序(本文共同地称为“操控”)核酸，包括例如基因组DNA。根据此实施方案，顶盖结构中的每个纳米孔变成可并行光学解析的独立DNA易位位点(～1M/mm2)。此外，应了解各种电位可施加于装置两端来控制DNA易位。举例来说，如下文更详细描述，可施加三个或更多个电位：沿着纳米通道；在纳米通道与等离子读出结构之间；以及在等离子读出结构上方以提供DNA易位的精细控制。
图20A-20B描绘根据本公开的一个实施方案的DNA操控的示例性方法。DNA从左侧的储槽(未展示)进入纳米通道并且在纳米通道中由于动力学而解开。示出三种大小的二氧化硅纳米颗粒(灰度区分)来代表NP大小的分散度。NP形成紧密堆积的准六角形栅格，此栅格受到由于大小分散度引起的空间效应干扰，产生贯穿顶盖的一组不均匀曲折路径。由NP上的深色边界表示的ALD过程封闭整体纳米孔(如在ALD处理之后贯穿顶盖的蒸发率的急剧减少来证明)，由此产生与远场光学解析相容的其余纳米孔的密度。可控制ALD以使得大部分其余曲折纳米孔足够小以致于每次仅单一ssDNA链可穿过。最后，金属-绝缘体-金属(MIM)结构(在图20B中处于展开图中)将增强电磁场局部化并且提供单一碱基测量能力。
典型实验在图21-22中示出，其中含有DNA的溶液直接施加至纳米通道阵列的入口。染色(YoYo1)λDNA溶液施加至通道的一侧并且缓冲溶液(没有DNA)施加至另一末端。图22纳米通道中的DNA渗透。图23的图像示出在施加电压时DNA进入纳米通道，而图24示出在逆转电压时DNA从通道中移出。
为了进一步研究在本文描述的纳米通道中电场对于dsDNA行为的影响，我们监测ds-DNA的伸展。结果证明所施加电场导致带负电荷dsDNA朝向正触点移动。一些DNA分子似乎被卡在阻断通道中并且积聚。DNA移动方向上的所施加电场使分子朝向正电极伸展几十μm(图25)。而相反方向上的电场将DNA压缩至2μm(图26)。图27示出的数据证明可使用本文描述的纳米通道通过在装置两端施加不同电位来实现DNA移动和伸展。这使得使用者能够通过选择电位的适当方向和施加电压来控制碱基间隔。
本领域技术人员熟悉制备DNA文库供测序的各种方法。可单独或组合使用的示例性方法和可购得试剂盒包括用于纯化dsDNA的Qiagen DNA分离试剂盒和用于ssDNA分离的Promega ReadyAmp试剂盒。长ssDNA分离可使用碱处理、中和pH和使用优化甲酰胺缓冲液来维持单链状态来执行。市售试剂盒还可从Promega获得。或者，不对称PCR可用于产生ssDNA。存在描述通过不对称LATE-PCR来产生ssDNA的许多出版物50,51，并且这是产生ssDNA的稳健简单方法。或者，可能需要首先产生10-20kb的测序文库并且用不对称引物比率来扩增文库。然后，ssDNA可在施加至芯片之前分离。纳米通道芯片可用50％甲酰胺并且在高温下运作以促进ssDNA进入通道。由于熵力，ssDNA应沿着通道伸长而没有次级结构。
作为不对称PCR的替代方案，还可使用50％生物素化引物来捕获扩增文库片段。为了分离ssDNA，片段可用链霉抗生物素蛋白涂布珠粒来捕获。含有单一生物素化引物和单一非生物素化引物的文库分子可用0.1M NaOH洗涤从珠粒上洗脱。然后将上清液的pH中和，并且将ssDNA片段加载至具有50％甲酰胺缓冲液的纳米通道中。另一个方法涉及纳米通道中的外切核酸酶消化。使用此方法，可负载具有最小文库制备的非常长(多达50kb)片段。
如上所述，目前描述方法能够产生多层级(即多层)纳米通道。图28和29描绘经工程化具有定位在正交方向上的不同层的两层纳米通道。使用两层纳米通道允许在纳米孔附近可控制地引入外切核酸酶，诸如T7外切核酸酶(5’->3’外切核酸酶)，以便消化单链dsDNA。在外切核酸酶消化一个链之后，ssDNA相对抵抗外切核酸酶活性。这使得纳米通道中的ssDNA具有3’末端来引入纳米孔中。然后，3’末端可行进穿过曲折纳米孔，使得能够使用以下描述方法来解析序列。
根据各种实施方案，本文描述纳米通道使得dsDNA和/或ssDNA能够随机移动穿过纳米通道顶盖中的曲折纳米孔。在一些实施方案中，可能需要优化此易位以确保沿着纳米通道的所需空间密度(例如，～1μm-1)以允许对个别纳米孔进行远场光学拾取。
我们的初步数据示出DNA经由顶盖中的孔从纳米通道中移出。DNA从纳米通道中逸出优选在通道被屏障中断时发生，如图30-32展示，其中图31是展示纳米通道内的屏障处的DNA积累的图像，并且图32是展示DNA穿过屏障移动的图像。因此，在一些实施方案中，可能需要在通道中构建屏障。在一些实施方案中，可能需要这些屏障具有不同厚度。举例来说，一种设计可在纳米通道的开始处具有较薄屏障以及朝向末端的较厚屏障(参见，例如，图30)。
根据各种实施方案，可施加多个电压以影响易位。如图21-32示出，电压常规沿着纳米通道施加以控制λDNA的位置和构象。另外，并且如图33中示出，可能需要向纳米等离子结构添加偏压，并且向位于等离子结构上方的流体体积中的透明导电层[铟锡氧化物(ITO)]添加独立电压。所有这些可为具有DC偏压的AC电压。在电气方面中，此为四终端装置，使我们能够控制穿过曲折纳米孔的易位。
转向图34，本公开还涵盖完全整合芯片实验室设计，其中单一装置或“芯片”将目前描述结构经由流动均化通道来流体连接，所述通道能够将本文描述的纳米通道与用于制备样品的结构，包括，如果需要，微通道大小的结构加以连接。
作为当前优选实施方案的代表的本文所述的具体方法和组合物是示例性的，并且不旨在限制本发明的范围。其它目标、方面和实施方案将被本领域技术人员在考虑本说明书后想到，并且涵盖于如权利要求书范围定义的本发明的精神内。对于本领域技术人员将显而易见的是，本文所公开的发明可在不背离本发明的范围和精神的情况下做出不同的替代和修改。本文中适当地说明性地描述的发明可在缺少在本文中并未具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制的情况下实践。本文说明性描述的方法和过程适当地可以不同步骤顺序来实施，并且其不一定限制在本文中或权利要求书中指示的步骤顺序。除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述/该(the)”包括复数指代物。
参考文献：在本文中引用或提到的所有专利和公布指示本发明所属领域的技术人员的技能水平，并且每个这类引用专利或发布通过引用并入本文，其引用程度如同它已经全部个别地以引用方式并入一样或全部在本文中阐明一样。申请人保留将来自任何这类引用专利或公布的任何和所有材料和信息在实体上并入本说明书的权利。
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Claims (37)

1.一种用于形成供操控目标长链分子的装置的方法，其包括：
提供纳米通道，所述纳米通道具有共同多孔顶盖，所述顶盖包括多个曲折纳米孔；
经由共形原子层沉积(ALD)将所述多孔顶盖中的所述纳米孔中的一些加以密封，
其中未密封纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析，和其中所述未密封纳米孔包含一系列纳米孔大小；和
将场增强结构沉积于所述纳米通道的所述顶盖上，其中所述场增强结构是等离子或极化声子结构。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括经由化学气相沉积(CVD)在所述顶盖上形成一个层。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述未密封纳米孔中的至少一个的大小使得能够以一次一个的方式将单一长链分子易位。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述场增强结构与所述纳米孔自动对齐。
5.如权利要求1所述的方法，其还包括形成与所述场增强结构间隔开的额外光学透明层。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述场增强结构是金属-绝缘体-金属(MIM)结构。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述MIM结构通过各向异性和各向同性沉积过程的组合来沉积。
8.如权利要求6所述的方法，其还包括形成与所述MIM结构间隔开的额外光学透明层。
9.如权利要求1所述的方法，其还包括在密封所述纳米孔中的一些之前，提供接触所述多孔顶盖的覆膜。
10.如权利要求9所述的方法，其还包括在密封所述纳米孔中的一些之前，在所述覆膜中制造纳米孔。
11.如权利要求1所述的方法，其中提供具有多孔顶盖的纳米通道的步骤包括：
在衬底上沉积感光膜堆叠；
在所述膜堆叠上形成图案；
沉积多个二氧化硅纳米颗粒以在所述图案上形成包括具有顶盖的通道的结构；
在保持由所述多个二氧化硅纳米颗粒形成的所述结构的同时，移除所述图案；并且
保持由所述多个二氧化硅纳米颗粒形成的所述结构。
12.一种用于长链分子操控的装置，其包括纳米通道，所述纳米通道具有部分密封多孔顶盖，所述顶盖包括多个曲折纳米孔，其中所述曲折纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析，和其中未密封纳米孔包含一系列纳米孔大小，并且其中将场增强结构沉积于所述纳米通道的所述顶盖上，其中所述场增强结构是等离子或极化声子结构。
13.如权利要求12所述的装置，其还包括整合在所述曲折纳米孔顶上的覆膜。
14.如权利要求13所述的装置，其中所述覆膜包括所制造纳米孔。
15.如权利要求12所述的装置，其中所述场增强结构与未密封曲折纳米孔中的至少一些对齐。
16.如权利要求14所述的装置，其中所述场增强结构与所制造纳米孔中的至少一些对齐。
17.如权利要求12所述的装置，其中所述场增强结构是金属-绝缘体-金属(MIM)结构。
18.如权利要求12所述的装置，其还包括与所述多孔顶盖间隔开的光学透明层。
19.一种用于操控目标长链分子的方法，其包括：
提供纳米通道，所述纳米通道具有部分密封多孔顶盖，所述顶盖包括多个暴露未密封孔和多个曲折纳米孔；
将包括目标分子的样品引入所述纳米通道中；
在所述目标分子行进穿过所述纳米通道之前和/或之后，允许所述目标分子行进穿过所述部分密封多孔顶盖中的所述未密封孔和穿过所述曲折纳米孔，
其中所述曲折纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析，和其中未密封纳米孔包含一系列纳米孔大小；和
将场增强结构沉积于所述纳米通道的所述顶盖上，其中所述场增强结构是等离子或极化声子结构。
20.如权利要求19所述的方法，其中将所述样品引入所述纳米通道中是通过以下过程来实现的：将所述样品安置于所述顶盖上，由此使得所述目标分子能够在行进穿过所述纳米通道之前行进穿过所述曲折纳米孔。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述目标分子经由所述顶盖离开所述纳米通道，由此迫使所述目标分子在行进穿过所述纳米通道之后行进穿过所述曲折纳米孔。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述场增强结构至少部分地与所述未密封孔对齐。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述场增强结构是金属-绝缘体-金属结构。
24.一种用于增强从基于纳米孔的装置洗脱的样品的可检测性的方法，其包括将场增强结构沉积在基于纳米孔的装置上，其中所述基于纳米孔的装置包括多个纳米孔，所述纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析，其中未密封纳米孔包含一系列纳米孔大小，和其中所述场增强结构是等离子或极化声子结构。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述场增强结构与所述基于纳米孔的装置中的可接近孔自动对齐。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述场增强结构与所制造纳米孔装置中的可接近孔对齐。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述场增强结构是金属-绝缘体-金属(MIM)结构。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述场增强结构是局部金属结构。
29.一种用于使用表面增强相干反斯托克斯拉曼散射(SECARS)来检测长链聚合物分子中的个别部分的远场光学方法，其中空间解析度通过场增强结构的存在来实现，其中所述场增强结构是等离子或极化声子结构并且与多个曲折纳米孔中的至少一个对齐，其中所述曲折纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析，和其中未密封纳米孔包含一系列纳米孔大小。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述场增强结构是与曲折纳米孔对齐的金属-绝缘体-金属(MIM)结构。
31.如权利要求29所述的方法，其中两个窄带激光源入射于所述场增强结构的一侧并且所述SECARS信号从所述场增强结构的相反侧检测，从而减少弹性散射至检测系统中的光。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述场增强结构是金属-绝缘体-金属(MIM)结构。
33.如权利要求29所述的方法，其包括第一窄带激光和第二宽频带激光，其中第二宽频带激光的带宽足以横跨所有待检测部分的拉曼振动频率。
34.一种用于使用表面增强相干反斯托克斯拉曼散射来检测长链聚合物分子中的个别部分的远场光学方法，其中空间解析度通过场增强结构的与曲折纳米孔对齐的结构来实现并且散射信号通过所述分子的声子激发来增强，其中所述曲折纳米孔是多个曲折纳米孔中的一个，所述曲折纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析，其中未密封纳米孔包含一系列纳米孔大小，和其中所述场增强结构是等离子或极化声子结构。
35.一种用于使用荧光来检测长链聚合物分子中的个别部分的远场光学方法，其中空间解析度通过场增强结构的与曲折纳米孔对齐的结构来实现，其中所述曲折纳米孔是多个曲折纳米孔中的一个，所述曲折纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析，其中未密封纳米孔包含一系列纳米孔大小，和其中所述场增强结构是等离子或极化声子结构。
36.一种用于形成供操控目标长链分子的装置的方法，其包括：
提供曲折纳米孔的层；
改变所述曲折纳米孔以调整目标分子的易位速度，
其中所述曲折纳米孔的密度使得能够对个别纳米孔进行光学解析，和其中未密封纳米孔包含一系列纳米孔大小；以及
将场增强结构沉积于所述装置上，其中所述场增强结构是等离子或极化声子结构。
37.如权利要求36所述的方法，其中改变所述曲折纳米孔的方法包括调整外部可接近的所述曲折纳米孔的一部分的大小。
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Chen et al..DNA translocation through an array of kinked nanopores.《nature materials》.2010,第9卷(第8期),667-675. *
DNA translocation through an array of kinked nanopores;Chen et al.;《nature materials》;20100723;第9卷(第8期);667-674 *

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