CN106248576A - 表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法 - Google Patents
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Abstract
表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,涉及液体样品检测。具体步骤:1)制备表面不对称微粒探针;2)在载玻片上刻蚀两个样品池,制成样品片,将样品片和盖玻片经食人鱼溶液浸泡、双蒸水润洗干净、氮气吹干;3)将探针分散于待测液体样品中;4)观察样品池的准备;5)图像的获取;6)图像处理和数据分析;7)回收样品片。去除了机械外力作用和影响,对样品干扰小;装置搭建和操作简单;测试样品仅需μL量级,测试微粒探针用量少;优化了非圆形图像的分析和数据处理;检测精度高,检测信息量更丰富,能够实现样品的区域性性质分辨。可实现样品用量经济、适用性好、操作简单、分析自动、精密度高。
Description
技术领域
本发明涉及液体样品检测,具体是涉及一种表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法。
背景技术
包括粘度、粘弹性等的液体流变学特性是应用最广泛的液体物化特性参数之一,可以用来辨别材料特性、预测材料功能;结合时间也可以反应物质的化学反应过程、温度变化过程、相变过程等;适度的流变学特性还可以促进生产效率、增强产品功能。生活中常见的液体类物质包括油漆、化妆品、乳液、食品类、医药类样品等,在其生产的不同阶段都需检测其流变学特性作为产品质量控制的手段之一。目前常用传统机械方法进行旋转测量、振荡测量等给出流动和粘度曲线、时间依赖性、频率依赖性等,测试系统包括同心圆筒、平行板、锥板等。但传统机械方法存在以下不足:一是样品用量大(几至几十毫升),不适用于高价值样品或尚不能批量生产的产品;二是机械方法外力作用较大,对于易破损样品损伤大;三是有些样品的性质内部差异较大,传统方法测的平均值无法反映实际微观性质。
已有一些基于微米或纳米粒子的探针光学成像技术应用于流体科学、生命科学及其它相关学科的前沿研究,依据布朗热运动理论,建立了微粒探针与流体流变学性质的数学关联(T.G.Mason,K.Ganesan,J.H.van Zanten,et al.Phy.Rev.Lett.,79:3282-3285;M.L.Gardel,M.T.Valentine,J.C.Crocker,et al.Phy.Rev.Lett.,91:158302)。理论上的壁面效应也仍适用(M.Lisicki,B.Cichocki,S.A.Rogers,et al.Soft Matter,2014,10:4312-4323)。专利CN1891720A,CN102071018B,CN103374352A等提出了纳米微粒和微球生物荧光探针的制备方法,做了有益尝试。然而这些方法采用的粒子均为普通球状微粒,不能够观察到转动,且在液体样品性质检测的精密度上有待提高。以金属半壳修饰荧光微粒后,其光亮度受金属半壳遮挡能够随转动不断变化,借助光亮度的变化实现对液相粘度的分辨(C.J.Behrend,J.N.Anker,R.Kopelman,Appl.Phy.Lett.,84:154-156)。使用尺寸合适的荧光球状微粒时,在光学显微镜下随本体转动呈现可分辨的不同形状,如蛾眉月、凸月、残月等。借助月相反映出粒子的三维方位,进而综合平动和转动,可以更精准地推断出液体样品的流变学特性(S.M.Anthony,L.Hong,M.Kim,et al.Langmuir,22:9812-9815)。对微粒动态的描述需要能够较高效率地分析处理非圆形图像,但当前所用方法仍较为繁琐,且目前未有规则统一、较为标准、易于比较的测定方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足,本发明提供一种可实现样品用量经济、适用性好、操作简单、分析自动、精密度高的表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法。
本发明的具体步骤如下:
1)制备表面不对称微粒探针,具体方法如下:将微米级球形粒子的水相分散液滴加于基底片上的Teflon环内,蒸发液相后,得到紧密组装的微粒单层;将基底片和微粒单层蒸镀金属薄膜后,超声,使微粒从基底片上脱落,再依次经离心、乙醇洗涤、再离心、双蒸水洗涤,重新得到表面不对称微粒探针(以下简称探针)的水相分散液;
2)在载玻片上刻蚀两个样品池,制成样品片,将样品片和盖玻片经食人鱼溶液浸泡、双蒸水润洗干净、氮气吹干;
3)将探针分散于待测液体样品中;
4)观察样品池的准备,具体方法如下:向步骤2)得到的样品片样品池内加入步骤3)得到的含探针的待测液体样品中,盖上盖玻片,以密封胶封装盖玻片四周形成2个装满待测液体样品的密闭观察区域;
5)图像的获取:将步骤4)中的样品片固定在光学显微镜下并找到数量适宜的探针聚焦,可以清晰看到单个探针及其边界,用照相机连续拍摄2000~3000帧图像,再写入PC,每个样品池拍摄4个样品点,以获得足够多的粒子运动图像;
6)图像处理和数据分析:将步骤5)得到的图像序列以ImageJ和MATLAB程序进行追踪处理及数据分析后,得到待测液体样品的流变学性质;
7)回收样品片:以丙酮浸泡+超声处理使密封胶溶胀并脱离,样品片再经食人鱼溶液浸泡、双蒸水润洗干净、氮气吹干,可重复使用。
在步骤1)中,所述球形粒子可选自球形聚苯乙烯粒子、球形二氧化硅粒子、球形PMMA粒子等中的一种;球形粒子的直径可为2~4μm;所述基底片可采用玻璃载玻片或硅片;所述蒸发液相可在室温下蒸发液相;所述将基底片和微粒单层蒸镀金属薄膜可将基底片和微粒单层置于物理气相沉积或溅射镀膜设备中蒸镀金属薄膜;所述蒸镀金属薄膜的厚度可为20~30nm,所述蒸镀金属薄膜的金属可采用金或铂等贵金属;所述超声可在蒸馏水中超声10~30min。
在步骤2)中,所述两个样品池的尺寸可为10mm×10mm×(20~40)μm、10mm×10mm×(40~100)μm或Φ10mm×(40~100)μm;此种设计能将探针限定于近二维运动;所述盖玻片可采用(15~20)mm×(15~20)mm的标准正方形盖玻片。
在步骤3)中,所述待测液体样品可为蒸馏水、丙三醇、聚乙二醇、不溶解微粒、蒸镀薄膜、不与探针进行化学反应的液相样品、不与探针进行化学反应的药品等中的至少一种;所述将探针分散于待测液体样品中的具体方法可为:取探针加入待测液体样品至低浓度分布,所述低浓度分布是浓度以最终能覆盖观察样品池底面1%~2%的面积。
在步骤4)中,所述含探针的待测液体样品的加入量最好每一样品片样品池加80~120μL;所述密封胶可采用环氧树脂AB胶类化学稳定性较好、凝固较快的相变胶。
在步骤5)中,所述光学显微镜可采用立式荧光显微镜、倒立式荧光显微镜、立式白光显微镜或倒立式白光显微镜等;所述光学显微镜下的光学放大倍数可为20~50倍;所述连续拍摄的拍摄速度可为6~20fpm;所述写入PC可以.avi,.seq,.GIF等与ImageJ软件和MATLAB兼容的格式。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果是:
去除了机械外力作用和影响,对样品干扰小;装置搭建和操作简单;测试样品仅需μL量级,测试微粒探针用量少;优化了非圆形图像的分析和数据处理;检测精度高,检测信息量更丰富,能够实现样品的区域性性质分辨。
本发明可以实现:
(1)表面不对称微粒探针的批量制备,可以根据应用环境的改变选择微粒探针的材质。
(2)测试样品池的搭建和重复使用。
(3)简单易行的图像获得和分析。
(4)以少数探针获得相对精准的液体样品流变学性质分析。
附图说明
图1是实施例1中表面不对称微粒探针的制备流程图。图中:1是Teflon环,2是硅片基底,3是未修饰前的微粒,4是金属沉积,5是重新分散后的探针。
图2是实施例1中制得的探针的扫描电子显微镜图。
图3是实施例2中样品池和探针观测装置搭建示意图。在图3中:5是分散在其中的探针,6是样品片上刻蚀的两个凹槽样品池。
图4是实施例2中探针的光学图像。每两图之间间隔时间10s。
图5是实施例1中制得的探针的光学图像隐含的两个不同方位示意图。在图5中,其中7是探针的未修饰荧光部分在光学显微镜下形成的弯月形封闭区域,θ是天顶角,表明未修饰荧光部分-金属半壳部分的分隔平面8与图像平面9的夹角;φ是方位角,表明弯月形封闭区域在图像平面9中的方向。
图6是实施例3中探针光学图像和利用ImageJ功能“Fit Ellipse”实现的在月相图形上拟出的椭圆(实线框)。
图7是实施例3中探针月相图形中心和体中心几何关系的示意图。在图7中:空白区域是粒子荧光部分,阴影线区域是金属半壳部分,φ是方位角,θ是天顶角,(x,y)是月相图形7的亮度加权中心,(xC,yC)是实际体中心投影,d是两中心之间距离。
图8是实施例4中探针实际体中心的平动均方位移随运动时间的变化。
图9是实施例4中探针的转动均方位移随运动时间的变化。
图10是实施例5中探针实际体中心的平动均方位移随运动时间的变化。
图11是实施例5中探针的转动均方位移随运动时间的变化。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例的具体步骤如下:
1)制备表面不对称微粒探针:将微米级球形粒子的水相分散液滴加于基底片2上的Teflon环1内,蒸发液相后,得到紧密组装的微粒单层3;将基底片2和微粒单层3蒸镀金属薄膜4后,超声,使微粒从基底片2上脱落,再依次经离心、乙醇洗涤、再离心、双蒸水洗涤,重新得到表面不对称微粒探针5(以下简称探针)的水相分散液;所述蒸发液相可在室温下蒸发液相;所述将基底片2和微粒单层3蒸镀金属薄膜4可将基底片2和微粒单层3置于物理气相沉积或溅射镀膜设备中蒸镀金属薄膜4;所述超声可在蒸馏水中超声10~30min。
2)在载玻片上刻蚀两个样品池6,制成样品片,将样品片和盖玻片经食人鱼溶液浸泡、双蒸水润洗干净、氮气吹干;所述两个样品池6的尺寸可为10mm×10mm×(40~100)μm,或Φ10mm×(40~100)μm;此种设计能将探针限定于近二维运动。
3)将探针5分散于待测液体样品中:取探针5加入待测液体样品至低浓度分布,所述低浓度分布是浓度以最终能覆盖观察样品池6底面1%~2%的面积。
4)观察样品池的准备:向步骤2)得到的样品片样品池6内加入步骤3)得到的含探针的待测液体样品中,盖上盖玻片,以密封胶封装盖玻片四周形成2个装满待测液体样品的密闭观察区域;所述含探针的待测液体样品的加入量最好每一样品片样品池加80~120μL。
5)图像的获取:将步骤4)中的样品片固定在光学显微镜下并找到数量适宜的探针5聚焦,可以清晰看到单个探针及其边界,用照相机连续拍摄2000~3000帧图像,以.avi,.seq,.GIF等格式写入PC,每个样品池拍摄4个样品点,以获得足够多的粒子运动图像;所述光学显微镜下的光学放大倍数可为20~50倍;所述连续拍摄的拍摄速度可为6~20fpm。
6)图像处理和数据分析:将步骤5)得到的图像序列以ImageJ和MATLAB程序进行追踪处理及数据分析后,得到待测液体样品的流变学性质;
7)回收样品片:以丙酮浸泡+超声处理使密封胶溶胀并脱离,样品片再经食人鱼溶液浸泡、双蒸水润洗干净、氮气吹干,可重复使用。
以下给出具体实施例。
实施例1
表面不对称微粒探针的制备
将清洗干净、氮气吹干的硅片和内径12mm、高度3~5mm的Teflon环用长尾夹夹成一个液池,将市售的粒径4μm聚苯乙烯荧光粒子分散液直接或浓缩至10%(w/V)后,滴加在液池内硅片基底上,室温下静置于水平放置的蒸发皿内,待液体全部蒸发即组装成粒子单层模版。形成的单层模版及基底在物理气相沉积中依次沉积5nm厚的钛薄膜、25nm厚的金薄膜实现表面不对称。取出,洗耳球轻轻吹去可能的杂质,在清洗干净的旋盖小玻璃瓶中放适量蒸馏水没过基底硅片,将其置于超声槽中超声。5~10min后,大部分粒子可以从硅片基底上脱离下来。将液体分批转移至2.0mL的离心管内分离粒子并依次用乙醇、双蒸水洗涤。最后仍集中重新分散于旋盖小玻璃瓶内2~5mL的双蒸水中,4℃保存备用。假定60%的基底表面覆盖率和80%的回收率,一次可获得~4×106个探针。
图1展示了探针制备流程。图2是所制备探针的扫描电镜图像,平均粒径4μm,探针表面明暗对比度表明了金属半壳薄膜在聚苯乙烯微粒上的存在。
实施例2
探针观测装置的搭建和显微镜观测
取适量实施例1中的分散液,混入不同体积的丙三醇,配制成不同浓度的丙三醇水溶液,辅以振荡使得溶液和探针混合均匀。将样品片、盖玻片以食人鱼溶液浸泡、双蒸水润洗干净、氮气吹干并放入铺垫一层擦镜纸的培养皿。样品片上刻蚀有2个边缘间隔至少20mm、尺寸为10mm×10mm×100μm的凹槽样品池。以移液枪添加分散有探针的丙三醇水溶液至两个样品池中,各80~120μL,然后用镊子缓慢倾斜地盖上盖玻片以避免气泡的产生。以软纸巾借助毛细作用仔细吸去周边多余液体,用环氧树脂AB胶密封边缘,整个样品片装置置于显微镜载物台上以备观测。静置1h,微粒在样品池内达到动态平衡,本实施例中微粒稳定于样品池底表面附近,与底表面的距离由微粒与液相相对密度、两个表面电荷分布决定,一般在200~300nm左右。使用荧光显微镜,在低倍下寻找到合适区域,换至40×或50×物镜聚焦使探针图像清晰,图像区域内一般有10个以下探针,面积覆盖率约1%,理论上仅需实施例1中制备所得探针总数量的1%~2%。采用UEye CMOS照相机以10帧每s的速度连续拍摄2000帧,存为.avi文件。然后切换至不同位置及第二个样品池,依次各拍摄2000帧连续图像序列。
图3展示了样品池和观测装置搭建的示意图;
图4展示了三个探针在三个时刻A、B、C、每两时刻之间间隔10s的光学图像。
实施例3
非圆形的探针图像分析
首先界定探针在照相机图像中呈现的月相图形和其在三维空间中方位的关系。如图5所展示,天顶角θ与探针呈现出的月相图形形状即总亮度相关,方位角φ则为探针月相图形7的两个尖端连线与图像平面9横轴的夹角。
为减少图片中的干扰因素,首先将图片转换为灰度、去噪、背景分离,而后逐行逐列对每一像素的亮度值进行鉴定。利用MATLAB依次分析每个图像序列内的每帧图片,确定每个探针月相图形的总亮度、其中心在图像平面内的方位。像素亮度在阈值以上的认为是探针月相图形的一部分,计入总亮度,并按照月相图形内各像素亮度计算出其加权中心(x,y)。阈值定为该帧内该探针的月相图形内最大亮度像素亮度的5%。
探针上沉积的金属可以认为接近完美半壳,θ与月相图形总亮度的关系如式一所示:
式一:I=A×(1+cosθ)
式一中:I是某一个探针在图像序列中某一帧图片中呈现的月相图形的总亮度,由上述MATLAB图像处理分析得出;A是探针呈现满月时月相图形亮度的一半,或者呈现半月时的月相图形亮度值;θ是此月相图形的天顶角,将依据式一利用I和A的数值计算得出。
方位角由ImageJ的“Fit Ellipse”功能给出。如图6所示,此功能给出与月相图形最大重合的椭圆。椭圆长轴与月相图形两尖端的联线平行,其与图像平面形成的方位角即等同于微粒月相图形在整个图像平面中的方位角φ,再由ImageJ的“Analyze Particles”功能读出其数值。
最后基于天顶角和方位角,根据几何关系原理算出探针的实际体中心投影(xC,yC)。图7说明了探针三维形体与其二维图像的几何关系。
实际体中心投影与月相图形加权中心的关系如式二所示:
式二:
式二中:d为月相图形中心(x,y)和实际体中心投影(xC,yC)之间的距离,a是探针半径,θ是天顶角,φ是方位角。
实施例4
运动轨迹(均方位移)数据归纳与计算
利用MATLAB数据分析程序,计算出从初始状态t=0开始不同运动时间探针的均方平动和转动位移(平均值)。运动时间选取为0s、0.1s、0.2s、0.3s….4.0s。每个样品池中每个测试点在图像中一般展现5个以下探针,为增强系统统计性和测量结果准确性,采用先计算每个探针的时间平均再综合起来进行探针间的系综平均。
丙三醇水溶液为简单黏性液体,理论上探针在其中的热运动均方位移与运动间隔时间有线性关系,如式三所示:
式三:
式三中:MSD表示均方位移,下标的t表示平动,r表示转动,Dt是平动扩散系数,Dr是转动扩散系数,Δt是运动时间,f(a/z)、g(a/z)为无量纲壁效应,a是探针半径,z是探针体中心距样品池底面距离。当a/z→0时,f、g→1。对于4μm探针在类似实施例1系统中,z为2.2-2.3μm,f一般在0.45,g一般在0.8。
利用上述式三,在图8和9中综合了20个探针在55.8wt%丙三醇水溶液中热运动的时间-系综平均。图8是平动均方位移随时间的变化,图9是转动均方位移随时间的变化。
实施例5
按照上述实施例1-4的方法和步骤,不同的是丙三醇水溶液浓度为38.7wt%,图10和11中综合了20个探针在38.7%丙三醇水溶液中热运动的时间-系综平均。图10是平动均方位移随时间的变化,图11是转动均方位移随时间的变化。
式三中均方位移与时间呈现线性关系,该线性关系决定的斜率与液体的粘度相关,如式四所示:
式四:
式四中,Dt是平动扩散系数,Dr是转动扩散系数,kB是玻尔兹曼常数,T是测试时液体样品绝对温度,μ是该液体样品粘度,a是探针半径。实验中探针所处温度在25±2℃,利用式四计算待测液体粘度,并将上述实施例4和5的结果综合于表1。
表1
理论上探针越接近壁面,受拖拽作用越大,而转动又比平动受拖拽作用相对小,所以探针转动表观粘度比平动表观粘度要小得多。本发明基于表面不对称微粒探针的检测方法比机械测量法能获得更多的液体样品信息。
本发明在显微镜下连续成像,然后经过图像处理、利用微粒的光学成像不对称性同时获得微粒的平动和转动动力学行为,从而推出液体介质的流变学性质,增加检测准确性;进而用生物大分子修饰表面,可利用化学性质不对称性对转动的影响检测大分子间作用力。该方法样品用量低、操作简便、图像处理和数据处理自动化高、精确性好,更适用于高价值的液体样品,且原位检测解决了机械粘度计、流变仪等传统方法主要检测平均性质、对易破损液体样品损伤较大等局限和缺点,是一种高效率、高准确性的检测方法。
Claims (10)
1.表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于其具体步骤如下:
1)制备表面不对称微粒探针,具体方法如下:将微米级球形粒子的水相分散液滴加于基底片上的Teflon环内,蒸发液相后,得到紧密组装的微粒单层;将基底片和微粒单层蒸镀金属薄膜后,超声,使微粒从基底片上脱落,再依次经离心、乙醇洗涤、再离心、双蒸水洗涤,重新得到表面不对称微粒探针的水相分散液;
2)在载玻片上刻蚀两个样品池,制成样品片,将样品片和盖玻片经食人鱼溶液浸泡、双蒸水润洗干净、氮气吹干;
3)将探针分散于待测液体样品中;
4)观察样品池的准备,具体方法如下:向步骤2)得到的样品片样品池内加入步骤3)得到的含探针的待测液体样品中,盖上盖玻片,以密封胶封装盖玻片四周形成2个装满待测液体样品的密闭观察区域;
5)图像的获取:将步骤4)中的样品片固定在光学显微镜下并找到数量适宜的探针聚焦,可以清晰看到单个探针及其边界,用照相机连续拍摄2000~3000帧图像,再写入PC,每个样品池拍摄4个样品点,以获得足够多的粒子运动图像;
6)图像处理和数据分析:将步骤5)得到的图像序列以ImageJ和MATLAB程序进行追踪处理及数据分析后,得到待测液体样品的流变学性质;
7)回收样品片:以丙酮浸泡+超声处理使密封胶溶胀并脱离,样品片再经食人鱼溶液浸泡、双蒸水润洗干净、氮气吹干,可重复使用。
2.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤1)中,所述球形粒子选自球形聚苯乙烯粒子、球形二氧化硅粒子、球形PMMA粒子中的一种;球形粒子的直径可为2~4μm。
3.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤1)中,所述基底片采用玻璃载玻片或硅片;所述蒸发液相可在室温下蒸发液相。
4.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤1)中,所述将基底片和微粒单层蒸镀金属薄膜是将基底片和微粒单层置于物理气相沉积或溅射镀膜设备中蒸镀金属薄膜;所述蒸镀金属薄膜的厚度可为20~30nm,所述蒸镀金属薄膜的金属可采用金或铂等贵金属;所述超声可在蒸馏水中超声10~30min。
5.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤2)中,所述两个样品池的尺寸为10mm×10mm×(20~40)μm、10mm×10mm×(40~100)μm或Φ10mm×(40~100)μm;所述盖玻片可采用(15~20)mm×(15~20)mm的标准正方形盖玻片。
6.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤3)中,所述待测液体样品为蒸馏水、丙三醇、聚乙二醇、不溶解微粒、蒸镀薄膜、不与探针进行化学反应的液相样品、不与探针进行化学反应的药品中的至少一种。
7.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤3)中,所述将探针分散于待测液体样品中的具体方法为:取探针加入待测液体样品至低浓度分布,所述低浓度分布是浓度以最终能覆盖观察样品池底面1%~2%的面积。
8.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤4)中,所述含探针的待测液体样品的加入量是每一样品片样品池加80~120μL;所述密封胶可采用环氧树脂AB胶类化学稳定性较好、凝固较快的相变胶。
9.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤5)中,所述光学显微镜采用立式荧光显微镜、倒立式荧光显微镜、立式白光显微镜或倒立式白光显微镜;所述光学显微镜下的光学放大倍数可为20~50倍。
10.如权利要求1所述表面不对称微粒探针应用于液体性质的原位检测方法,其特征在于在步骤5)中,所述连续拍摄的拍摄速度为6~20fpm;所述写入PC是以.avi,.seq,.GIF与ImageJ软件和MATLAB兼容的格式。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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