CN106190844A - 一种从太湖芦苇根系土中筛选溶藻菌并测定其溶藻效果的方法 - Google Patents

一种从太湖芦苇根系土中筛选溶藻菌并测定其溶藻效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明从太湖芦苇根系土中筛选溶藻菌并测定其溶藻效果的方法，属于蓝藻处理的微生物学领域。本发明提供了利用溶藻菌溶解铜绿微囊藻的方法。本发明从太湖芦苇根系土中分离纯化菌株，以铜绿微囊藻为实验原料，得到一株溶藻菌G6。在最佳条件下，溶藻菌G6对铜铝微囊藻的处理效果到达82％，溶藻效果显著，可以将太湖芦苇根系土作为新的溶藻菌菌种来源。

Description

一种从太湖芦苇根系土中筛选溶藻菌并测定其溶藻效果的 方法
技术领域
本发明属于蓝藻处理的微生物学领域，涉及一种从太湖芦苇根系土中筛选溶藻菌并测定其溶藻效果的方法。
背景技术
随着城市化进程的加快和工农业的快速发展，大量含氮、磷、钾的生活污水以及工农业废水排入河流湖泊，导致水体富营养化严重，大规模的蓝藻随之爆发。蓝藻不仅会破坏水体的生态平衡，消耗水中溶解氧，造成水体生物的死亡，还会分泌出能够威胁人类健康的物质—藻毒素。
控藻除藻的方法一般分为物理法、化学法和生物法。物理法包括絮凝、人工打捞、气浮除藻、超声波等，此方法操作简单见效快，二次污染少，但是无法从根源解决问题，需要大量人力物力；化学法是通过投加铜盐、高锰酸钾等化学试剂进行直接灭杀或者抑制，效果显著，但化学试剂强烈的杀伤性同样也会使原本的水生生物受到毒害；生物法是通过生物链或者种族竞争的方式对藻类进行控制，包括栽植高等水生植物，养殖吞食蓝藻的水生动物和浮游动物以及投加高效的溶藻菌种。
溶藻菌是通过直接或间接方式抑制或杀死藻类、溶解藻细胞。很多研究表明细菌对于藻类有抑制作用。《环境科学学报》2015年第35卷第3期692-698页报道了从水华爆发水体中分离获得了一株溶藻细菌，当菌体细胞的密度达到1011CFU·m L-1时,与藻作用18h藻细胞彻底失去活性。《微生物学通报》2016年43卷第3期495-503页报道了从富营养化水体中筛选出的溶藻菌在与藻共培养5天后对藻叶绿素a的抑制率为65％。本发明以太湖流域岸边的芦苇根系土壤为原料，从中筛选分离溶藻菌，以期对铜绿微囊藻有很好的抑制作用。
发明内容
本发明的目的是：以太湖流域岸边的芦苇根系土壤为原料，从中筛选分离出溶藻菌G6，以期对铜绿微囊藻有很好的抑制作用。
用接种环挑出一株斜面培养基上的G6菌种接种于新鲜液体培养基内，在温度28℃，转速为130r/min的培养箱中振荡培养，按照1:2-1:50的菌藻比加入到初始叶绿素a为50mg/m3-100mg/m3的铜绿微囊藻溶液，于温度27℃，光照强度2500lux，分别在不同光暗周期，不同菌龄，不同溶藻作用方式下进行菌藻反应，手动摇匀，每天测定叶绿素含量，测定叶绿素的降解率。
本实验所述的不同光暗周期分别是：①0h:24h；②24h：0h；③12h：12h。本实验所述的不同菌龄分别是：①迟滞期；②对数期；③稳定期；④衰亡期。本实验所述的不同溶藻作用方式分别是：①培养15-18h的对数期菌液；②将菌液①经经0.22μm滤膜过滤除菌；③收集②中滤膜，经无菌水洗涤3-4次，制备无菌水菌悬液；④将菌液①高温高压(121℃、1.1MPa)灭活处理25min。
本发明所用的细菌液体培养基组为鱼粉蛋白胨10g，酵母膏5个，氯化钠10g，蒸馏水1L，调制pH＝7.1，所用固体培养基再加上15g琼脂粉。
本发明所用的铜绿微囊藻培养基为：⑴7.5g/500mL NaNO3；⑵2g/500mLK2HPO4；⑶3.75g/500mLMgSO4·7H2O；⑷1.8g/500mLCaCl2·2H2O；⑸0.3g/500mL柠檬酸；⑹0.3g/500mL柠檬酸铁铵；⑺0.05g/500mLEDTANa2；⑻1.0g/500mL NaCO3；⑼微量元素，调节pH为7.1
本发明所述的微量元素为：①1.43g/500mLH3BO3；②0.93g/500mLMnCl2·4H2O；③0.11g/500mL ZnSO4·7H2O；④0.195g/500mL Na2MoO4·2H2O；⑤0.04g/500mL CuSO4·5H2O；⑥0.025g/500mLCo(NO3)2·2H2O
培养1L铜绿微囊藻培养基，将上述培养基分装在a、b、c三个锥形瓶中a、⑷+150mL蒸馏水；b、⑹+150mL蒸馏水；c、⑴+⑵+⑶+⑸+⑺+⑻+⑼+530mL蒸馏水，在121℃、1.1MPa灭活处理25min，等到上述三种溶液冷却后混合。
本发明的有益效果：
作为本发明的降解铜绿微囊藻的一种优选方法：培养18h对数期的G6菌液，以菌藻比1:10，在温度为温度27℃，光照强度2500lux，明暗周期12h:12h的光照培养箱中培养除藻的效果最好。
本发明的有益效果：
本发明以太湖岸边芦苇根系土作为筛菌原料，从中分离筛选出G6菌株，此菌株在最佳条件下对铜绿微囊藻的去除率达到82.3％，溶藻效果十分显著，同时为溶藻菌筛选提供了一个新的来源。
具体实施方案
1从太湖岸边挖出整颗芦苇，收集芦苇根系及其周围土壤，并于-4℃下保存。
2称取土壤样品和无菌水以1:10的比例混合，置于摇床，在130r/min转速、30℃下震荡6-7h，使得土壤与水完全混合。
3采用梯度稀释法稀释后进行平板涂布，倒置于30℃恒温培养箱中培养。选择不同的菌落分别用接种环划线分离培养2-3d，然后纯化培养3-4次，得到纯菌种用接种环接种于斜面培养基上保存，并命名为G1-G13。
4将G1-G13在液体培养基中分别培养18h后，以1:10的比例投加到已知叶绿素含量的新鲜铜绿微囊藻溶液中，待到溶液出现黄化后，测定溶液的叶绿素含量，算出藻的去除率，选取去除效果最好的一株菌作为后续研究的菌株。
菌株的分离筛选
1将放在冰箱内冷冻保存的土壤样品取出，待到室温后，按照1:9的比例，称取10g土与90mL无菌水混合于锥形瓶，放置于摇床，在130r/min转速、30℃下震荡6-7h，使得土壤与水完全混合。
2采用梯度稀释法稀释富集液，将稀释至10-1-10-10的稀释液吸取0.1mL至固体平面培养基上均匀涂布，倒置于30℃培养箱中培养2-3天，待到平板上长出明显的菌落。
3挑选出长势良好的不同菌落，分别用接种环划线分离培养2-3d，然后纯化培养3-4次，得到纯菌种用接种环接种于斜面培养基上保存，并命名为G1-G13。
4将G1-G13分别培养18h后，以1:10的比例投加到已知叶绿素含量的新鲜铜绿微囊藻溶液中，置于温度为温度27℃，光照强度2500lux，明暗周期12h:12h的光照培养箱中，待到溶液出现黄化后，测定溶液的叶绿素含量，算出藻的去除率，选取去除效果最好的一株菌G6作为后续研究的菌株。
5培养2天的G6菌长势良好，直接在1.5mm，白色，不透明，边缘光滑，表明凸起，有粘性。对G6菌进行革兰氏染色和生理生化特性研究，结果表明菌株为革兰氏阳性菌，接触酶、葡萄糖发酵、淀粉水解、产胺试验均为阳性，明胶水解、V.P试验、M.R试验、产硫化氢、葡萄糖氧化均为阴性。
以下提供本发明利用上述菌株G6处理铜绿微囊藻的5个实例案：
实施例1
从细菌斜面培养基中挑取一环菌接入装有100mL灭菌后的新鲜细菌液体培养基中，在温度为30℃，转速为130r/min的培养箱中振荡培养18h对数期，按照1:2的菌藻比，即将50mL菌液接种于100mL藻液中，藻液初始叶绿素a是94.5mg/m3，在温度为温度27℃，光照强度2500lux，明暗周期12h:12h的光照培养箱中培养，并且手动摇匀，每天测定叶绿素含量直至含量基本不变，去除率为41.5％。
实施例2
本实施例与实施例1不同的地方在于菌藻比不同.
从细菌斜面培养基中挑取一环菌接入装有100mL灭菌后的新鲜细菌液体培养基中，在温度为30℃，转速为130r/min的培养箱中振荡培养18h对数期，按照1:10的菌藻比，即将10mL菌液接种于100mL藻液中，藻液初始叶绿素a是94.5mg/m3，在温度为温度27℃，光照强度2500lux，明暗周期12h:12h的光照培养箱中培养，并且手动摇匀，每天测定叶绿素含量直至含量基本不变，去除率为41.5％。
实施例3
本实施例与实施例1和实施例2不同的地方在于初始浓度，光照周期不同，选定菌藻比1:10。
从细菌斜面培养基中挑取一环菌接入装有100mL灭菌后的新鲜细菌液体培养基中，在温度为30℃，转速为130r/min的培养箱中振荡培养18h对数期，按照1:10的菌藻比，即将10mL菌液接种于100mL藻液中，藻液初始叶绿素a是93.02mg/m3，在温度为温度27℃，光照强度2500lux，明暗周期分别为24h:0h、12h:12h、0h:24h的光照培养箱中培养，并且手动摇匀，每天测定叶绿素含量直至含量基本不变，去除率分别为44.1％，52.2％，39.6％，所以明暗周期为12h:12h时,溶藻效果最好。
实施例4
本实施例与实施例1、实施例2和实施例3不同的地方在于初始浓度，菌生长期不同，选定光照周期12h:12h，菌藻比1:10。
从细菌斜面培养基中挑取一环菌接入装有100mL灭菌后的新鲜细菌液体培养基中，在温度为30℃，转速为130r/min的培养箱中振荡培养迟滞期、对数期、稳定期、衰亡期的菌，按照1:10的菌藻比，即将10mL菌液接种于100mL藻液中，藻液初始叶绿素a是52.63mg/m3，在温度为温度27℃，光照强度2500lux，明暗周期12h:12h的光照培养箱中培养，并且手动摇匀，每天测定叶绿素含量直至含量基本不变，去除率分别为54.4％，75％，75％，50％，所以光暗周期为12h:12h时符合现实光照条件，效果也比较好。
实施例5
本实施例与实施例1、实施例2、实施例3和实施例4不同的地方在于初始浓度，不同的溶藻作用方式，选定光照周期12h:12h，菌藻比1:10，18h对数生长期。
从细菌斜面培养基中挑取一环菌接入装有100mL灭菌后的新鲜细菌液体培养基中，在温度为30℃，转速为130r/min的培养箱中振荡培养18h，本发明设置以下4种方式处理菌液：①培养18-24h的对数期菌液；②将菌液①经经0.22μm滤膜过滤除菌；③收集②中滤膜，经无菌水洗涤3-4次，制备无菌水菌悬液；④将菌液①高温高压(121℃、1.1MPa)灭活处理25min。按照1:10的菌藻比，即将10mL菌液接种于100mL藻液中，藻液初始叶绿素a是65.62mg/m3，在温度为温度27℃，光照强度2500lux，明暗周期12h:12h的光照培养箱中培养，并且手动摇匀，每天测定叶绿素含量直至含量基本不变，去除率分别为82％，82％，0％，82％，菌液、离心过滤液以及高压灭菌后的菌液均对藻有抑制作用。

Claims (2)

1.一种溶藻菌的分离方法其特征在于按照下述步骤分离：
①溶藻细菌的培养基组为鱼粉蛋白胨10g，酵母膏5个，氯化钠10g，蒸馏水1L，调制pH＝7.1，所用固体培养基再加上15g琼脂粉。
②称取土壤样品和无菌水以1:10的比例混合，置于摇床，在130r/min转速、30℃下震荡6-7h，使得土壤与水完全混合。
③采用梯度稀释法稀释后进行平板涂布，倒置于30℃恒温培养箱中培养。选择不同的菌落分别用接种环划线分离培养2-3d，然后纯化培养3-4次.
④菌株在液体培养基中培养18h按照1:10的接种量接种已知叶绿素含量的新鲜铜绿微囊藻溶液中，待到溶液出现黄化后，测定溶液的叶绿素含量，算出藻的去除率，选取去除效果最好的一株菌G6。
2.根据权利要求书1所述的溶藻方法，其特征在于按照下述步骤进行：将G6菌种接种于新鲜液体培养基内，在温度28℃，转速为130r/min的培养箱中振荡培养18h，按照1:10的菌藻比加入到初始叶绿素a为50mg/m3-100mg/m3的铜绿微囊藻溶液，于温度27℃，光照强度2500lux，光暗周期12h:12h，手动摇匀，每天测定叶绿素含量，得到的叶绿素的降解率最高。
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