CN106166328A - 一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法，该方法包括如下步骤：(1)、HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的红细胞混合混匀，混匀后肝肿瘤细胞密度为5×10⁶/ml，混合细胞在2-8℃条件下将运输至放疗科；(2)、将混合细胞放置于血液辐照容器，设置箱子距离辐照源为60cm，辐照面积为40×40cm²；使用医用直线加速器进行30Gy辐照，该直线加速器能量为6MeV；(3)、辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法分离肿瘤细胞株和红细胞。本发明的有益效果为：线性加速器30Gy有效且安全的灭活混杂在回收红细胞中的HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞并保存红细胞质量。

Description

一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体涉及一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法。

背景技术

术中自体血液回收方法有效节约血液资源，并大大减少异体输血反应，已广泛用于多种手术。但在肿瘤手术中的应用一直有争议，主要担心手术回收的血液含有肿瘤细胞，并经浓缩后回输给患者会引起肿瘤的转移。

仅仅使用自体血液回收机是不能完全去除回收血液中的肿瘤细胞。目前白细胞过滤器和γ射线辐照是研究最多的两种方法。但有报道肿瘤手术中回收血液混有的肿瘤细胞数量超过10⁷时，使用白细胞过滤器是不安全的。而术中肿瘤破裂就会引起回收血液的肿瘤细胞负荷大大增加，如超过2×10⁷/200ml。故在肿瘤手术中使用白细胞过滤进行自体血液回收仍然是不安全的。而有报道使用¹³⁷Cs血液辐照仪对回收含有肿瘤细胞的血液进行γ射线辐照，可以有效且安全的杀灭至少10log的肿瘤细胞。尽管如此，关于γ射线辐照仍有一些问题。因为γ射线源一般为¹³⁷Cs和⁶⁰Co，使用这些活性射线源有很多的安全问题：需要合适有效措施来保障活性射线源的放置的安全，防治非法分子盗取活性射线源严重危害公共安全；需要特殊的保护措施和检测方法来保障员工的身体安全。使用γ射线辐照的方法另外很大的缺陷就是很难普及和推广应用，因为它的安全问题及费用问题，很多医院是没有血液辐照仪的，只有少数的血液中心才可以获得。若使用γ射线辐照就需要外送至血液中心，这样会大大延长血液回收的时间。

众所周知X线直线加速器的主要用于肿瘤病人的放疗，而X线直线加速器是γ射线源最好的替代方法。目前在一些肿瘤医院，直线加速器也广泛的用于血液辐照。研究表明同剂量的X线辐照和¹³⁷Cs的γ辐照的生物作用是没有临床差异的，同样的最低25Gy可以有效预防输血相关性移植物抗宿主病，而不超过50Gy的剂量就不损伤血液细胞。但是X线直线加速器用于灭活回收血液中混有的肿瘤细胞没有研究过。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法，研究X线直线加速器灭活回收血液中混有的肝肿瘤细胞(HepG2,SK-Hep1,Huh7)的有效性，及对回收血液中红细胞质量的影响。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)、HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的红细胞混合混匀，混匀后肝肿瘤细胞密度为5×10⁶/ml，混合细胞在2-8℃条件下将运输至放疗科；

(2)、将混合细胞放置于血液辐照容器，设置箱子距离辐照源为60cm，辐照面积为40×40cm²；使用医用直线加速器进行30Gy辐照，该直线加速器能量为6MeV；

(3)、辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法分离肿瘤细胞株和红细胞。采用MTT法、EdU法、平板克隆形成法、裸鼠皮下移植瘤模型检测辐照后肿瘤细胞株的增殖活力、DNA复制、克隆性、成瘤性；同时检测辐照后红细胞的Na⁺-K⁺-ATPase活性，2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)水平，游离血红蛋白(free Hb)水平，渗透脆性，及血气值变化。

本发明的有益效果为：线性加速器30Gy有效且安全的灭活混杂在回收红细胞中的HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞并保存红细胞质量。使用X射线的线性加速器与血液辐照仪γ射线放射源相比有更多优势，不仅更有效的以更低剂量灭活肝肿瘤细胞；而且不是活性放射源，对操作员更安全；同时不需要运输至血液中心进行辐照，节约了成本/时间。

附图说明

图1是30Gy和50Gy的X线辐照完全抑制各株肿瘤细胞的克隆形成的示意图；

图2是30Gy和50Gy的X线辐照完全抑制各株肿瘤细胞的皮下移植瘤的形成的示意图；

图3是X线辐照对红细胞质量的影响示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。

本发明所述的这种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)、HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的红细胞混合混匀，混匀后肝肿瘤细胞密度为5×10⁶/ml，混合细胞在2-8℃条件下将运输至放疗科；

(2)、将混合细胞放置于血液辐照容器，设置箱子距离辐照源为60cm，辐照面积为40×40cm²；使用医用直线加速器进行30Gy辐照，该直线加速器能量为6MeV；

(3)、辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法分离肿瘤细胞株和红细胞。采用MTT法、EdU法、平板克隆形成法、裸鼠皮下移植瘤模型检测辐照后肿瘤细胞株的增殖活力、DNA复制、克隆性、成瘤性；同时检测辐照后红细胞的Na⁺-K⁺-ATPase活性，2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)水平，游离血红蛋白(free Hb)水平，渗透脆性，及血气值变化。

对比实验：

(1)、HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的红细胞混合混匀，肝肿瘤细胞接种密度为5×10⁶/ml，(n＝14)，混合细胞分：A(对照组)，B(30Gy)，C(50Gy)。2-8℃条件下运输至我院放疗科，使用线性加速器(Varian Trilogy,USA)，能量为6MeV。

(2)、B组或C组放置于血液辐照容器，其材质为聚酸甲酯，大小为24×24×5.5cm³，箱子顶和壁为1cm厚，底为0.5cm。设置箱子距离辐照源为60cm，辐照面积为40×40cm²。B组或C组使用医用直线加速器(Varian Trilogy,USA)行30Gy或50Gy辐照，该直线加速器能量为6MeV，A组不辐照；

(3)、辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法分离肿瘤细胞株和红细胞。采用MTT法、EdU法、平板克隆形成法、裸鼠皮下移植瘤模型检测辐照后肿瘤细胞株的增殖活力、DNA复制、克隆性、成瘤性。同时检测辐照后红细胞的Na⁺-K⁺-ATPase活性，2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)水平，游离血红蛋白(free Hb)水平，渗透脆性，及血气值变化。

其中，图1X线辐照对肿瘤细胞的克隆形成的杀灭作用。A三株肿瘤细胞的未辐照组第7天的克隆形成Giemsa染色图片；B三株肿瘤细胞第14的克隆形成的统计图。

图2X线辐照对肿瘤细胞的皮下移植瘤形成的杀灭作用。各辐照剂量HepG2(A),Huh7(B),和SK-Hep1(C)细胞接种裸鼠后裸鼠体重的变化，D三株肿瘤细胞未辐照组接种裸鼠后，皮下移植瘤体积的变化。

图3X线辐照对红细胞质量的影响。各辐照组红细胞ATP(A)，2,3-DPG(B)，free Hb(C)及渗透脆性(D)。30Gy X线辐照对回收红细胞ATP，2,3-DPG，free Hb及渗透脆性均没有明显影响；而50Gy X线辐照对回收红细胞的渗透脆性有明显影响。

结果：线性加速器30Gy可以有效抑制HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞的DNA复制、克隆性及成瘤性，并对红细胞的携氧能力、膜完整性、渗透脆性均无明显影响。

结论：线性加速器30Gy有效且安全的灭活混杂在回收红细胞中的HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞并保存红细胞质量。使用X射线的线性加速器与血液辐照仪γ射线放射源相比有更多优势，不仅更有效的以更低剂量灭活肝肿瘤细胞；而且不是活性放射源，对操作员更安全；同时不需要运输至血液中心进行辐照，节约了成本/时间。

本发明将线性加速器用于回收自体血液中的肿瘤细胞的灭活及对红细胞影响。本发明为寻求有效的肿瘤手术自体血液回收中混杂肿瘤细胞的去除方法提供了可靠的临床前实验依据，也为我国临床医学界进一步研究自体血液回收在肿瘤手术中的应用进行了有益的探索。

以上所述，仅是本发明的最佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，均能利用上述技术内容作出些许更改，得到等效的实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的简单修改、等同变化，均属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (1)

1.一种采用直线加速器灭活自体血回收中混杂的肝肿瘤细胞并保存红细胞质量的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(1)、HepG2，SK-Hep1和Huh7肝肿瘤细胞株分别与经过血液回收机浓缩后的红细胞混合混匀，混匀后肝肿瘤细胞密度为5×10⁶/ml，混合细胞在2-8℃条件下将运输至放疗科；

(2)、将混合细胞放置于血液辐照容器，设置箱子距离辐照源为60cm，辐照面积为40×40cm²；使用医用直线加速器进行30Gy辐照，该直线加速器能量为6MeV；

(3)、辐照后使用密度为1.063g/ml的Percoll行密度梯度离心法分离肿瘤细胞株和红细胞。采用MTT法、EdU法、平板克隆形成法、裸鼠皮下移植瘤模型检测辐照后肿瘤细胞株的增殖活力、DNA复制、克隆性、成瘤性；同时检测辐照后红细胞的Na⁺-K⁺-ATPase活性，2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)水平，游离血红蛋白(free Hb)水平，渗透脆性，及血气值变化。