CN106153549A - 基于分子吸收的毛细管电泳检测器及检测方法 - Google Patents

基于分子吸收的毛细管电泳检测器及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于分子吸收的毛细管电泳检测器及检测方法，该毛细管电泳检测器包括一个装有激光光源的双光束光路的检测单元A及信号处理单元B，所述双光束光路的检测单元A，由装在激光光源前方的分光镜、准直系统(透镜或透镜组)、毛细管、第一光检测器和装在分光镜一侧的第二光检测器组成。本发明毛细管电泳检测器，采用激光为光源，采用双光束光路的检测系统，不仅可以提供远高于普通毛细管电泳光源的强度，还可以校正光源的微小波动所产生的误差，从而获得稳定的检测信号；本发明通过测定样品的光吸收强度并依据光吸收强度与样品浓度的关系来对样品定量，由于光吸收强度的值与光源强度成正比，因此可以获得更高的检测灵敏度。

Description

基于分子吸收的毛细管电泳检测器及检测方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，涉及一种毛细管电泳紫外可见检测技术，具体涉及一种基于分子吸收的毛细管电泳检测器及检测方法。
背景技术
毛细管电泳仪是上世纪80年代发展起来的一种新型分析仪器,在分析仪器发展史上具有划时代的意义。毛细管电泳(CE)是依据高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道的新型液相分离分析技术，它是基于样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。由于毛细管电泳具有很高的柱效，一般可达到几十万理论塔板数；灵敏度极高，采用激光诱导荧光检测法和安培检测法均可检测至10-19mol·L-1,甚至可达10- 21mol·L-1；分离速度极快，通常只需几十秒至几十分钟内就可完成分离；此外，毛细管电泳还具有进样量少，溶剂消耗少，仪器简单、成本低等优点；分析对象涉及无机离子、有机小分子、生物大分子等；而且毛细管柱同HPLC柱或GC柱相比费用低得多。毛细管电泳仪将人们从繁杂冗长的传统电泳方法中解放出来,极大地提高了工作效率(分析时间从几个小时减少到5～20min),大大降低了样品用量(从微升级减少到纳升级)，并将定量水平提高到一个新的高度。在生物化学、分子生物学、食品化学、药物化学、环境化学、医学和司法等许多领域逐渐得到广泛应用。
迄今为止，毛细管电泳的检测器仍以紫外可见检测器为主。配有多波长扫描或二极管阵列的紫外检测器仍是目前高档商品仪器的基本配置。如林金明等公开的“一种便携式毛细管电泳仪”(CN 101334378B)发明专利，它采用笔型汞灯为光源代替了普通毛细管电泳仪中常用的氘灯光源，大大减小了仪器体积，提高了仪器的便携性。此外，激光诱导荧光检测也被越来越多的应用于各个方面，以求对一些目的化合物更高的灵敏度。电化学检测器也开始在毛细管电泳上，特别是用于一些神经传递物质的检测有明显的优点，但其应用尚不普遍。
紫外可见检测器基于样品分子对特征紫外可见光的吸收进行，由于大多数的有机化合物在紫外可见光区都有特征吸收，紫外可见检测器具有适用检测对象广的优点。但普通紫外可见检测器受原理的制约，检测灵敏度有限。此外，由于自身能够发出强荧光的物质非常有限，激光诱导荧光检测器使用时，通常都必须用强荧光试剂对待测样品进行衍生，这样虽然可以提高检测的灵敏度，但却使分析过程变得相当繁琐，效率很低。同时受样品衍生反应性能的限制，也并非所有的有机物都能进行激光诱导荧光检测。发展新型高灵敏并可广泛适用于各种有机化合物样品的毛细管电泳检测器具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于分子吸收的毛细管电泳检测器及检测方法，它采用激光为光源，可以提供远高于普通毛细管电泳光源的强度，由于光吸收强度的值与光源强度成正比，因此可以获得更高的检测灵敏度；本发明通过测定样品的光吸收强度并依据光吸收强度与样品浓度的关系来对样品定量；不仅具有激光诱导荧光检测方式灵敏度高的优点，而且无需对待测样品衍生就可以对许多有机化合物进行测定，因此可以大大扩充紫外可见光度检测毛细管电泳的使用范围，解决了现有毛细管电泳紫外可见检测技术存在的上述问题。
本发明所采用的技术方案是，一种基于分子吸收的毛细管电泳检测器，它包括一个装有激光光源的双光束光路的检测单元A及信号处理单元B，所述双光束光路的检测单元A，由激光单元、装在激光光源前方的分光镜、准直系统(透镜或透镜组)、毛细管、第一光检测器和装在分光镜一侧的第二光检测器组成。
本发明所述的基于分子吸收的毛细管电泳检测器，其特征还在于，所述的激光光源为根据监测样品的特征吸收波长选择出光波长在紫外可见光区的各种激光光源。
所述的毛细管为用于毛细管电泳的各种毛细管。
所述的两个光检测器为光电倍增管，或为光电管，或为光电二极管。
所述激光光源根据检测对象的吸光波长范围选择，其发出的激光能被样品有效吸收；激光光源或采用半导体激光器，或采用其他类型的激光器。”
本发明还公开了一种利用基于分子吸收的毛细管电泳检测器的检测方法，该检测方法为，于双光束光路的检测单元A中的激光光源产生的激发光，首先经45度角安装的分光镜分为两束光，分光所得两束光中的一束光被反射到第二光检测器，经第二光检测器检测后得到激光强度随时间变化的情况；分光所得两束光中的另一束光透过分光镜后，经准直系统(透镜或透镜组)聚焦到毛细管上，被在毛细管内部流动的样品部分吸收后剩余部分光透过毛细管照射在安装于另一侧的第一光检测器上，由第一光检测器检测得到透过毛细管的光强信号；
所述第一光检测器和第二光检测器检测得到的光强度信号，由信号处理单元B的信号检测和处理电路分别记录后得到二者随时间变化的情况；其中由第二光检测器得到测定光束光强度值IJ，由第一光检测器得到测定光束光强度值Ix，由于激光光源的强度有微小变化时，会导致IJ和Ix同时发生等比例的变化，因此可以根据测量得到的IJ的变化对相应时刻的Ix进行校正，得到校正激光光源强度变化影响后的测定光束光强度；
最后由信号处理单元B的信号记录和处理系统记录校正后的测定光束光强度随时间变化的关系曲线，即为毛细管电泳图。
本发明所述的检测方法，其特征还在于，
所述双光束光路的检测单元A获得的监测光束和测定光束的强度信号通过信号处理单元模拟转换或数字转换等处理方式处理成数字信号；在保持信号处理方式不变的情况下，信号校正方法如下：在毛细管电泳进行过程中，当没有吸光样品到达毛细管检测窗口时，第一光检测器测量得到的测定光束光强度记为IJ(0)，同一时刻由第二光检测器测量得到的监测光束光强度记为Ix(0)；若t时刻时有吸光样品到达毛细管检测窗口，由于样品吸收，导致测量得到的测定光束光强度Ix减小，在毛细管电泳图上呈现为该样品对应的峰，记为Ix(t)，同一时刻由第二光检测器测量得到的监测光束光强度记为IJ(t)；在激光光源光强度保持不变(即IJ(t)＝IJ(0))的情况下，可计算得到样品的光吸收强度ΔI＝Ix(0)－Ix(t)，如果激光光源的强度有变化(即IJ(t)≠IJ(0))，则校正光源强度变化影响后的光吸收强度ΔI＝(Ix(0)－Ix(t))×(IJ(t)/IJ(0))。校正后的ΔI的值与样品的浓度c呈正比，即ΔI＝Kc；依据这一关系可用标准曲线法对样品浓度进行定量，必要时可以采用内标法对样品处理和进样过程带来的误差进行进一步校正。
本发明基于分子吸收的毛细管电泳检测器，采用激光为光源，可以提供远高于普通毛细管电泳光源的强度，由于光吸收强度的值与光源强度成正比，因此可以获得更高的检测灵敏度；本发明采用双光束光路的检测系统，还可以校正光源的微小波动所产生的误差，从而获得稳定的检测信号，适用于低浓度样品的检测。
本发明基于分子吸收的毛细管电泳检测器的检测方法，通过测定样品的光吸收强度并依据光吸收强度与样品浓度的关系来对样品定量；不仅具有激光诱导荧光检测方式灵敏度高的优点，而且无需对待测样品衍生就可以对许多有机化合物进行测定，因此可以大大扩充紫外可见光度检测毛细管电泳的使用范围，可以成为一种有前途的毛细管电泳检测器。”
附图说明
图1是本发明基于分子吸收的毛细管电泳检测器工作原理图；
图2是本发明基于分子吸收的毛细管电泳检测器结构示意图。
图中，1.激光光源，2.分光镜，3.第一光检测器，4.准直系统(透镜或透镜组)，5.毛细管固定板，6.毛细管，7.第二光检测器。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于分子吸收的毛细管电泳检测器，如图1所示，它包括一个双光束光路的检测单元A及信号处理单元B，所述双光束光路的检测单元A，由激光光源1、装在激光光源1前方的分光镜2、准直系统(透镜或透镜组)4、毛细管6、第一光检测器3和装在分光镜2一侧的第二光检测器7组成。
本发明的激光光源1为根据监测样品的特征吸收波长选择出光波长在紫外可见光区的各种激光光源，其发出的激光能被样品有效吸收；激光光源1或采用半导体激光器，或采用其他类型的激光器；毛细管6为用于毛细管电泳的各种毛细管；两个光检测器3、7为光电倍增管，或为光电管，或为光电二极管。
本发明基于分子吸收的毛细管电泳检测器的检测方法，通过使用毛细管电泳检测器来实现，如图2所示，于双光束光路的检测单元A中的激光光源1产生的激发光，首先经45度角安装的分光镜2分为两束光，分光所得两束光中的一束光被反射到第二光检测器7的光电倍增管上，经第二光检测器7的光电倍增管检测后得到激光强度随时间变化的情况。
分光所得两束光中的另一束光透过分光镜2后，经准直系统(透镜或透镜组)4聚焦到固定于毛细管固定板5毛细管检测窗口上的毛细管6上，被在毛细管6内部流动的样品部分吸收后剩余部分光透过毛细管6照射在安装于另一侧的第一光检测器3的光电倍增管上，由第一光检测器3的光电倍增管检测得到透过毛细管的激光光强信号。
由于毛细管电泳测定的低浓度样品的光吸收强度很小，为了获得高的灵敏度，需要很高的激光光源强度，此时激光强度随时间不大的变化可能导致对c测定较大的误差。
为了校正激光光源强度随时间变化导致的误差，本发明通过第一光检测器3光电倍增管和第二光检测器7光电倍增管检测得到的光强度信号，由信号处理单元B的信号检测和处理电路分别记录后得到二者随时间变化的情况；其中由第二光检测器7光电倍增管得到监测光束的光强度值IJ，由第一光检测器3光电倍增管得到测定光束光强度值Ix，由于激光光源1的强度有微小变化时，会导致IJ和Ix同时发生等比例的变化，因此可以根据测量得到的IJ的变化对相应时刻的Ix进行校正，得到校正激光光源强度变化影响后的光吸收强度；最后由信号处理单元B的信号记录和处理系统记录校正后的测定光束光强度随时间变化的关系曲线，即为毛细管电泳图。
本发明的双光束光路的检测单元A获得的监测光束和测定光束的强度信号通过信号处理单元模拟转换或数字转换等处理方式处理成数字信号；在保持信号处理方式不变的情况下，信号校正方法如下：在毛细管电泳进行过程中，当无吸光样品到达毛细管6检测窗口时，第二光检测器7光电倍增管测量得到的监测光束光强度记为IJ(0)，同一时刻由第一光检测器3光电倍增管测量得到测定光束光强度记为Ix(0)；若t时刻时有吸光样品到达毛细管6检测窗口上，由于样品吸收，导致第一光检测器3光电倍增管测量得到的测定光束光强度光强Ix减小，在毛细管电泳图上呈现为该样品对应的峰，记为Ix(t)，同一时刻由第二光检测器7光电倍增管测量得到的监测光束光强度记为IJ(t)；在光源激光光强度保持不变(即IJ(t)＝IJ(0))的情况下，可计算得到样品的光吸收强度ΔI＝Ix(0)－Ix(t)，如果激光光源1的光强度有变化(即IJ(t)≠IJ(0))，则校正光源强度变化影响后的光吸收强度ΔI＝(Ix(0)－Ix(t))×(IJ(t)/IJ(0))。
校正后的ΔI的值与样品的浓度c呈正比，即ΔI＝Kc；依据这一关系可用标准曲线法对样品浓度进行定量，必要时可以采用内标法对样品处理和进样过程带来的误差进行进一步校正。
上述实施方式只是本发明的一个实例，不是用来限制发明的实施与权利范围，凡依据本发明申请专利保护范围所述的内容做出的等效变化和修饰，均应包括在本发明申请专利范围内。

Claims (7)

1.一种基于分子吸收的毛细管电泳检测器，它包括一个双光束光路的检测单元A及信号处理单元B，其特征在于，所述双光束光路的检测单元A，由激光光源(1)、装在激光光源(1)前方的分光镜(2)、准直系统(透镜或透镜组)(4)、毛细管(6)、第一光检测器(3)和装在分光镜(2)一侧的第二光检测器(7)组成。
2.根据权利要求1所述的基于分子吸收的毛细管电泳检测器，其特征在于，所述的激光光源(1)为根据监测样品的特征吸收波长选择的出光波长在紫外可见光区的各种激光光源。
3.根据权利要求1所述的基于分子吸收的毛细管电泳检测器，其特征在于，所述的毛细管(6)为用于毛细管电泳的各种毛细管。
4.根据权利要求1所述的基于分子吸收的毛细管电泳检测器，其特征在于，所述的两个光检测器(3、7)为光电倍增管，或为光电管、或为光电二极管。
5.根据权利要求2所述的基于分子吸收的毛细管电泳检测器，其特征在于，所述激光光源(1)根据检测对象的吸光波长范围选择，其发出的激光能被样品有效吸收；激光光源(1)或采用半导体激光器，或采用其他类型的激光器。
6.一种利用权利要求1所述的基于分子吸收的毛细管电泳检测器的检测方法，其特征在于，该检测方法为，于双光束光路的检测单元A中的激光光源(1)产生的激发光，首先经45度角安装的分光镜(2)分为两束光，分光所得两束光中的一束光被反射到第二光检测器(7)，经第二光检测器(7)检测后得到激光光源强度随时间变化的情况；
分光所得两束光中的另一束光透过分光镜(2)后，经准直系统(透镜或透镜组)(4)聚焦到毛细管(6)上，被在毛细管内部流动的样品部分吸收后剩余部分光透过毛细管(6)照射在安装于另一侧的第一光检测器(3)上，由第一光检测器(3)检测得到透过毛细管的光强信号；
所述第一光检测器(3)和第二光检测器(7)检测得到的光强度信号，由信号处理单元B的信号检测和处理电路分别记录后得到二者随时间变化的情况；其中由第二光检测器(7)得到监测光束的光强度值IJ，由第一光检测器(3)测定光束的光强度值Ix，由于激光光源(1)的强度有微小变化时，会导致IJ和Ix同时发生等比例的变化，因此可以根据测量得到的IJ的变化对相应时刻的Ix进行校正，得到校正激光光源强度变化影响后的测定光束的光强度；
最后由信号处理单元B的信号记录和处理系统记录校正后的测定光束光强度随时间变化的关系曲线，即为毛细管电泳图。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述双光束光路的检测单元A获得的监测光束和测定光束的强度信号通过信号处理单元模拟转换或数字转换等处理方式处理成数字信号；在保持信号处理方式不变的情况下，信号校正方法如下：在毛细管电泳进行过程中，当无吸光样品到达毛细管(6)检测窗口时，第二光检测器(7)光电倍增管测量得到的检测光束光强度记为IJ(0)，同一时刻由第一光检测器(3)光电倍增管测量得到的测定光束光强度记为Ix(0)；若t时刻时有吸光样品到达毛细管(6)检测窗口，由于样品吸收，导致第一光检测器(3)测量得到的测定光束光强度Ix减小，在毛细管电泳图上呈现为该样品对应的峰，记为Ix(t)，同一时刻由第二光检测器(7)测量得到的测定光束光强度记为IJ(t)；在激光光光源(1)强度保持不变(即IJ(t)＝IJ(0))的情况下，可计算得到样品的光吸收强度ΔI＝Ix(0)－Ix(t)，如果激光光源(1)的强度有变化(即IJ(t)≠IJ(0))，则校正激光光源(1)光强度变化影响后的光吸收强度ΔI＝(Ix(0)－Ix(t))×(IJ(t)/IJ(0))；校正后的ΔI的值与样品的浓度c呈正比，即ΔI＝Kc；依据这一关系可用标准曲线法对样品浓度进行定量，必要时可以采用内标法对样品处理和进样过程带来的误差进行进一步校正。
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