CN106103467B

CN106103467B - 与细胞膜神经节苷脂相互作用的嵌合肽

Info

Publication number: CN106103467B
Application number: CN201580013376.9A
Authority: CN
Inventors: 亚奎斯·凡蒂尼; 诺拉·亚海
Original assignee: Aix Marseille Universite
Current assignee: Aix Marseille Universite
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2035-03-10
Also published as: CA2941416C; CN106103467A; JP2017510267A; JP6609565B2; ES2757595T3; CA2941416A1; US20170073383A1; EP3116893A1; US10087226B2; EP3116893B1; WO2015135942A1

Abstract

本发明涉及嵌合肽，其表现出α‑突触核蛋白和β‑淀粉样肽二者的神经节苷脂结合性质。这样的肽可用于预防或治疗涉及神经节苷脂作为细胞表面受体位点的任何病症，包括神经退行性障碍、感染性疾病或肿瘤。

Description

与细胞膜神经节苷脂相互作用的嵌合肽

技术领域

本发明涉及与细胞表面糖脂相互作用并且在神经退行性障碍、感染性疾病和癌症中具有治疗应用的嵌合肽。

背景技术

质膜糖脂充当范围广泛的感染性和淀粉样蛋白质的主要附着位点(Fantini，2003)。例如，GM1和GM3这两种神经节苷脂参与阿尔茨海默氏病和帕金森氏病的病理生理(Oikawa等，2009；Wu等，2012)。

在与帕金森氏病相关的蛋白质——α-突触核蛋白的糖脂结合特异性的最新研究中，Fantini等鉴定到所述蛋白质的34-45片段是最短的活性糖脂结合结构域(Fantini和Yahi，2011a)。这种12个氨基酸残基的短的线性基序赋予所述蛋白质与GM3相互作用的高特异性，GM3是由星形胶质细胞优先表达的神经节苷脂。这种基序与阿尔茨海默氏β-淀粉样肽(Aβ)的5-16片段具有结构同源性。然而Aβ的糖脂结合结构域不识别GM3，而是GM1，一种在突触后膜水平处丰富表达的神经节苷脂。

发明内容

本发明人现在已经破译了控制Aβ和α-突触核蛋白的糖脂结合特异性的生物化学密码并且已经制造了显示出这两种蛋白质的神经节苷脂结合性质的嵌合肽。

本发明因而提供了一种肽，其包含

a)氨基酸序列E-X1X2X3-YVGHH-X4(SEQ ID NO：9)，

其中X1、X2或X3中的至少一个是甘氨酸或丝氨酸残基，同时X1、X2或X3中其余的是任何氨基酸；并且

X4是苏氨酸或谷氨酰胺；

b)从SEQ ID NO：9通过一个或多个保护所述肽对抗蛋白水解的化学修饰而衍生的序列，或

c)从SEQ ID NO：9通过一个或多个保守性取代而衍生的基本上同源的序列，

应了解，所述肽包含两个连续的组氨酸残基。

所述肽具有10至30个氨基酸。

在优选实施方式中，本发明提供了一种肽，其优选包含12至20个氨基酸，所述肽包含

a)氨基酸序列EGVLYVGHHT(SEQ ID NO：1)，或

b)从SEQ ID NO：1通过一个或多个保护所述肽对抗蛋白水解的化学修饰而衍生的序列，或

c)从SEQ ID NO：1通过一个或多个保守性取代而衍生的基本上同源的序列，

应了解，所述肽包含两个连续的组氨酸残基。

优选的肽由KEGVLYVGHHTK(SEQ ID NO：3)组成。

这样的肽可用于预防或治疗涉及神经节苷脂作为细胞表面受体位点的任何病症，包括神经退行性障碍、感染性疾病或肿瘤。

本发明的另一个目的是编码如本文中定义的嵌合肽的核酸。本发明的又一个目的是包含所述核酸的载体，其优选是腺病毒或慢病毒载体。

附图说明

图1A和1B显示了His-13和His-14残基二者都参与Aβ5-16与GM1的结合。

A.在17.5mN.m^-1的初始表面压力下制备神经节苷脂GM1的单层。在平衡之后，将野生型Aβ5-16(空心方块)、或突变体Aβ5-16/H13A(实心三角)、Aβ5-16/H14A(实心圆)、Aβ5-16/H13A/H14A(空心三角)肽注入到所述单层下方的面下水相(aqueous subphase)中。数据显示了在所述单层下方的面下水相中注入肽(10μM)后，所述表面压力的演变。每个实验以一式三份进行并显示了一条代表性的曲线(S.D.<10％)。B.Aβ5-16与两个排列成高脚杯样托的GM1分子相互作用的分子模型。

图1C显示了嵌合α-syn34-45/HH肽和高脚杯状GM1二聚体之间的分子相互作用。

图2：在α-syn的SBD内引入His残基不改变GM3识别并增加它对GM1的亲和性。

左图.野生型α-syn34-45(实心三角)和双重突变体α-syn34-45/HH(空心方块)与GM3(A)或GM1(C)单层相互作用的动力学。在每种情况下，在17.5mN.m-¹的初始表面压力下制备所述单层。所有实验以一式三份进行并显示了一条代表性的曲线(S.D.<15％)。

右图.野生型α-syn34-45(实心三角)和双重突变体α-syn34-45/HH(空心方块)与在各种初始表面压力值下制备的GM3(B)或GM1单层(D)的相互作用。在达到平衡之后测定最大表面压力增加(Δπmax)。插入临界压力由斜率与x轴的截距指示。

图3A和3B显示了野生型和嵌合的α-syn34-45肽的分子建模。

A.野生型(左图)或嵌合的α-syn34-45/HH(右图)肽的正静电势表面的可视化。B.野生型(左图)或嵌合的α-syn34-45/HH(右图)肽与神经节苷脂GM1单体或二聚体相互作用的分子建模模拟。

图4A和4B显示了α-syn34-45/HH-GM1复合体的分子建模研究的实验验证。

A.嵌合的α-syn34-45/HH肽与GD1a(实心方块)、GM1(空心方块)、脱唾液酸-GM1(实心三角)、LacCer(空心圆)和GlcCer(空心三角)在单层试验中的相互作用(实验条件与图1A相同)。

B.α-syn34-45/HH与GM1：胆固醇或GM1：磷脂酰胆碱(1：1，mol：mol)的混合单层的相互作用。

图4C：α-syn34-45/HH对GM1单层的插入临界压力的确定。在各种初始表面压力πi值下制备GM1单层并用添加到面下水相中的所述嵌合α-syn34-45/HH肽探查。记录平衡时的最大表面压力增加Δπmax。插入临界压力πc(37.5mN.m-¹)被确定为线性回归斜率与x轴的截距。

图5：α-syn34-45/HH或α-syn34-45对淀粉样蛋白孔隙形成的影响。

A.在第一个实验中，将SH-SY5Y细胞用Aβ1-42肽(220nM)处理，并分析Ca²⁺依赖性荧光(上曲线)。在第二个系列的实验中，将Aβ1-42和嵌合α-syn34-45/HH肽(二者均为220nM)即时混合，直接注入到所述细胞上(C1和C2曲线对应于两个分开的实验)。C3曲线对应于由所述嵌合肽单独诱导的钙响应。结果表示为平均值±SD(n＝100)。在图B中，使用相同的颜色，但是所述嵌合肽被野生型α-syn34-45肽代替。

图6：嵌合肽α-syn34-45/HH通过纯bEnd-3细胞单层的跨内皮穿过动力学。将所述细胞培养在两隔室培养腔的滤器上，直至形成跨内皮电阻>100Ω.cm²的紧密单层。在时间0时，将所述肽(600μM)注入下隔室，它在上隔室中的出现通过分光光度法定量测定。

图7：嵌合肽α-syn34-45/HH通过与C6细胞共同培养的bEnd-3细胞单层的跨内皮穿过动力学。在这种情况下，在培养在下隔室塑料壁上的神经胶质C6细胞存在下，在两隔室培养腔的滤器上培养bEnd-3细胞。当bEnd-3细胞形成跨内皮电阻>100Ω.cm²的紧密单层时，将所述滤器转移到新的培养板中，然后在没有C6细胞的条件下进行实验。在时间0时，将所述肽(600μM)注入下隔室，它在上隔室中的出现通过分光光度法定量测定。

图8：嵌合肽α-syn34-45/HH通过与CTX细胞共同培养的bEnd-3细胞单层的跨内皮穿过动力学。实验与图7中所述相同，但是使用最初在星形胶质细胞CTX细胞存在下共同培养的bEnd3-细胞。

图9：嵌合肽α-syn34-45/HH通过血脑屏障的三种体外模型的跨内皮穿过动力学。血脑屏障的细胞模型是：单独的bEnd-3细胞(b)，与C6细胞共同培养的bEnd-3细胞(c)或与C6细胞共同培养的bEnd-3细胞(d)。没有添加肽的对照实验(a)平行进行(在这种情况下，向所述细胞添加相同体积的PBS)。直方图显示在1小时(A)或24小时(B)之后穿过所述屏障的嵌合肽α-syn34-45/HH的浓度。

图10：嵌合肽α-syn34-45/HH通过bEnd-3细胞单层的跨内皮穿过动力学。上曲线显示了所述肽在供体(即下)隔室中的进行性消失。下曲线显示了所述肽在受体(即上)隔室中的逐渐出现。

图11：嵌合肽α-syn34-45/HH对淀粉样蛋白孔隙形成的通用抗阿尔茨海默和抗帕金森效应

A.用Aβ1-42肽(220nM)处理SH-SY5Y细胞，并分析Ca²⁺依赖性荧光。直方图显示了100个细胞的分析(平均值±SD)。在所述嵌合肽不存在时(-Pep Chim)，由Aβ1-42肽诱导的淀粉样蛋白孔隙形成通过所述细胞内部的Ca²⁺荧光增加证明。当在嵌合肽α-syn34-45/HH存在下向所述细胞添加Aβ1-42(二者均为220nM)时，没有检测出Ca²⁺荧光增加(+Pep Chim)。所述直方图下面显示了用Aβ1-42(左显微照片)或用Aβ1-42+嵌合肽α-syn34-45/HH(右显微照片)处理的细胞的代表性显微镜视野。颜色越暖相当于荧光越高(左标尺)。

B.用α-突触核蛋白代替Aβ1-42，在嵌合肽α-syn34-45/HH不存在(-Pep Chim)或存在(+Pep Chim)下进行类似的实验。***，显著差异；P＜0.001。

图12：嵌合肽KEHHGVLYVGTK(SEQ ID NO：11)(10μM)与神经节苷脂GM1(实心方块)或GM3(空心方块)单层相互作用的动力学。所述相互作用通过在添加所述肽之后表面压力(π)随时间的增加来测量。

具体实施方式

本发明人现在已经表明，Aβ和α-突触核蛋白二者都表现出共同的结构相关糖脂结合结构域，而序列同源性很小。Aβ对神经节苷脂GM1的高亲和性是由一对组氨酸残基(His-13和His-14)的存在所决定的。于是本发明人用两个组氨酸残基替代α-突触核蛋白的最小糖脂结合结构域(αsyn34-45)的氨基酸Ser-42和Lys-43。由此产生的嵌合α-syn/HH肽完全保留了它识别神经节苷脂GM3的能力并获得在高表面压力下与GM1的缩合复合体结合的能力。

所述嵌合α-syn/HH肽几乎专门与神经节苷脂相互作用，而不理会不含唾液酸的中性糖脂(GalCer，LacCer，脱唾液酸-GM1)。

本发明的嵌合肽对这些神经节苷脂在它们的天然脂质环境中的高亲和性，打开了广阔的治疗应用。

定义

术语“患者”或“受试者”是指人或非人动物，优选哺乳动物，包括雄性、雌性、成年和幼年。

用在本文中时，术语“治疗”或“疗法”包括治愈性和/或预防性治疗。更具体地，治愈性治疗是指以下任一种：症状的缓解、改善和/或消除、减轻和/或稳定(例如不能进展到更晚期)，以及延迟特定障碍的症状进展。

预防性治疗或“预防”是指以下任一种：停止发作，降低发展的风险，减少发病率，延迟发作，减少发展，以及增加特定障碍的症状发作的时间。在本发明的环境下，术语“预防”更特别适用于具有发生特定障碍的风险的受试者，所述障碍即涉及神经节苷脂作为细胞表面受体位点的任何病症，包括神经退行性障碍、感染性疾病或肿瘤。

当一个或多个氨基酸残基被生物类似的残基替代时或当大于80％的氨基酸相同、或大于约90％、优选大于约95％的氨基酸相似(功能相同)时，两个氨基酸序列是“同源的”、“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地，相似或同源的序列通过使用例如GCG(Genetics Computer Group，GCG程序包的程序手册，第7版，Madison，威斯康星)pileup程序或本领域中已知的任何程序(BLAST，FASTA，等等)进行比对来鉴定。优选地，这些同源肽不包括两个半胱氨酸残基，从而防止环化。优选所述同源序列因突变而不同，例如取代、插入和/或缺失一个或几个氨基酸。优选所述同源序列只因保守性取代而不同。

术语“保守性取代”用在本文中时表示氨基酸残基被另一个氨基酸残基替代而没有改变所述肽的整体构象和功能，包括但不限于氨基酸被具有类似性质(例如，极性、氢键合电位、酸性、碱性、形状、疏水性、芳香性等)的氨基酸替代。具有类似性质的氨基酸是本领域公知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并且是可互换的。类似地，疏水性氨基酸异亮氨酸可以被亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸替代。可以彼此取代的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。

“神经节苷脂”是指由在糖链上连接了一个或多个唾液酸(例如n-乙酰基神经氨酸，NANA)的鞘糖脂(神经酰胺和低聚糖)构成的分子。碳水化合物唾液酸的乙酰化衍生物NeuNAc使得神经节苷脂的头部基团在pH 7下是阴离子。神经节苷脂存在和集中于细胞表面上，其中神经酰胺部分的两个烃链嵌入到质膜中并且所述低聚糖位于细胞外表面上，在所述细胞外表面上它们为细胞外分子或相邻细胞表面提供识别点。常见的神经节苷脂(GM1，GM2，GM3，GD1a，GD1b，GD2，GD3，GT1b，GQ1)的结构是本领域已知的。

本发明的嵌合肽：

本发明提供了包含氨基酸序列E-X₁X₂X₃-YVGHH-X₄(SEQ ID NO：9)、优选EGVLYVGHHT(SEQ ID NO：1)的肽。

本发明还提供了抗蛋白水解肽，其显示出从SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：9通过一个或多个保护所述肽对抗蛋白水解的化学修饰而衍生的序列，所述化学修饰例如如下文所定义的。

本发明还包括基本上同源的肽，其显示出从SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：9通过一个或多个保守性取代而衍生的序列。

所有本发明的肽都包含两个连续的组氨酸残基。

本发明的肽优选具有10至30个氨基酸，更优选12至20个，优选12至16个氨基酸。

有利地，N-端和C-端氨基酸二者都是碱性氨基酸，优选独立地选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

在具体实施方式中，所述肽包含X₅-EGVLYVGHHT-X₆(SEQ ID NO：2)或由X₅-EGVLYVGHHT-X₆(SEQ ID NO：2)组成，其中X₅和X₆独立地是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

优选的肽由KEGVLYVGHHTK(SEQ ID NO：3)组成。

其他肽包含以下序列或由以下序列组成

REGVLYVGHHTR(SEQ ID NO：6)；

REGVLYVGHHTK(SEQ ID NO：7)；

KEGVLYVGHHTR(SEQ ID NO：8)。

反向肽：

还描述了其中组氨酸残基对移到所述嵌合肽的N-端部分的肽。

这样的肽在本文中也称为“反向”嵌合肽，其长度为10至30个氨基酸。

这样的肽包含X₅-EHHGVLYVGT-X₆(SEQ ID NO：10)或由X₅-EHHGVLYVGT-X₆(SEQ IDNO：10)组成，其中X₅和X₆独立地是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

具体的肽是KEHHGVLYVGTK(SEQ ID NO：11)。

下面的章节适用于这些反向肽以及在本文中描述的所有嵌合肽。这些反向肽表现出α-突触核蛋白和β-淀粉样肽二者的神经节苷脂结合性质。因此还描述了这些肽、或编码所述肽的核酸用于预防或治疗涉及神经节苷脂作为细胞表面受体位点的任何病症，包括神经退行性障碍、感染性疾病或肿瘤。

肽制备：

本文中描述的肽可以利用本领域技术人员已知的标准合成方法例如化学合成或遗传重组来合成。在优选实施方式中，肽通过逐步缩合氨基酸残基来获得，即，通过缩合已经含有适当次序的氨基酸序列的预制片段或通过缩合先前制备的若干片段，同时保护除了在缩合期间参与肽键的氨基酸官能团以外的氨基酸官能团来获得。具体而言，所述肽可以根据最初由Merrifield描述的方法来合成。

化学合成技术的实例是固相合成和液相合成。作为固相合成，例如，将与待合成的肽的C-端相对应的氨基酸结合到在有机溶剂中不可溶的载体，并通过交替重复以下反应：在一个反应中将其氨基和侧链官能团被适当的保护基保护的氨基酸一个接一个地以从C-端到N-端的次序缩合，以及在一个反应中释放与树脂结合的氨基酸或所述肽的氨基的保护基，从而以这种方式延长肽链。取决于所使用的保护基类型，固相合成方法主要分类为tBoc法和Fmoc法。通常使用的保护基包括用于氨基的tBoc(叔丁氧基羰基)、Cl-Z(2-氯苄氧基羰基)、Br-Z(2-溴苄氧基羰基)、Bzl(苄基)、Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)、Mbh(4,4'-二甲氧基双二苯甲基)、Mtr(4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基)、Trt(三苯甲基)、Tos(甲苯磺酰基)、Z(苄氧基羰基)和Clz-Bzl(2,6-二氯苄基)；用于胍基的NO2(硝基)和Pmc(2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基)；和用于羟基的tBu(叔丁基)。在合成想要的肽之后，它经历去保护反应并从所述固体载体切下来。这样的肽切割反应，对于Boc法来说可以用氟化氢或三氟甲磺酸进行，而对于Fmoc法来说用TFA进行。

或者，可以利用重组技术合成所述肽。在这种情况下，核酸和/或遗传构建物包含以下序列或由以下序列组成：编码本发明的肽的核苷酸序列、具有与上述序列之一互补的核苷酸序列的多核苷酸和与所述多核苷酸在严格条件下杂交的序列。

本发明还涉及遗传构建物，其由如本文中定义的多核苷酸和允许本发明的肽在宿主细胞中表达(例如转录和翻译)的调节序列(例如合适的启动子、增强子、终止子等)组成，或包含所述多核苷酸和所述调节序列。

因此，在另一个方面，本发明涉及表达(或在合适的环境下能够表达)本发明的肽和/或含有本发明的多核苷酸或本发明的遗传构建物的宿主或宿主细胞。

产生所述肽的方法可以任选包含纯化所述肽、化学修饰所述肽、和/或将所述肽配制成药物组合物的步骤。

针对蛋白水解的进一步保护：

可以任选地对本文中描述的肽的N和C-端进行保护以对抗蛋白水解。例如，N-端可以是乙酰基的形式，和/或C-端可以是酰胺基的形式。也设想了所述肽抗蛋白水解的内部修饰，例如其中至少-CONH-肽键被以下键修饰和替代：(CH2NH)还原键，(NHCO)反转-倒置(retro-inverso)键，(CH2-O)亚甲基-氧键，(CH2-S)硫代亚甲基键，(CH2CH2)碳键(carbabond)，(CO-CH2)酮亚甲基键，(CHOH-CH2)羟基亚乙基键，(N-N)键，E-alcene键，或-CH＝CH-键。

例如，所述肽可以通过乙酰化、酰化、酰胺化、交联、环化、二硫键形成、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻基化、氧化、磷酸化等进行修饰。

本发明的肽可以由D构型的氨基酸构成，其使得所述肽抗蛋白水解。它们也可以通过分子内交联来稳定化，例如根据Walensky等，2004中描述的所谓的“订书钉(staple)”技术，通过用烯烃侧链、优选C3-C8烯基链、优选戊烯-2-基链修饰至少两个氨基酸残基，接着化学交联所述链。例如，第i和i+4至i+7位的氨基酸可以被显示出反应性烯烃残基的非天然氨基酸取代。所有这些抗蛋白水解的化学修饰肽都包括在本发明中。

在本发明的另一个方面，肽通过它们的C端末端或赖氨酸残基与聚乙二醇(PEG)分子共价结合，特别是1500或4000MW的PEG，以减少尿清除率和使用的治疗剂量以及增加血浆半衰期。在又一种实施方式中，通过将肽包含在用于药物递送系统形成微球的可生物降解和生物相容的聚合物材料中来增加所述肽的半衰期。聚合物和共聚物是例如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)(如US2007/0184015，SoonKap Hahn等中所说明的)。

在其他实施方式中，本发明的肽可以由树枝状聚合物或其他支化分子或由纳米粒子或纳米载体保护，它们可以囊封所述肽或者所述肽可以任选地与它们偶联。

核酸

本发明还涉及包含编码本发明的肽的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成的多核苷酸。

本发明的遗传构建物可以是DNA或RNA，优选cDNA，并优选是双链DNA。本发明的遗传构建物也可以是适合于预定的宿主细胞或宿主生物体转化的形式、适合于整合到预定宿主细胞的基因组DNA中的形式或适合于在预定的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建物可以是载体的形式，例如质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转座子。特别是，所述载体可以是表达载体，即可以提供体外和/或体内(例如在合适的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)表达的载体。

在优选但非限制的方面，本发明的遗传构建物包含i)至少一种本发明的核酸；所述核酸可操作地连接于ii)一个或多个调节元件例如启动子和任选的合适的终止子；并任选还有iii)一个或多个其他的遗传构建物元件，例如3'-或5'-UTR序列、前导序列、选择标志物、表达标志物/报道基因、和/或可以促进或提高转化或整合(的效率)的元件。

所述核酸尤其可以由病毒载体例如腺病毒或慢病毒携带以供离体或体内感染并表达本发明的肽。

治疗应用：

如本文中定义的肽或核酸可用作药物。

本文中提供了预防或治疗患者中涉及与细胞膜神经节苷脂粘附的病症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明的肽或编码这种肽的核酸。在优选实施方式中，提供了预防或治疗患者中神经退行性障碍的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明的肽或编码这种肽的核酸。

所述神经退行性障碍包括阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)(CJD)，它们全部已知涉及与GM1和/或GM3神经节苷脂粘附。

所述神经退行性障碍也可以是吉巴氏综合征(Guillain-Barrésyndrome)，其涉及GM1和GD1a神经节苷脂。在另一种实施方式中，提供了预防或治疗患者中的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明的肽或编码这种肽的核酸。一般而言，所有病原微生物似乎都使用在受感染细胞表面处的神经节苷脂作为受体位点。

所述感染性疾病有利地是病毒例如HIV、流感病毒、HCV、HBV、轮状病毒、BK病毒、埃博拉病毒感染，或细菌例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、或肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)感染。所述感染性疾病可以涉及细菌毒素，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。还包括朊病毒病，以及寄生虫例如恶性疟原虫(Plasmodium falfciparum)(其涉及与GM1a粘附)感染。

技术人员可以测量所述微生物的蛋白质(例如病毒的表面糖蛋白，例如HIV-1的gp120)与细胞膜神经节苷脂(例如GM3)之间的相互作用，以及本发明的嵌合肽对这些相互作用的抑制。为此目的，可以将所述神经节苷脂暴露在水相的表面以在水-空气界面处形成脂质单层。然后将微生物蛋白质注入面下水相中并通过测量表面张力来测定它们与所述神经节苷脂的相互作用。可进一步进行感染试验，以证实所述肽阻断所述感染的能力。

在又一种实施方式中，提供了预防或治疗患者中肿瘤的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明的肽、编码这种肽的核酸。

神经节苷脂作为特定决定因素的功能的确提示了它在组织生长和分化中以及在致癌中的重要作用。也参见Daniotti等，2013对肿瘤相关神经节苷脂的综述。

本发明的抗肿瘤治疗有助于根除任何持续性显微恶性肿瘤，和/或预防或延迟复发。

此外，所述肽(或编码这种肽的核酸)可以用于预防或治疗转移。

本发明的肽(或编码这种肽的核酸)在预防转移细胞、特别是通过血脑屏障的扩散或增殖中的确特别有用。

所述肿瘤可以是癌症，例如实体癌或血液癌。在优选实施方式中，所述肿瘤选自黑素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、T-细胞急性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、乳腺癌、肾癌。

药物组合物：

本发明的肽(或编码这种肽的核酸)可以通过任何便利的途径给药，包括静脉内、口服、透皮、皮下、粘膜、肌内、肺内、鼻内、胃肠外、直肠、阴道和局部给药。

所述肽与可药用载体相组合配制。

因而提供了包含与可药用载体相组合的如上文定义的肽(或编码这种肽的核酸)的药物组合物。

所述药物组合物还可以包括任何其他活性成分。

含有溶解或分散在其中的活性成分的药理组合物的制备是本领域中充分了解的并且不必基于制剂进行限制。通常这样的组合物作为液体溶液或悬液被制备为注射剂；然而，也可以制备适合于在使用之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制剂也可以被乳化。特别是，所述药物组合物可以配制成固体剂型，例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂、糖衣丸或颗粒剂。

介质的选择和所述介质中活性物质的含量通常根据活性化合物的溶解度和化学性质、具体给药模式和在制药实践中要遵守的规定来确定。例如，赋形剂例如乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和崩解剂例如淀粉、藻酸和某些复合硅酸盐与润滑剂例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石的组合可以用于制备片剂。为了制备胶囊，使用乳糖和高分子量聚乙二醇是有利的。当使用水悬液时，它们可以含有乳化剂或促进悬浮的试剂。也可以使用稀释剂例如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和氯仿或其混合物。

制备可以包括将需要的分子与试剂例如可注射的微球、生物蚀解粒子、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂质体配制在一起，所述试剂可以提供所述产物的控释或缓释。

在具体实施方式中，所述肽(或编码这种肽的核酸)可以通过电穿孔来施用。电穿孔又称为电通透化或电注射，是由于跨细胞膜、细胞或组织施加某些短而强的电场导致的细胞膜通透化。

给药量由技术人员选择并取决于所使用的给药途径和剂型。以单剂量或分剂量施用于受试者的肽的总日剂量可以是例如每日约0.001至约100mg/kg体重并优选0.01至10mg/kg/日的量。优选约5mg/kg的日剂量。剂量单位组合物可以含有这样的量：其分倍数可以用于构成日剂量。然而，应了解，任何具体患者的特定剂量水平将取决于各种各样的因素，包括体重、一般健康、性别、饮食、给药时间和途径、吸收和排泄速率、与其他药物的组合和所治疗的具体疾病的严重度。

优选所述肽在至少一周、优选至少两周时间期间，一天给药一次。

本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中公开，所述实验部分应该被认为是说明性的并且不限制本申请的范围。

实施例

实施例1：本发明的嵌合肽与细胞膜神经节苷脂的相互作用

材料和方法

材料.纯度>95％的合成肽从Schafer-N(哥本哈根，丹麦)获得。超纯无热原水来自于Biorad(Marnes La Coquette，法国)。所有脂质购自Matreya(Pleasant Gap，PA)。

分子建模.用Hyperchem 8程序(ChemCAD，Obernay，法国)按所描述的(Fantini和Yahi，2011a)进行肽-神经节苷脂相互作用的计算机(In silico)研究。用Hyperchem 8、PDB-viewer(Guex等，1997)和Molegro Molecular Viewer(Thomsen等，2006)软件将所述分子可视化。

脂质单层试验.用Langmuir膜平衡技术，利用Kibron微量张力仪按以前所描述的(Fantini和Yahi，2011a)研究肽-胆固醇相互作用。

钙测量.将细胞在35mm培养皿中铺板，在72h期间生长并用5μM Fluo-4AM(Invitrogen-Life Technologies，Saint Aubin，法国)在黑暗中加载30min，用HBSS(Gibco-Life Technologies，Saint-Aubin，法国)洗涤三次，并在37℃温育20min。在配备有照明系统MT20模块的直立显微镜物镜(BX51W Olympus，Rungis，法国)的正上方的记录腔中注入肽之后，通过测量细胞荧光强度的变化来估算钙通量。在490nm激发荧光之后，通过数字照相机CDD(ORCA-ER Hamanatsu，日本)对525nm处的荧光发射进行成像。利用CellR软件(Olympus)收集延时图像(1帧/10s)。将信号表示为处理之后的荧光(Ft)除以处理之前的荧光(F0)乘以100。按以前所描述的(Di Scala等，2014；Fantini等，2014)，将结果进行平均并将每个值减去对照的荧光百分数。

结果

下面指出了α-突触核蛋白和Aβ的最小糖脂结合结构域的氨基酸序列：

人α-突触核蛋白34-45：KEGVLYVGSKTK(SEQ ID NO：4)

人Aβ5-16：RHDSGYEVHHQK(SEQ ID NO：5)

嵌合α-syn34-45/HH：KEGVLYVGHHTK(SEQ ID NO：3)

用丙氨酸替代Aβ5-16中的两个组氨酸残基，导致与GM1的相互作用完全丧失(图1A)。在这个实验中，在空气-水界面处制备神经节苷脂GM1单层，并将所述肽注入面下水相中。所述肽与所述神经节苷脂的相互作用通过所述单层的表面压力增加来证明，这用铂探头进行实时追踪(参见Thakur等，2009对该技术和它应用于淀粉样蛋白质的充分描述)。对于野生型Aβ5-16肽来说，所述表面压力在所述肽注入之后立即开始增加，在温育30分钟之后达到最大值。相反，双重突变体His-13Ala/His-14Ala不与GM1相互作用(图1A)。然后对单突变体进行测定以鉴定所述两个His中哪一个对于GM1识别来说是真正关键的。意外的是，二者似乎都涉及，因为每个单突变体(His-13Ala和His-14Ala)都观察到相互作用的完全丧失。分子建模模拟对该结果有一些启示(图1B)。在Aβ5-16和GM1之间形成稳定的复合体需要两个GM1分子为所述肽形成高脚杯样托。在这种模型中，His-13与一个GM1相互作用，His-14与第二个GM1相互作用。显然，这两个GM1分子之间的协作允许获得由组氨酸残基驱动的与所述Aβ5-16肽的最佳相互作用。相反，因为α-突触核蛋白(α-syn34-45)缺乏这些组氨酸残基，α-突触核蛋白(α-syn34-45)的糖脂结合结构域对神经节苷脂GM3而不是GM1具有明显的偏好。

鉴于组氨酸残基在Aβ5-16与GM1二聚体的高亲和性相互作用中的关键作用，本发明人决定在α-syn34-45中引入相似的相邻His残基对，并合成了嵌合的α-syn34-45Ser-42His/Lys-43His(称为α-syn/HH，图1C)。因为无论Ser-42还是Lys-43看来都不参与GM3结合，所以本发明人推测这种双重突变不会干扰嵌合α-syn/HH肽与GM3单层的相互作用。如图2中所示，所述α-syn/HH肽完全按所预测的表现。它与GM3的相互作用动力学与野生型α-syn34-45肽完全相同(图2A)，并且对于所述野生型和嵌合肽二者来说，插入临界压力(πc)据估算是37.5mN.m^-1(图2B)。πc与结合亲和性成正比；这个参数对应于所述单层的表面压力，在所述单层的上方因为所述糖脂过于密集地堆积，所以不出现相互作用(Thakur等，2009；Fantini等，2011b)。因此，在α-syn34-45中引入所述His残基对完全不干扰所述肽的GM3-结合能力。相反，所述嵌合α-syn/HH肽获得了对GM1亲和性的明显提高，这在实时动力学研究中清楚地观察到(图2C)。此外，用GM1单层测得的πc值从野生型α-syn34-45肽的25mN.m^-1增加到在α-syn/HH情况下的37.5mN.m^-1，这指示所述嵌合肽对GM1的显著增强的亲和性(图2D)。

所述野生型和α-syn/HH肽的计算机分析表明它们占据相同的分子体积。然而在所述α-syn/HH肽中引入所述His残基对导致静电势的更对称分布(图3A)。因此，所述野生型α-syn34-45和所述嵌合α-syn/HH肽在它们与GM1的阴离子糖基头部基团的相互作用方式上有很大差异。如图3B(左图)所示，α-syn34-45在GM1单体的突出的糖部分周围采取弯曲的形式。因为它更平衡的静电场分布，所述嵌合肽可与排列成典型的高脚杯样托的GM1分子二聚体形成稳定的复合体(图3B，右图)。对于Aβ5-16/GM1复合体，α-syn/HH的每个His残基以可以与在花杯上的蝴蝶翅膀相比拟的方式与它自己的GM1神经节苷脂相互作用。在图1C中给出了α-syn/HH和所述GM1二聚体之间分子间相互作用的详细描述。总之，这些数据强烈支持以下观点：所述His残基对于将GM1分子募集成为能容纳淀粉样蛋白质的糖脂结合结构域的功能性高脚杯状二聚体来说是关键的。

进行几个实验来验证这个结论。首先，发明人分析了所述α-syn/HH肽与一系列糖脂的相互作用。事实上，该嵌合肽表现出对神经节苷脂(GM1，GM3，GM4，GD1a，GD3和GT1b)的选择性亲和力，而与中性糖脂(GalCer，LacCer，脱唾液酸-GM1)的反应很差(图4A和表1)。

表1.野生型α-syn34-45和嵌合α-syn34-45/HH肽的神经节苷脂特异性.

所有相互作用都用神经节苷脂单层测量。所述肽以浓度10μM添加到面下水相中。(+)是指插入临界压力<25mN.m^-1，并且(+++)是指插入临界压力>25mN.m^-1。

这表明，对于结合来说，需要在所述糖脂的糖基部分中存在至少一个唾液酸，与分子建模数据完全一致(图1C)。然后，本发明人分析了脂质环境对GM1和所述嵌合α-syn/HH肽之间相互作用的影响。在这个实验中，本发明人制备了GM1/胆固醇和GM1/磷脂酰胆碱的混合单层并追踪α-syn/HH与这些单层的相互作用的动力学。如图4B所示，胆固醇大幅加速α-syn/HH肽与GM1的相互作用，而磷脂酰胆碱反而倾向于减慢所述反应。这和胆固醇与GM1形成缩合复合体的众所周知的效应(Radhakrishnan等，2000)一致，允许对糖脂构象进行固醇控制(Yahi等，2001；Lingwood等，2011)。此外，据显示，胆固醇与GM1的相互作用使GM1二聚体的所述高脚杯样构象稳定化(Fantini等，2013)。在这方面，预计胆固醇加速所述相互作用而不提高α-syn/HH对GM1的亲和性(所述活性构象可以在没有胆固醇下实现，但具有延迟的动力学，如图4B所示)。混合GM1/胆固醇单层的πc的实验测定(37.5mN.m^-1)强烈支持这种观点(图4C)。

当将所述神经毒性Aβ1-42肽与预先负载有荧光敏感染料Fluo-4AM的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞一起温育时，观察到细胞内Ca²⁺水平急剧增加(图5)。这种诱导的Ca²⁺水平升高在存在等摩尔量的嵌合α-syn/HH肽的条件下显著降低(图5A)。这种效应高度依赖于His残基对的存在，因为相比之下，野生型嵌合α-syn34-45肽只有很少的抑制活性(图5B)。这与GM1而不是GM3在阿尔茨海默氏β-淀粉样肽的神经毒性中发挥突出的作用相符(Fantini等，2010；Fantini等，2013)。最后，应该注意，所述嵌合α-syn/HH肽本身对Ca²⁺通量的影响甚微，表明缺乏内在神经毒性。

实施例2：通过血脑屏障转运

为了研究嵌合肽α-syn34-45/HH：KEGVLYVGHHTK(SEQ ID NO：3)通过血脑屏障(BBB)的转运，本发明人基于内皮细胞(鼠bEnd-3细胞，ATCC#CRL-2299)单层重构了功能性细胞系统。这些细胞以10.000到50.000个细胞/孔的各种密度在两隔室细胞腔(GreinerBio-one)中铺板。所述腔的下隔室是作为12-孔培养板的一部分的孔。上隔室配备有可渗透的滤器(平均孔隙直径0.4μm)，所述细胞被接种在所述滤器上。所述细胞在DMEM/F12 10％胎牛血清中培养。

在汇合时，所述细胞形成跨内皮电阻为150-200Ω.cm²(用WPI的EVOM设备测量)的均匀的单层。所述跨内皮电阻反映了在整个培养物上存在紧密连接。这些紧密连接有效地阻止了分子的细胞旁穿过。当这个值>100Ω.cm²时，认为所述内皮是紧密的。因此，所有实验都用功能性内皮屏障来进行。

已经使用了三种屏障模型：i)纯bend-3细胞单层，ii)与铺在所述培养腔的下隔室中的星形胶质CTX-TNA2细胞(ATCC#CRL-2006)共同培养的bEnd-3细胞单层，和iii)与铺在所述培养腔的下隔室中的神经胶质C6细胞(ATCC#CCL-107)共同培养的bend-3细胞单层。使用共同培养系统的理由是由于所述神经胶质细胞分泌营养因子而改善重构的内皮的分化。在所有情况下，这些不同的培养系统中跨内皮电阻的值始终超过150-200Ω.cm²。

跨内皮电阻的典型值是：

-纯bEnd-3单层：185Ω.cm²。

-bEnd-3/CTX-TNA2：153Ω.cm²。

-bEnd-3/C6：186Ω.cm²。

将所述嵌合肽注入所述培养腔的下隔室，并且分析它随时间变化的在下和上隔室二者中的浓度。由此实时追踪所述肽经内皮屏障的穿过。所述嵌合肽的浓度通过分光光度法测定。在添加所述肽之后的不同时间从所述培养基收获2μL的等份试样，以致在实验结束时收获的全部体积是初始体积的<10％。进行所述肽的全光谱以确定A230/A275比率，所述比率显示出6的特征值(所述肽具有11个在230nm处吸收的肽键和在275nm处有峰的酪氨酸残基)。

2.1.穿过纯bend-3屏障的动力学

在这个实验中，将所述肽注入平均跨内皮电阻为185Ω.cm²的纯bend-3细胞紧密单层的下方。将所述细胞在PBS-Ca²⁺中漂洗两次，然后在没有肽的条件下(上隔室，只有PBS-Ca²⁺)或与600μM嵌合肽(下隔室)温育。使用含钙缓冲液例如PBS-Ca²⁺对于在整个实验过程中保持紧密连接的完整性是必要的(温育24小时后，所述跨内皮电阻仍然高达162Ω.cm²)。因此所述肽没有引起任何对所述内皮细胞的毒性，并且最重要的是，没有通过对紧密连接的直接作用而影响所述细胞的屏障功能。

如由分光光度分析所评估的，所述嵌合肽逐渐出现在上隔室中。

所有光谱的A230/A275比率都等于6，这表明的确从上隔室回收了所述嵌合肽，而不是细胞蛋白质。所述嵌合肽穿过内皮屏障的动力学示出在图6上。

2.2.穿过bEnd-3/C6屏障的动力学

用bEnd-3/C6系统得到了相似的数据。在这种情况下，将所述bend-3细胞在铺在所述培养腔的下隔室中的C6细胞存在下共同培养6天。对于该实验来说，将所述上隔室转移到新板中，以便在转运分析期间不存在共同培养的神经胶质细胞。事实上，所述共同培养的细胞只在bEnd-3细胞生长和分化期间存在。

在这种共同培养系统中，所述跨内皮电阻值在t_o(肽注入时间)时是186Ω.cm²，并且在与肽一起温育24小时后是152Ω.cm²。因此，所述肽的存在没有显著影响紧密连接的功能性，因为所述跨内皮电阻仍然>100Ω.cm²。

在所述上隔室中回收的肽浓度示出在图7上。

2.3.穿过bEnd-3/CTX-TNA2屏障的动力学

最后，本发明人研究了嵌合肽通过bend-3/CTX系统的跨内皮穿过。在这种情况下，将所述bEnd-3细胞在铺在所述培养腔的下隔室中的CTX-TNA2细胞存在下共同培养6天。将所述上隔室转移到新板中并如第2段(bEnd-3/C6系统)中所述进行该实验。

在这种情况下，所述跨内皮电阻值在t_o(肽注入时间)时是154Ω.cm²，并且在与肽一起温育24小时后是153Ω.cm²。同样地，所述肽的存在没有显著影响紧密连接的功能性，因为所述跨内皮电阻仍然>100Ω.cm²。

在所述上隔室中回收的肽浓度示出在图8上。

应该注意，在所述bEnd-3/CTX屏障系统的情况下，存在双相转运过程，其中在前两分钟速率很高，然后是更经典的动力学。

2.4.结论

出于比较用于研究所述嵌合肽的穿过的三个BBB系统的效率的目的，我们将在温育1小时和24小时后在所述上隔室中回收的肽的浓度绘图。图9A和9B上显示的直方图表明得到的结果明显是趋同的。

只有单独的PBS的实验显示，所述细胞没有产生可以干扰我们的嵌合肽定量方法(A230/A275)的任何污染物。总之，所述bEnd-3/C6共同培养系统在1小时和24小时时给出了最好的联合结果。

最后，如图10所示，本发明人已经核实，所述嵌合肽通过重构的内皮屏障在上(受体，三角形)隔室中的出现与它从下(供体，圆形)隔室的进行性消失相抵消。

总之，这些数据表明所述嵌合肽从重构的BBB(bEnd-3细胞，纯的或与两种类型的神经胶质细胞共同培养)的一侧转运到另一侧。

实施例3：所述嵌合肽阻断由于形成帕金森氏病相关蛋白质α-突触核蛋白的低聚淀粉样蛋白孔隙而引起的Ca²⁺通量。

在实施例1(图5)中，本发明人表明所述嵌合肽治愈了被阿尔茨海默氏β-淀粉样肽中毒的神经细胞(SH-SY5Y细胞)。具体来说，他们表明，在与阿尔茨海默氏β-淀粉样肽1-42(220nM)温育后，这些细胞在它们的质膜中发生低聚淀粉样蛋白孔隙的形成。这些孔隙引起Ca²⁺离子从细胞外介质大量进入。在等摩尔浓度的嵌合肽(“Pep Chim”，220nM)存在下，不再能形成这些孔隙，因为所述肽有效阻止阿尔茨海默氏β-淀粉样肽1-42在神经元细胞表面与神经节苷脂GM1相互作用。在图11A中示出了这一点。

与阿尔茨海默氏β-淀粉样肽1-42相反，帕金森氏病相关的α-突触核蛋白与神经节苷脂GM3而不是GM1相互作用。所述嵌合肽是通用的神经节苷脂结合肽，其以相似的亲和性与GM1和GM3二者相互作用。在此基础上，本发明人预期所述嵌合肽可以将神经细胞从由α-突触核蛋白低聚物形成的毒性淀粉样蛋白孔隙中治愈。

首先使SH-SY5Y细胞负载有Ca²⁺-敏感探针Fluo4-AM，然后与220nMα-突触核蛋白温育。这引起Ca²⁺-可渗透的淀粉样蛋白孔隙形成，导致Ca²⁺-大量进入所述细胞内部(图11B)。当将所述嵌合肽(220nM)与α-突触核蛋白一起注入细胞培养物中时，不再发生孔隙形成，因为所述嵌合肽阻止α-突触核蛋白在所述神经元细胞膜上与GM3相互作用。因此，所述嵌合肽完全废止了由α-突触核蛋白引起的Ca²⁺通量。

总之，现在证明了所述嵌合肽在神经细胞培养物中表现出抗阿尔茨海默和抗帕金森性质。

实施例4：“反向”肽的合成和测试

因为SEQ ID NO：3的嵌合肽与形成对称的高脚杯样相互作用表面的神经节苷脂二聚体相互作用，本发明人测试了其中组氨酸残基对被移到嵌合肽的N-端部分的嵌合肽的神经节苷脂结合能力。因此，这种所谓的“反向”嵌合肽的氨基酸序列是KEHHGVLYVGTK(SEQ IDNO：11)。

将神经节苷脂GM1或GM3的单层在空气-水界面处展开，并将所述反向嵌合肽以10μM的浓度注入面下水相中。所述肽与这些神经节苷脂的相互作用通过实时测量所述单层的表面压力来评估，所述压力以mN/m表示。图12中示出了所述反向嵌合肽与神经节苷脂GM1和GM3单层的相互作用动力学。

这些数据表明所述反向嵌合肽识别GM1和GM3神经节苷脂二者。这种双重识别是通过在α-突触核蛋白34-45序列框中引入组氨酸残基对而赋予的。与本发明中描述的SEQ IDNO：3的原型嵌合肽相比，SEQ ID NO：11的“反向嵌合肽”具有不同位置的组氨酸残基对。因为嵌合肽的生物活性依靠于由所述组氨酸残基对赋予的通用的神经节苷脂结合性质，因此，本发明人预计所述反向嵌合肽也显示出令人感兴趣的抗阿尔茨海默、抗帕金森、抗克-雅二氏、抗病毒、抗菌和抗肿瘤性质。

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Claims

1.肽，其由氨基酸序列KEGVLYVGHHTK(SEQ ID NO：3)组成。

2.核酸，其编码如权利要求1所限定的肽。

3.药物组合物，其包含与可药用载体相组合的权利要求1的肽。

4.药物组合物，其包含与可药用载体相组合的权利要求2的核酸。

5.根据权利要求1所述的肽或根据权利要求2所述的核酸用于制造药物的用途，所述药物用于预防或治疗涉及与细胞膜神经节苷脂粘附的病症。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述病症是神经退行性障碍。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述障碍选自阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、克-雅二氏病(CJD)、或吉巴氏综合征。

8.根据权利要求5所述的用途，其中所述病症是感染性疾病。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述感染性疾病是病毒感染。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述感染性疾病是HIV或流感病毒感染。

11.根据权利要求8所述的用途，其中所述感染性疾病是细菌感染。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述感染性疾病是幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)或霍乱弧菌(Vibrio cholerae)感染。

13.根据权利要求5所述的用途，其中所述病症是肿瘤。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述病症是癌症。

15.根据权利要求1所述的肽或根据权利要求2所述的核酸用于制造药物的应用，所述药物用于预防转移细胞的扩散或增殖。