CN106093475B - 一种利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，包括采用有机溶剂对纯钛金属或低模量双相钛金属进行阳极氧化；采用显微手段表征所述阳极氧化的产物显微结构；制备纳米孔和纳米管形貌的钛金属件；分离骨髓间充质干细胞，取三代细胞黏附在经表面修饰的金属件上孵育；通过MTT、DYPI细胞核染色、SEM观察细胞的黏附效果；将孵育细胞的金属测试件放于无菌弹性板的培养孔中，恒温状态下置于万能试验系统给予不同周期、频率和载荷压应力；在SEM电镜或光学显微镜观察、测试细胞形变，并检测细胞增殖、分化表现。本发明所述方法能够使得修饰后的钛基底表面的弹性形变信号被放大，从而影响附着其上的成骨细胞获得更大刺激，引起更大的细胞骨架改变。

Description

一种利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法
技术领域
本发明涉及医用生物材料领域，尤其涉及一种利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法。
背景技术
钛金属在适当应力刺激下会发生非线弹性形变，这种形变受弹性模量、形态、直径、立体构架等物理要素的影响，在负重行走或弹跳等过程中，循环往复的应力会导致钛金属支架产生极其细微的弹性形变；而成骨细胞及干细胞是力学信号敏感或响应细胞，研究证明在细胞与基底间的各种力学信号可通过干细胞表面受体激活特定的力转导途径进而调节干细胞的分化。即使在缺乏生物化学刺激的情况下力学因素也能调控干细胞自我更新和谱系分化。但单纯的钛金属支架弹性形变非常细微，对细胞骨架的改变也非常细微，这就造成了成骨细胞或干细胞分化速度减小和比例减少，不利于各类骨的修复和替换。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，能够使得改性后的钛基底表面的弹性形变信号被放大，从而影响附着其上的成骨细胞获得更大刺激，引起更大的细胞骨架改变。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何放大钛金属弹性形变的信号，使之引起更大的细胞骨架改变。
为实现上述目的，本发明提供了一种利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，包括以下步骤：
步骤1、采用有机溶剂对纯钛金属或低模量双相钛金属进行阳极氧化；
步骤2、采用显微手段表征所述阳极氧化的产物显微结构；
步骤3、制备纳米孔和纳米管形貌的钛金属表面纳米化修饰测试件；
步骤4、分离骨髓间充质干细胞hMSCs，取三代细胞黏附在经表面纳米化修饰的金属测试件上孵育；
步骤5、通过MTT法、DYPI细胞核染色法、SEM观察细胞的黏附效果；
步骤6、将孵育细胞的金属测试件放于无菌弹性板的培养孔中，恒温状态下置于万能试验系统给予不同周期、频率和载荷压应力；
步骤7、在SEM电镜或光学显微镜观察、测试细胞形变，并检测细胞增殖、分化表现。
进一步地，步骤1中，所述有机溶剂为醇基氧化介质。
进一步地，所述醇基氧化介质为含有钙和磷元素的乙醇溶液。
进一步地，步骤2中，所述显微手段包括场发射扫描电镜、原子力显微镜、X射线衍射仪、俄歇能谱仪、X射线光电子能谱仪。
进一步地，步骤2中，所述显微结构包括相组成、晶体结构、微观形貌和元素分布。
进一步地，步骤3中，所述纳米管的高度为100nm～1000nm。
进一步地，步骤4中，所述三代细胞的取用量为1*104/ml。
进一步地，步骤4中，所述孵育的时间为4～12小时。
进一步地，步骤7中，所述载荷压应力为100～500N。
进一步地，所述纳米管的高度为1000nm。
为了提高钛合金的抗腐蚀性和生物学性能，包括生物相容性和生物活性，常常需要对钛合金进行表面改性。通过调整阳极氧化工艺参数，可以在钛金属表面制作纳米坑、纳米管等不同形貌。当细胞接种在不同纳米管长度的材料表面时，相同的基底变形即可导致不同的细胞形变量。目前已可以在钛金属表面制备大面积均匀生长的具有良好生物学特性的纳米坑及纳米管阵列，并且实现了对纳米管高度、直径等的可控制备。本发明所述的技术方案就是利用在钛金属表面制备不同高度的纳米管来控制附着在金属上的细胞的形变量。在纳米坑表面，细胞形变量最小，随着纳米管高度的增加，同样的钛金属基底形变就会造成附着在其表面细胞的骨架发生更大的变化，也即通过纳米管高度可以放大钛金属形变产生的力学信号。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是纯钛金属表面附着成骨细胞或干细胞的示意图；
图2是纯钛金属经过表面改性后附着成骨细胞或干细胞的示意图；
图3是本发明的一个较佳实施例的较长纳米管附着成骨细胞或干细胞的示意图；
其中，1-骨髓间充质干细胞，2-钛金属基底，3-氧化钛纳米管。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明提供了一种利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，如图1、图2和图3所示，包括以下步骤：
采用有机溶液(以醇基氧化介质为电解液，如含钙和磷元素的乙醇溶液)对纯钛及低模量双相钛金属测试件进行阳极氧化，用场发射扫描电镜、原子力显微镜、X射线衍射仪、俄歇能谱仪、X射线光电子能谱仪等手段系统表征阳极氧化产物的显微结构，包括相组成和晶体结构、微观形貌、元素分布等。制备纳米孔和100nm，200nm，500nm,1000nm不同高度的纳米管形貌的钛金属表面纳米化修饰测试件。
分离骨髓间充质干细胞hMSCs，取1*104/ml的三代细胞与未处理及表面纳米化修饰的金属测试件孵育4h、8h及12h。通过MTT法、DYPI细胞核染色法、SEM等技术观察细胞的黏附效果。将孵育细胞的金属测试件放于无菌弹性板的培养孔中，恒温状态下置于万能试验系统给予不同周期、频率和载荷压应力。未加力试件作为对照组。
SEM电镜、光学显微镜等观察、测试细胞形变，并检测细胞增殖、分化表现。实验显示，给予钛金属基底相同的形变，细胞形变量随纳米管高度增加而增加。给予200μm*2.25cm钛金属基底100～500N压应力，在相同基底形变情况下，钛金属试件中心位置，非纳米化表面细胞形变量为0.5％，100nm高度纳米管表面细胞出现1％的形变，随着纳米管高度增加，细胞形变量逐渐增加至1000nm时3％的细胞形变。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、采用有机溶剂对纯钛金属或低模量双相钛金属进行阳极氧化；
步骤2、采用显微手段表征所述阳极氧化的产物显微结构；
步骤3、制备纳米孔和纳米管形貌的钛金属表面纳米化修饰测试件，所述纳米管的高度为100～1000nm；
步骤4、分离骨髓间充质干细胞hMSCs，取三代细胞黏附在经表面纳米化修饰的金属测试件上孵育4～12小时；
步骤5、通过MTT法、DYPI细胞核染色法、SEM观察细胞的黏附效果；
步骤6、将孵育细胞的金属测试件放于无菌弹性板的培养孔中，恒温状态下置于万能试验系统给予所述金属测试件不同周期、频率和载荷压应力；
步骤7、在SEM电镜或光学显微镜观察、测试细胞形变，并检测细胞增殖、分化表现。
2.如权利要求1所述的利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，其特征在于，步骤1中，所述有机溶剂为醇基氧化介质。
3.如权利要求2所述的利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，其特征在于，所述醇基氧化介质为含有钙和磷元素的乙醇溶液。
4.如权利要求1所述的利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，其特征在于，步骤2中，所述显微手段包括场发射扫描电镜、原子力显微镜、X射线衍射仪、俄歇能谱仪、X射线光电子能谱仪。
5.如权利要求1所述的利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，其特征在于，步骤2中，所述显微结构包括相组成、晶体结构、微观形貌和元素分布。
6.如权利要求1所述的利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，其特征在于，步骤4中，所述三代细胞的取用量为1*104/ml。
7.如权利要求1所述的利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，其特征在于，步骤6中，所述载荷压应力为100～500N。
8.如权利要求1所述的利用纳米管高度辅助控制细胞骨架改变的方法，其特征在于，所述纳米管的高度为1000nm。
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