CN106083533B - 一种抑制根结线虫卵孵化的天然物质的提取工艺 - Google Patents

一种抑制根结线虫卵孵化的天然物质的提取工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从大葱根系分泌物中提取抑制根结线虫卵的天然物质。本发明利用植物与根结线虫间的相生相克的化感作用，自行研制出一套大葱根系分泌物收集装置，并从中提取出一种抑制根结线虫卵孵化的天然物质4‑羟基苯乙醇，从而达到利用天然物质绿色防治根结线虫病的目的。本发明利用天然物质进行根结线虫的防治，可大幅减少农药的使用，降低根结线虫病的发生，提高黄瓜产品的安全性，减轻农药对环境和土壤的危害，具有显著的社会、经济和生态效益。

Description

一种抑制根结线虫卵孵化的天然物质的提取工艺
技术领域
本发明涉及抑制蔬菜作物根结线虫卵孵化的天然物质，特别是一种从大葱根系分泌物中提取出的抑制根结线虫卵的天然物质，属于蔬菜作物生物绿色防治技术领域。
背景技术
根结线虫是危害农作物的重要病原生物之一，它广泛分布于世界各地，主要寄生在蔬菜、粮食作物、经济作物、果树、观赏植物及杂草等2000多种寄主上。目前我国报道的根结线虫有29种，引起农作物损失的90％以上是由南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫及北方根结线虫等4个主要种引起的。植物被根结线虫侵染后，可造成根系的衰弱、畸形或腐烂，致使植物地上部分的茎和叶发育不良，甚至枯死。根结线虫除了能直接对作物造成损害外，还能使真菌和细菌病害适于发生，是发生植物病害的一个重要诱因。植物在根结线虫病害发生后一般减产10～20％，严重的达75％以上，已成为我国蔬菜主要土壤病害。
目前国内外对根结线虫的防治以化学药剂防治为主，主要使用人工合成的杀线虫剂，但无论是熏蒸性还是非熏蒸性药剂，不仅成本高，而且对植物病原线虫的毒杀作用都是非特异性的。另外，这些杀线虫剂的毒性较高、环境相容性差，极易造成对人及其他非靶标生物的危害，并严重污染环境，因此各国都在逐渐地限制使用这些化学药剂。
植物根系能够感知根际中微生物的存在，并通过根尖分泌一系列物质，诱导菌群繁殖，改变微生物的种类和数量，抑制致病菌的生长。近年来，在全球可持续发展战略全面实施和建设环境友好型社会的背景下，根结线虫的生物防治研究成为生命科学领域内一大热点。人们从植物体内的次生物质中寻找能抑制根结线虫的成分并进行直接或间接的利用，至今已有40多科，近100种植物被报道有杀线虫活性。报道的具有杀线虫活性的植物化合物也有10几类，100余个，主要是多联噻吩类、多炔类、异硫氰酸盐类、生物碱类、脂肪酸及其衍生物类、萜类及酚类等化合物。
我们经多年试验证实，大葱与黄瓜伴生栽培能显著减轻其根结线虫病的发生，同时显著降低其它根部病害的发生，并对其作用机理进行了深入研究。大葱根系分泌物中防治根结线虫发挥主要作物的物质在国内尚无报道。
发明内容
本发明旨在深入研究大葱伴生栽培对黄瓜根结线虫病害防治及作用机理，自行研制出一套模拟仿生大葱根系分泌物提取装置，并通过该装置对大葱根系分泌物进行科学有效的提取和分离，最终获得了一种能够抑制根结线虫卵孵化的天然物质。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种抑制根结线虫卵孵化的天然物质的提取工艺，其特殊之处在于，包括以下提取步骤：
步骤一：水培法葱根系分泌物的收集
将大葱根系彻底清洗并去掉所有杂质，之后用超纯水清洗干净，放入专用的水培法葱根系分泌物收集装置内，培养期为50-60天；培养结束后，称量大葱根系鲜重，将含有大葱根系分泌物的营养液进行收集，并将其减压浓缩至2.0-2.5g.ml-1；
所述水培法葱根系分泌物收集装置主要由培养箱、连接于所述培养箱内并对其提供输氧充气的充气输氧器构成，其中所述的培养箱为矩形的箱体结构，由箱体和箱盖构成，所述箱体内部盛放有营养液，所述箱盖上预留定位通孔，所述定位通孔便于大葱穿过并对大葱上部起到固定作用，在所述培养箱的底部铺设有浸没于所述营养液内的陶粒，所述培养箱中的陶粒铺设量占所述营养液体积的30-40％；
所述陶粒的预处理过程包括：首先用自来水充分刷洗干净，完全去掉表面的杂质，然后用超纯水浸泡10-12小时，晾干待用；
所述营养液是由色谱纯级别药品和超纯水配制而成，具体配方为(mmol/L)：K2SO40.75，MgSO4 0.65，KCl 0.1，Ca(NO3)2 2.0，KH2PO4 0.25，EDTA-Fe 0.1，H3BO3 1×10-2，(NH4)6Mo7O24 5×10-6，MnSO4 1×10-2，CuSO4 1×10-4，ZnSO4 1×10-3。
步骤二：大葱根系分泌物的萃取分离
取经步骤一减压浓缩后的葱根系分泌物100ml，分别用乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷和正丁醇四种有机溶剂按体积比2：1的比例萃取3次后，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干粉状，溶于5mL甲醇中，放入-20℃冰箱中保存，即得本发明所述的抑制根结线虫卵孵化的天然物质。试验确定，经正丁醇萃取的大葱根系分泌物抑制根结线虫卵孵化的效果最明显，经分析测定，正丁醇萃取的大葱根系分泌物的天然物质中的主要成分为4-羟基苯乙醇。
以上所有药品均采用色谱纯级别。
本发明对大葱根系分泌物的收集提取确认过程，对于大葱伴生栽培提供了研究基础，可以直接或间接的将本发明利用在大葱伴生蔬菜栽培上，在此基础上，本发明进一步公开了一种大葱伴生黄瓜的栽培方法，该方法只需在黄瓜定植时，在黄瓜两侧5cm位置各定植一颗高度为10-15cm的大葱，利用大葱根系生长过程中的分泌物，即可对根结线虫病进行有效的防治。大葱及黄瓜定植后，以黄瓜生长特性进行日常管理即可，不用专门进行大葱的生长管理，黄瓜拉秧时，进行大葱的采收。
利用上述大葱伴生栽培黄瓜，在黄瓜盛果期可减少黄瓜根际土壤中二龄根结线虫数量，减少幅度达75.29％；根结线虫病发生率显著降低，仅为12.5％。
本发明对大葱根系分泌物防治根结线虫的防治及作用机理进行深入研究，并通过自行研制的一套模拟防生大葱根系分泌物提取装置，结合萃取工艺获得了大葱根系分泌物中能够有效抑制根结线虫卵孵化的天然物质，并进一步研究确定该天然物质防治根结线虫的作用方式主要是抑制根结线虫卵的孵化，其对根结线虫卵孵化抑制率可达95％，发挥主要作用的物质是4-羟基苯乙醇。
本发明明确了大葱伴生栽培抑制根结线虫病发生的作用机理，即通过大葱根系分泌物抑制了根结线虫卵的孵化，从而减轻了根结线虫病的发生，并进一步明确了大葱根系分泌物中发挥作用的主要物质。该物质的确定，为以后研发仿生药剂提供了理论基础。本发明同时提供了一种操作简便、成本低廉、防治根结线虫效果良好的种植方法，从而在基础理论和实际应用两方面为大规模推广大葱伴生栽培防治根结线虫病提供了坚实的基础。本发明实现了对根结线虫病的绿色防治，大规模应用后，可大幅减少农药的使用，提高黄瓜产品的安全性，减轻农药对环境和土壤的危害，保护了环境，具有显著的社会、经济和生态效益。
附图说明
图1：本发明步骤一中所用的水培法葱根系分泌物收集装置结构示意图；图中，1、培养箱，2、充气输氧器，3、营养液，4、陶粒，5、大葱；
图2：正丁醇组份(C组份)处理根结线虫卵孵化率示意图；
图3：正丁醇组份(C组份)处理根结线虫卵孵化情况示意图；图3中的1是代表加入大葱根系分泌物后第1天；2是代表自然孵化第1天；3是代表加入大葱根系分泌物后第12天；4是代表自然孵化第12天；
图4：葱根系分泌物中正丁醇组份GC-MS鉴定图谱；
图5：黄瓜盛果期不同处理根系情况图。
具体实施方式
下面对本发明一种抑制根结线虫卵孵化的天然物质提取工艺作以下详细说明。
一、大葱根系分泌物的提取
1、水培法葱根系分泌物收集装置
为了更有效的进行大葱根系分泌物的收集，我们自制了一个水培法葱根系分泌物收集装置，它由一个培养箱1和小型的充气输氧器2组成(参见图1)，所述的培养箱1为矩形的箱体结构，由箱体和箱盖构成，所述箱体内部盛放有营养液，所述箱盖上预留定位通孔，所述定位通孔便于大葱穿过并对大葱上部起到固定作用。为了更真实的模拟葱根系生长的自然环境，刺激大葱根系分泌更多的分泌物，我们在培养箱1的箱体内放置了清洗干净的陶粒4，以便让大葱根系扎入到陶粒4中。陶粒4性能稳定，不会释放任务微量元素。选择的陶粒4首先用自来水充分洗刷干净，完全去掉表面的杂质，然后用超纯水浸泡12小时，晾干待用。陶粒4占培养箱中营养液3体积30-40％。
2、营养液的配制
大葱根系分泌物营养液采用超纯水配制，具体配方(mmol/L)：K2SO4 0.75，MgSO40.65，KCl 0.1，Ca(NO3)2 2.0，KH2PO4 0.25，EDTA-Fe 0.1，H3BO3 1×10-2，(NH4)6Mo7O24 5×10-6，MnSO4 1×10-2，CuSO4 1×10-4，ZnSO4 1×10-3，所有药品均为色谱纯级别。
3、大葱根系分泌物的收集
挑选长势一致、株高15cm左右的大葱根系进行彻底清洗，去掉所有杂质，最后用超纯水清洗干净，放入培养箱中进行培养，时间为50-60天。培养结束后，将大葱的根系裁切下来，称量大葱根系鲜重，收集营养液，将营养液利用减压旋转蒸发仪浓缩至2.0g.mL-1。
4、大葱根系分泌物的分离
采用萃取的方法对收集的大葱根系分泌物进行分离。具体过程为：取2.0g.mL-1的葱根系分泌物100mL，分别用乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷和正丁醇四种有机溶剂按体积比2：1的比例萃取3次后，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干，溶于5mL甲醇中，放入-20℃冰箱中保存，即得本发明所述的抑制根结线虫卵孵化的天然物质。以上所用药品均为色谱纯级别。
二、大葱根系分泌物对根结线虫卵孵化的抑制效果及成份分析
1、试验方法
取三氯甲烷、乙醚、正丁醇和乙酸乙酯四种分离组份的葱根系分泌物各3ml，待甲醇完全挥发后加入3ml无菌水待用，分别称为A、B、C、D。取3ml甲醇，待甲醇完全挥发后加入3ml无菌水待用，称为CK。分别向96孔平底细胞培养板中加入10μl、20μl、50μl、100μl、150μl、200μl及250μl A、B、C、D及CK。每个处理均加入20μl根结线虫卵提取液，定容至300μl，3次重复。将细胞培养板于设定温度22℃的生化培养箱中。每隔2-3天采用奥林巴斯X51-12PH型倒置生物显微镜观察根结线虫卵孵化情况。
2、试验结果
试验结果包括了正丁醇组份(C组份)处理根结线虫卵孵化率(详见附图2)以及加入大葱根系分泌物后第1天、第12天、和自然孵化第1天、第12天的孵化情况(详见附图3)。
经过试验观察，发现正丁醇组份葱根系分泌物对根结线虫卵孵化的抑制效果最佳，抑制率可达95％以上(见图2、图3)。
3、成份分析
利用岛津GCMS‐2010气相色谱质谱联用仪对正丁醇组份进行了成分分析，结果见图4。
分析结果显示，正丁醇组份中含量最高的物质为4-羟基苯乙醇，其含量可达50.35％，为抑制根结线虫卵孵化的主要物质。
三、大葱伴生栽培防治黄瓜根结线虫病的应用
1、试验方法
选取多年种植黄瓜、根结线虫病发生严重的温室进行大葱伴生栽培防治黄瓜根结线虫病效果的试验。
试验设置两个处理，分别为T：大葱伴生黄瓜栽培(在黄瓜定植时，在黄瓜两侧5cm位置各定植一颗10‐15cm大葱)和CK：黄瓜单独栽培。
2、试验结果
2.1温室土壤中根结线虫情况
为了了解试验温室土壤中根结线虫的情况，我们对其土壤中的根结线虫进行了测定，结果见表1。
表1土壤内根结线虫的数量
从表1中，我们能够看出，该温室大棚中25厘米内土层含有根结线虫的数量在每100g湿土5675条，属于被根结线虫高度侵染的土壤。
2.2不同处理结果
表2不同处理黄瓜根系内根结线虫含量
注：每个雌虫内按照200-300个卵计算的话，根内大约有352-528个成熟的雌虫。
在黄瓜结果盛期对两个处理黄瓜根系内根结线虫含量进行测定(表2)。由表2可见，大葱与黄瓜伴生可明显降低其根系内根结线虫卵和成虫的数量，仅为对照处理的23.30％，显著降低了根结线虫病的发生，防治效果显著(见图5)。

Claims (1)

1.一种抑制根结线虫卵孵化的天然物质的提取工艺，其特征在于，包括以下提取步骤：
步骤一：水培法葱根系分泌物的收集
将大葱根系彻底清洗并去掉所有杂质，之后用超纯水清洗干净，放入专用的水培法葱根系分泌物收集装置内，培养期为50-60天；培养结束后，称量大葱根系鲜重，将含有大葱根系分泌物的营养液进行收集，并将其减压浓缩至2.0-2.5g.ml-1；
步骤二：大葱根系分泌物的萃取分离
取经步骤一减压浓缩后的葱根系分泌物100ml，分别用乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷和正丁醇四种有机溶剂按体积比2：1的比例萃取3次后，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干粉状，溶于5mL甲醇中，放入-20℃冰箱中保存；试验确定，经正丁醇萃取的大葱根系分泌物抑制根结线虫卵孵化的效果最明显，经分析测定，正丁醇萃取的大葱根系分泌物的天然物质中的主要成分为4-羟基苯乙醇；
所述水培法葱根系分泌物收集装置主要由培养箱、连接于所述培养箱内并对其提供输氧充气的充气输氧器构成，其中所述的培养箱为矩形的箱体结构，由箱体和箱盖构成，所述箱体内部盛放有营养液，所述箱盖上预留定位通孔，所述定位通孔便于大葱穿过并对大葱上部起到固定作用，在所述培养箱的底部铺设有浸没于所述营养液内的陶粒，所述培养箱中的陶粒铺设量占所述营养液体积的30-40%；
所述陶粒的预处理过程包括：首先用自来水充分刷洗干净，完全去掉表面的杂质，然后用超纯水浸泡10-12小时，晾干待用；
所述营养液是由色谱纯级别药品和超纯水配制而成，具体配方为mmol/L：K2SO4 0.75，MgSO4 0.65，KCl 0.1，Ca(NO3)2 2.0，KH2PO4 0.25，EDTA-Fe 0.1，H3BO3 1×10-2，(NH4)6Mo7O24 5×10-6，MnSO4 1×10-2，CuSO4 1×10-4，ZnSO4 1×10-3 。
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