CN106074521A - Artalbic acid衍生物的组合物用于制备抗肝纤维化药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有机合成和药物化学领域。本发明公开并提供了一种由Artalbic acid的O‑(苯并咪唑基)乙基与O‑(二羟乙胺基)乙基衍生物按照质量比为25：75组成的组合物以及将上述化合物按照25：75的质量比进行混合从而制备本发明组合物的方法。药理学实验表明，本发明提供的这种组合物在20 ug/ml时能够显著抑制NIH/3T3增殖以及转化生长因子‑β1诱导的成纤维细胞增殖，具有抗肝纤维化的作用，因此本发明还提供了Artalbic acid的O‑(苯并咪唑基)乙基与O‑(二羟乙胺基)乙基衍生物按照质量比为25：75组成的组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途。

Description

Artalbic acid衍生物的组合物用于制备抗肝纤维化药物
技术领域
本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物、制备方法及其用途。
背景技术
肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，表现为细胞外基质(ECM)大量合成、分泌，而降解绝对或相对不足，使ECM在肝脏内弥漫沉积。其起始于肝细胞(HC)坏死，随之是炎症反应、纤维生成介质释放，肝星状细胞(FSC)激活，最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡。肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理过程，是影响预后的重要因素。
过去的20年间，肝纤维化的研究取得了长足进展，证实肝纤维化与一定程度的肝硬化都是可逆的。近年来陆续出现了一些抗肝纤维化治疗方法，包括化学药、生物制剂、中药与基因疗法等，但是理想的临床治疗手段仍然缺乏(刘平.加强抗肝纤维化作用机制的研究.中华肝病杂志，2005,8(13)：561)。目前防治肝纤维的关键是针对与肝星状细胞激活相关的环节，主要是：减轻肝损伤；抑制星状细胞激活，减少细胞外基质产生；调节细胞因子紊乱，促进活化肝星状细胞凋亡；抑制肝脏成纤维细胞的增殖以及星状细胞激活大量分泌诱导肝脏成纤维细胞的增殖。
从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到高效低毒的潜在药物最有重要价值。
本发明涉及的化合物I是一个2011年发表(Antonella Maggio et al.,2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisiaalba(Asteraceae)from Sicily.Tetrahedron Letters,52(2011)4543–4545)的化合物，我们对化合物I进行了结构修饰，获得了两个新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制备了组合物并对该组合物抗肝纤维化活性进行了评 价，其具有抗肝纤维化活性。
由于肝脏星状细胞的激活，从而引起了多种生长因子的大量分泌，这些生长因子会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖，从而加速纤维化，其中最重要的生长因子之一就是TGF。因此，筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制肝脏成纤维细胞增殖的药物或者筛选能够抑制TGF等生长因子诱导的成纤维细胞的增殖，筛选常常在成纤维细胞上进行，NIH/3T3细胞是最常用的细胞株。
发明内容
本发明公开了一个新的组合物，该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物中化合物III和化合物IV的质量百分数分别为25％和75％。
本发明公开的组合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
药效学实验表明，本发明的组合物具有较好的抗肝纤维化作用。本发明的药学上可接受的盐具有同样的药效。
进一步的，组合物的体外实验表明，组合物具有很强的抗成纤维细胞增殖的活性，因此本发明的组合物有望被用于制备新型抗肝纤维化药物。
进一步的，组合物的体外实验表明，组合物具有很强的抗生长因子诱导的成纤维细胞增殖的活性，组合物是一个极具开发潜力的化合物,它可直接用于相应疾病的治疗以及相关药物的制备。
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
具体实施方式
实施例1 化合物Artalbic acid的制备
化合物Artalbic acid(I)的制备方法参照Antonella Maggio等人发表的文献(Antonella Maggio et al.,2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusualskeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily.Tetrahedron Letters,52(2011)4543–4545)的方法。
实施例2 Artalbic acid的O-溴乙基衍生物(II)的合成
将化合物I(266mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化 铵(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氢氧化钠溶液。混合物在40摄氏度搅拌16h。16h之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液。然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤5次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脱带并挥去溶剂即得到化合物II的棕色粉末(272mg，73％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.41(s,1H),6.06(s,1H),5.76(s,1H),4.99(s,1H),4.71(s,1H),4.56(s,1H),3.86(s,2H),3.54(s,2H),2.65(s,1H),2.43(s,2H),2.33(s,2H),2.10(s,1H),1.64(s,3H),1.54(s,1H),1.44(s,2H),0.95(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ201.95(s),175.93(s),149.13(s),148.15(s),117.05(s),109.43(s),81.86(s),70.27(s),57.68(s),41.26(s),39.07(s),38.86(s),35.69(s),33.36(s),30.72(s),20.44(s),18.42(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C17H26BrO4:373.1014；found 373.1017.
实施例3 Artalbic acid的O-(苯并咪唑基)乙基衍生物(III)的合成
将化合物II(187mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾(345mg，2.5mmol)，碘化钾(84mg，0.5mmol)和苯并咪唑(1180mg，10mmol)，混合物加热回流2h。反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有机相。依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯 化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脱带，浓缩即得到化合物III的棕色固体(80.0mg,39％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ16.65(s,1H),8.22(s,1H),7.61(d,J＝25.0Hz,2H),7.25(s,1H),7.16(s,1H),6.05(s,1H),5.76(s,1H),4.90(s,1H),4.67(s,1H),4.58(s,1H),4.12(s,1H),4.00(s,1H),3.85(s,2H),2.63(s,1H),2.43(s,2H),2.35(s,2H),1.95(s,1H),1.61(s,3H),1.52(s,2H),1.37(s,1H),0.94(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ201.70(s),175.59(s),149.00(s),147.93(s),146.20(s),139.75(s),133.40(s),123.95(s),123.48(s),118.46(s),116.84(s),110.97(s),109.08(s),81.62(s),67.86(s),57.36(s),44.96(s),41.15(s),38.72(s),38.62(s),35.56(s),30.41(s),20.19(s),18.28(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C24H31N2O4:411.2284；found:411.2281。
实施例4 Artalbic acid的O-(二羟乙胺基)乙基衍生物的合成
将化合物II(187mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾(690mg，5.0mmol)，碘化钾(252mg，1.5mmol)和二乙醇胺(1051mg，10mmol)，混合物加热回流1h。反应结束后将反应液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有机相。依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集黄色集中洗脱带并挥去溶剂即得到化合物IV的淡黄色固体(146.9mg,74％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ18.72(s,1H),δ6.11(s,1H),5.80(s,1H),5.14(s,1H),4.73(s,1H),4.63(s,1H),3.57(s,2H),3.45(s,4H),2.70(d,J＝15.6Hz,3H), 2.60(s,4H),2.50(s,2H),2.46(s,2H),2.33(s,1H),1.88(s,2H),1.68(s,3H),1.62(d,J＝19.9Hz,3H),1.02(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ202.01(s),176.11(s),149.21(s),148.55(s),117.15(s),109.60(s),81.93(s),67.25(s),59.28(s),57.88(s),56.83(s),53.74(s),41.36(s),39.24(s),38.93(s),35.88(s),30.82(s),20.61(s),18.49(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C21H36N1O6:398.2543；found:398.2547。
实施例5 组合物抗肝纤维化活性
由于肝脏星状细胞的激活，从而引起了多种生长因子的大量分泌，这些生长因子会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖，从而加速纤维化，其中最重要的生长因子之一就是TGF。因此，筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制肝脏成纤维细胞增殖的药物或者筛选能够抑制TGF等生长因子诱导的成纤维细胞的增殖，筛选常常在成纤维细胞上进行，NIH/3T3细胞是最常用的细胞株。
组合物的制备：将研磨之后过200目网的25mg化合物III的粉末和研磨之后过200目网的75mg化合物IV的粉末装入带盖的小管中并用涡轮搅拌仪混合即得到100mg组合物，使用时用水溶解这100mg的组合物即得到组合物的溶液。
实验例1：组合物对成纤维细胞NIH/3T3增殖的抑制作用
一、实验方法：
NIH/3T3细胞株购自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上海细胞所细胞库。
将对数生长期的亚融合的NIH/3T3细胞用0.25％胰酶消化，洗涤，离心后，用DMEM培养液(含10％FCS)制成1×104cell/ml的细胞悬液，台盼蓝染色鉴 定存活率大于95％，按每孔100ul加入96孔板中，在37℃、5％CO2培养24h同步处理后，弃上清，加入含有药物的DMEM培养液(含10％FCS)200ul，培养48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。弃去培养液，加入150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶溶解，酶标仪490nm处读取OD值，结果以OD490表示。
二、实验结果：
1、形态学观察
NIH/3T3在用药前伸展良好，折光性较弱，有方向性，呈放射状，细胞增殖的速度快；而加组合物24h后，成纤维细胞数目减少，形状变得不规则，突起变短，细胞排列混乱，细胞内代谢产物增多。化合物III和化合物IV无此作用。
MTT法检测组合物对NIH/3T3细胞增殖的抑制作用。
表1：MTT法检测组合物对NIH/3T3增殖的抑制作用
注：*，与细胞阴性对照P<0.05
结果：组合物在20ug/ml对成纤维细胞NIH/3T3的细胞增殖有显著的抑制作用。表明组合物体外对成纤维细胞的增殖有显著抑制作用。化合物III和化合物IV无此作用。
实验例2：组合物对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的成纤维细胞增殖的抑制作用
TGF-β1是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子，在细胞中加入TGF-β 110ng/ml刺激细胞增殖，再检测药物对TGF-β1诱导的细胞增殖的抑制作用，以分析判断组合物的作用机理。
表2：MTT法检测组合物对TGF诱导NIH/3T3增殖的抑制作用
注：*，与细胞+TGF对照P<0.05
结果：组合物在20ug/ml对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β1的诱导下的细胞增殖有显著的抑制作用，化合物III和化合物IV无此作用。表明组合物体外对纤维细胞增殖的抑制作用可能是通过干预TGF信号通路实现的。
结论：组合物对成纤维细胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的细胞增殖有显著的抑制作用；组合物对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β1的诱导下的细胞增殖有显著的抑制作用。组合物可以用来制备抗肝纤维化药物。化合物III和化合物IV对成纤维细胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的细胞增殖无显著的抑制作用，对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β1的诱导下的细胞增殖无显著的抑制作用，不可以用来制备抗肝纤维化药物。
实施例6 本发明所涉及组合物片剂的制备
取2克组合物，加入制备片剂的常规辅料18克，混匀，常规压片机制成100片。
实施例7 本发明所涉及组合物胶囊的制备
取2克组合物，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉18克，混匀，装胶囊制成100粒。

Claims (6)

1.一种组合物，其特征为该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物中化合物III和化合物IV的质量百分数分别为25％和75％，
2.如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征为：将化合物III的粉末和化合物IV的粉末按照质量百分数分别为25％和75％充分混合。
3.一种如权利要求1所述的组合物在治疗肝纤维化药物中的应用。
4.如权利要求3所述的组合物在治疗肝纤维化药物中的应用，其特征为所述组合物抑制成纤维细胞增殖。
5.如权利要求3所述的组合物在治疗肝纤维化药物中的应用，其特征为所述组合物抑制生长因子诱导的成纤维细胞增殖。
6.如权利要求5所述的组合物在治疗肝纤维化药物中的应用，其特征为所述生长因子为TGF-β1。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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ANTONELLA MAGGIO等: "Artalbic acid，a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba (Asteraceae) from Sicily", 《TETRAHEDRON LETTERS》 *
刘文东，等: "青蒿琥酯对肝纤维化大鼠肝组织基质金属蛋白酶表达的影响", 《天津医科大学学报》 *

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