CN105950608B - 蛋白质在细菌及其衍生小泡表面展示的组合物和方法及其用途 - Google Patents

蛋白质在细菌及其衍生小泡表面展示的组合物和方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于在细胞表面和细胞小泡表面展示蛋白质和多肽的组合物和方法。本文还公开了利用本发明的细胞表面展示系统用于递送药物和疫苗的方法和组合物。

Description

蛋白质在细菌及其衍生小泡表面展示的组合物和方法及其 用途
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2008年5月21日；申请号：200880024976.5(PCT/US2008/064376)；发明名称：同上。
本申请要求2007年5月22日申请的美国临时专利申请顺序号60/939,506的权益。
本申请的主题在美国国立卫生研究院(United States Government under theNational Institutes of Health)资助号NIBIB R21EB005669的支持下进行。美国政府享有一定的权利。
发明领域
本发明涉及蛋白质和多肽在细胞表面和细胞小泡表面展示的组合物和方法。
发明背景
蛋白质易位是对所有生命都十分重要的高度保守的过程。毒力因子向细胞外分泌是侵入细菌用来建立定居生态位、与宿主细胞连通以及调节宿主防御和反应的一种策略。细菌蛋白质分泌系统以单一蛋白质或其它小蛋白质复合物的膜易位为特征，只有少数例外(Christie等，“Bacterial Type IV Secretion:Conjugation Systems Adapted toDeliver Effector Molecules to Host Cells(细菌IV型分泌：适于向宿主细胞递送效应分子的结合系统)”,Trends Microbiol 8:354-60(2000)；Galan等，“Type III SecretionMachines:Bacterial Devices for Protein Delivery into Host Cells(III型分泌机器：向宿主细胞递送蛋白质的细菌装置)”,Science 284:1322-8(1999)；Gentschev等，“TheE.coli alpha-Hemolysin Secretion System and its Use in Vaccine Development(大肠杆菌α-溶血素分泌系统及其在疫苗开发中的应用)”,Trends Microbiol 10:39-45(2002)；Henderson等，“Autotransporter Proteins,Evolution and Redefining ProteinSecretion(自体转运蛋白、进化和重新界定蛋白质分泌)”,Trends Microbiol 8:529-32(2000)；以及Russel M.，“Macromolecular Assembly and Secretion Across theBacterial Cell Envelope:Type II Protein Secretion Systems(跨细菌细胞外膜的大分子装配和分泌：II型蛋白质分泌系统)”,JMol Biol 279:485-99(1998))。然而最近的研究表明，外膜小泡(OMV)的产生和释放是将各种蛋白质和脂质传递给哺乳动物细胞的一种新的分泌机制(Kuehn M.J.等，“Bacterial Outer Membrane Vesicles and the Host-Pathogen Interaction (细菌外膜小泡与宿主-病原体相互作用)”,Genes Dev 19:2645-55(2005))。OMV是平均直径为50-200nm的小的脂蛋白体，在生长期间从革兰氏阴性菌致病菌种和非致病菌种外膜组成型释放出来(Beveridge T.J.，“Structures of Gram-Negative Cell Walls and their Derived Membrane Vesicles(革兰氏阴性细胞壁及其衍生的膜小泡的结构)”,J Bacteriol 181:4725-33(1999))。生化分析表明OMV由外膜蛋白、脂多糖、磷脂和可溶性周质蛋白组成(Horstman等，“Enterotoxigenic Escherichiacoli Secretes Active Heat-Labile Enterotoxin Via Outer Membrane Vesicles(肠产毒性大肠杆菌通过外膜小泡分泌有活性的热不稳定肠毒素)”,J Biol Chem 275:12489-96(2000)和McBroom等，“Outer Membrane Vesicles(外膜小泡)”,EcoSal-Escherichia coliand Salmonella:Cellular and Molecular Biology(III，R.C.版)。ASM Press，Washington，D.C.(2005))，可溶性周质蛋白在从细胞表面释放期间被截留在小泡腔内。OMV大多缺乏内膜和胞质组分，虽然若干研究表明染色体、噬菌体和质粒DNA可以浸润OMV以作为细菌间OMV介导的遗传信息转移的手段(Dorward等，“Export and IntercellularTransfer of DNA Via Membrane Blebs of Neisseria gonorrhoeae(DNA通过淋病奈瑟氏球菌膜小泡的输出与胞内转移)”,J Bacteriol 171:2499-505(1989)；Kolling等，“Exportof Virulence Genes and Shiga Toxin by Membrane Vesicles of Escherichia coliO157:H7(毒力基因和志贺菌毒素通过大肠杆菌O157:H7膜小泡的输出)”,Appl EnvironMicrobiol 65:1843-8(1999)；Yaron等，“Vesicle-Mediated Transfer of VirulenceGenes from Escherichia coli O157:H7 to Other Enteric Bacteria(小泡介导毒力基因自大肠杆菌O157:H7向其它肠细菌转移)”,Appl Environ Microbiol 66:4414-20(2000)；以及Renelli等，“DNA-Containing Membrane Vesicles of Pseudomonasaeruginosa PAO1 and their Genetic Transformation Potential(得自铜绿假单胞菌PAO1的含DNA的膜小泡及其遗传转化可能性)”,Microbiology 150:2161-9(2004))。
一个有关OMV的有趣但难以理解的现象是观察到小泡中富含某些膜蛋白和/或可溶性周质蛋白而却优先将其它蛋白排除在外。这些丰富蛋白质的大部分恰巧是毒力因子，包括例如大肠杆菌(Escherichia coli)溶细胞素A(ClyA)(Wai等，“Vesicle-MediatedExport and Assembly of Pore-Forming Oligomers of the Enterobacterial ClyACytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配)”,Cell 115:25-35(2003))、肠产毒性大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)(Horstman等，“EnterotoxigenicEscherichia coli Secretes Active Heat-Labile Enterotoxin Via Outer MembraneVesicles(肠产毒性大肠杆菌通过外膜小泡分泌有活性的热不稳定肠毒素)”J Biol Chem275:12489-96(2000))和伴放线菌素放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)白细胞毒素(Kato等，“Outer Membrane-Like Vesicles Secreted by Actinobacillusactinomycetemcomitans are Enriched in Leukotoxin(由伴放线菌素放线杆菌分泌的外膜样小泡富含白细胞毒素)”,Microb Pathog 32:1-13(2002))，而被排除OMV之外的蛋白质包括多种未鉴定的外膜(OM)蛋白(Kato等，“Outer Membrane-Like Vesicles Secreted byActinobacillus actinomycetemcomitans are Enriched in Leukotoxin(由伴放线菌素放线杆菌分泌的外膜样小泡富含白细胞毒素)”,Microb Pathog 32:1-13(2002))以及大肠杆菌DsbA(Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-FormingOligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配)”,Cell 115:25-35(2003))。优先排除蛋白质加大了这种令人感兴趣的可能性，即在细菌周质中存在尚待确定的将一亚组高度特异性的蛋白质有差别地加载到OMV中的分选机制(Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配)”,Cell 115:25-35(2003)和McBroom等，“Release ofOuter Membrane Vesicles by Gram-Negative Bacteria is a Novel Envelope StressResponse(由革兰氏阴性菌释放的外膜小泡是一种新的外膜应激反应)”,Mol Microbiol63:545-58(2007))。此外，小泡中富含某些毒力因子的观察结果表明，OMV可能通过介导把有活性的毒力因子和其它细菌外膜组分传递给宿主细胞而在细菌发病机制中起关键作用。实际上，研究表明多种与小泡相关的毒力因子(例如黏附素、免疫调节化合物、蛋白酶和毒素)诱导细胞毒性，使小泡结合和侵入宿主细胞，并调节宿主免疫应答(Horstman等，“Enterotoxigenic Escherichia coli Secretes Active Heat-Labile Enterotoxin ViaOuter Membrane Vesicles(肠产毒性大肠杆菌通过外膜小泡分泌有活性的热不稳定肠毒素),”J Biol Chem 275:12489-96(2000)；Fiocca等，“Release of Helicobacter pyloriVacuolating Cytotoxin by Both a Specific Secretion Pathway and Budding ofOuter Membrane Vesicles.Uptake of Released Toxin and Vesicles by GastricEpithelium(幽门螺杆菌通过特定分泌途径和芽生外膜小泡形成的细胞毒素小泡的释放。释出的毒素和小泡被胃上皮细胞吸收)”,J Pathol 188:220-6(1999)；Keenan等，“A Rolefor the Bacterial Outer Membrane in the Pathogenesis of Helicobacter pyloriInfection(细菌外膜在幽门螺杆菌感染的发病机制中的作用)”,FEMS Microbiol Lett182:259-64(2000)；Kadurugamuwa等，“Delivery of the Non-Membrane-PermeativeAntibiotic Gentamicin into Mammalian Cells by Using Shigella flexneriMembrane Vesicles(利用费氏志贺氏菌膜小泡将非膜通透性抗生素庆大霉素递送至哺乳动物细胞”),Antimicrob Agents Chemother 42:1476-83(1998)；以及Kesty等，“Enterotoxigenic Escherichia coli Vesicles Target Toxin Delivery intoMammalian Cells(Enterotoxigenic Escherichia coli Vesicles Target ToxinDelivery into Mammalian Cells(递送至哺乳动物细胞的肠产毒性大肠杆菌小泡靶毒素))”EMBO J 23:4538-49(2004))。
迄今为止，研究得最多的与小泡相关的毒力因子之一是存在于致病和非致病大肠杆菌菌株中的34-kDa细胞毒素ClyA(亦称HlyE或SheA)(Wai等，“Vesicle-Mediated Exportand Assembly of Pore-Forming Oligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配),”Cell 115:25-35(2003)和del Castillo等，“The Escherichia coli K-12 SheA Gene Encodes a 34-kDa SecretedHaemolysin(大肠杆菌K-12 SheA基因编码34-kDa分泌性溶血素)”,Mol Microbiol 25:107-15(1997))，还有肠沙门氏菌(Salmonella enterica)伤寒血清变型和甲型副伤寒血清变型(Oscarsson等，“Characterization of a Pore-Forming Cytotoxin Expressed bySalmonella enterica serovars typhi and paratyphi A(通过肠沙门氏菌伤寒血清变型和甲型副伤寒血清变型表达的成孔细胞毒素的特征)”,Infect Immun 70:5759-69(2002))。结构研究表明，ClyA的水溶性形式是4条主要α-螺旋的束状结构，结构的“头”端具有一个小的露出表面的疏水β-发夹，“尾”端具有N端和C端(Wallace等，“E.coli HemolysinE(HlyE,ClyA,SheA):X-ray Crystal Structure of the Toxin and Observation ofMembrane Pores by Electron Microscopy(大肠杆菌溶血素E(HlyE、ClyA、SheA)：毒素的X射线晶体结构和通过电子显微镜术观察到的膜孔)”Cell 100:265-76(2000))，而脂质相关性ClyA则形成由8个或13个ClyA亚基组成的寡聚孔复合体(Eifler等，“Cytotoxin ClyAfrom Escherichia coli Assembles to a 13-meric Pore Independent of its Redox-State(大肠杆菌的细胞毒素ClyA装配成不依赖于其氧化还原状态的13聚体的小孔)”EMBOJ 25:2652-61(2006)和Tzokov等，“Structure of the Hemolysin E(HlyE,ClyA,SheA)Channel in its Membrane-Bound Form(溶血素E(HlyE、ClyA、SheA)通道在其膜结合形式中的结构)”,J Biol Chem 281:23042-9(2006))。在非致病大肠杆菌K-12实验室菌株中，通过拟核蛋白H-NS使clyA基因的表达沉默(Westermark等，“Silencing and Activation ofClyA Cytotoxin Expression in Escherichia coli(大肠杆菌中ClyA细胞毒素表达的沉默与激活)”,J Bacteriol 182:6347-57(2000))，但是在H-NS缺陷型大肠杆菌中去阻抑，从而诱导对培养的哺乳动物细胞的细胞毒性(Gomez-Gomez等，“Hns Mutant Unveils thePresence of a Latent Haemolytic Activity in Escherichia coli K-12(Hns突变型揭示大肠杆菌K-12中潜在溶血性活性的存在)”,Mol Microbiol 19:909-10(1996))。最新证据表明ClyA以OMV从大肠杆菌中输出，并在小泡中保持有细胞溶解活性的寡聚体构象(Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of theEnterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配),”Cell 115:25-35(2003))。然而，ClyA设法跨过细菌IM并在OMV中装配的途径仍是未解之谜，因为它未携带常规的信号肽(del Castillo等，“The Escherichia coli K-12SheA Gene Encodes a 34-kDa Secreted Haemolysin(大肠杆菌K-12 SheA基因编码34-kDa分泌性溶血素)”,Mol Microbiol 25:107-15(1997))，并且不是在N端加工的(Ludwig等，“Analysis of the SlyA-Controlled Expression,Subcellular Localization andPore-Forming Activity of a 34 kDa Haemolysin(ClyA)from Escherichia coli K-12(大肠杆菌K-1234 kDa溶血素(ClyA)的SlyA控制性表达、亚细胞定位和成孔活性分析)”,Mol Microbiol 31:557-67(1999))。尚未确定的还有ClyA在小泡介导的与哺乳动物细胞相互作用中所起的作用。
本发明旨在克服本领域的这些缺点和其它缺点。
发明概述
本发明第一个方面涉及使蛋白质在细胞表面展示的方法。该方法包括提供融合蛋白或编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白含有至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白。在有效使融合蛋白在细胞表面展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞。
本发明还涉及展示ClyA融合蛋白的细胞，其中ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与ClyA蛋白偶联的第二蛋白。
本发明另一个方面涉及使蛋白质在细胞小泡上展示的方法。该方法包括提供融合蛋白或编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白含有至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白。在有效使融合蛋白在细胞小泡上展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞。
本发明还涉及展示ClyA融合蛋白的小泡，其中ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与ClyA蛋白偶联的第二蛋白。
本发明另一个方面涉及使细胞成像的方法，该方法包括提供融合蛋白或编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和与ClyA蛋白偶联的标记蛋白。该方法进一步包括在使融合蛋白在细胞上有效展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞，并根据存在的标记蛋白使细胞成像。
本发明另一个方面涉及分选细胞的方法，该方法包括提供融合蛋白或编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和与ClyA蛋白偶联的标记蛋白。该方法进一步包括在使融合蛋白在细胞上有效展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞，并根据存在的标记蛋白进行细胞分选。
本发明还涉及筛选候选化合物文库以鉴定与靶蛋白结合的化合物的方法。该方法包括提供待筛选的候选化合物文库和展示ClyA融合蛋白的细胞或细胞小泡。ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白，其中ClyA融合蛋白的第二蛋白包含靶蛋白。该方法进一步包括在有效使候选化合物与靶蛋白结合的条件下，使候选化合物文库与展示ClyA融合靶蛋白的细胞或细胞小泡接触，并鉴定出与靶蛋白结合的化合物。
本发明另一个方面涉及将治疗药物递送至细胞的方法，该方法包括提供展示ClyA融合蛋白的小泡，其中ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白。所述小泡含有待递送的治疗药物，所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含靶蛋白。在有效递送治疗药物至细胞的条件下将小泡给予细胞。
本发明还涉及在哺乳动物体内诱导免疫应答的方法。该方法包括提供展示ClyA融合蛋白的细胞或细胞小泡。ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白，其中ClyA融合蛋白的第二蛋白包含能够在哺乳动物体内诱导免疫应答的抗原性蛋白或肽。在有效诱导免疫应答的条件下将细胞或小泡给予哺乳动物。
本发明还涉及由展示ClyA融合蛋白的细胞小泡组成的递送药物和疫苗的载体。ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白。
本发明描述了无天然功能的合成膜小泡(synthetic membrane vesicle，s-MV)的工程改造，该合成的膜小泡可用于多种应用，包括例如对整个ClyA易位过程进行分析。准确地讲，通过在绿色荧光蛋白(GFP)或β-内酰胺酶(Bla)等异源蛋白与ClyA之间产生嵌合体，来设计功能性提高的s-MV。利用这些工程改造的小泡，现已确定，只有当周质二硫键形成机制存在时，ClyA才能够使各种结构上不同的融合配偶体共定位于大肠杆菌及其释放的小泡表面。重要的是，这些细胞相关蛋白质和OMV相关蛋白质保持其生物活性，这就表明通过表达ClyA嵌合体，可容易地使天然OMV的功能扩展。
一种使蛋白质在细胞表面展示的方法，所述方法包括：
提供融合蛋白或者编码所述融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白，和
在有效使融合蛋白在细胞表面展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是标记蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述标记蛋白是荧光蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是配体结合蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述配体结合蛋白选自高亲和力抗体结合片段、单链Fv抗体片段、纳米体、荧光体、适体、生物素结合蛋白、脂结合蛋白、周质结合蛋白、凝集素、血清白蛋白、酶、磷酸和硫酸结合蛋白、亲免蛋白、金属硫蛋白及各种其它受体蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是抗原性蛋白或肽。
本发明实施方案的方法，其中所述抗原性蛋白或肽源于：致病性细菌、真菌或病毒生物、链球菌(Streptococcus species)、念珠菌(Candida species)、布鲁氏菌(Brucellaspecies)、沙门氏菌(Salmonella species)、志贺氏菌(Shigella species)、假单胞菌(Pseudomonas species)、鲍特氏菌(Bordetella species)、梭菌(Clostridium species)、诺沃克病毒、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、人免疫缺陷病毒(HIV)、衣原体(Chlamydia species)、人乳头瘤病毒、流感病毒、副黏病毒毒株、疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、埃巴病毒、肝炎病毒、疟原虫(Plasmodium species)、毛滴虫(Trichomonas species)、性传播疾病病原体、病毒性脑炎病原体、原生动物病病原体、真菌性疾病病原体、细菌性疾病病原体、癌细胞及组合。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是治疗性蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是免疫调节蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述多种ClyA融合蛋白在多种宿主细胞表面上展示。
本发明实施方案的方法，其中所述多种ClyA融合蛋白的每一种都包含不同的第二多肽，其中所述多种ClyA融合蛋白构成多肽文库。
本发明实施方案的方法，其中所述ClyA蛋白是全长ClyA蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白与ClyA蛋白的C端融合。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白与ClyA蛋白的N端融合。
一种展示ClyA融合蛋白的细胞，其中所述ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白。
一种使蛋白质在细胞小泡上展示的方法，所述方法包括：
提供融合蛋白或者编码所述融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白，和
在有效使融合蛋白在细胞小泡上展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是标记蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述标记蛋白是荧光蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是配体结合蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述配体结合蛋白选自高亲和力抗体结合片段、单链Fv抗体片段、纳米体、荧光体、适体、生物素结合蛋白、脂结合蛋白、周质结合蛋白、凝集素、血清白蛋白、酶、磷酸和硫酸结合蛋白、亲免蛋白、金属硫蛋白及各种其它受体蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是抗原性蛋白或肽。
本发明实施方案的方法，其中所述抗原性蛋白或肽源自：致病性细菌、真菌或病毒生物、链球菌、念珠菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、鲍特氏菌、梭菌、诺沃克病毒、炭疽芽孢杆菌、结核杆菌、人免疫缺陷病毒(HIV)、衣原体、人乳头瘤病毒、流感病毒、副黏病毒毒株、疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、埃巴病毒、肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫、性传播疾病病原体、病毒性脑炎病原体、原生动物病病原体、真菌性疾病病原体、细菌性疾病病原体、癌细胞及组合。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是治疗性蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白是免疫调节蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述多种ClyA融合蛋白在多种细胞小泡表面上展示。
本发明实施方案的方法，其中所述多种ClyA融合蛋白的每一种都包含不同的第二多肽，其中所述多种ClyA融合蛋白构成多肽文库。
本发明实施方案的方法，其中所述ClyA蛋白是全长ClyA蛋白。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白与ClyA蛋白的C端融合。
本发明实施方案的方法，其中所述第二蛋白与ClyA蛋白的N端融合。
一种展示ClyA融合蛋白的小泡，其中所述融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白。
一种使细胞成像的方法，所述方法包括：
提供融合蛋白或者编码所述融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和与所述ClyA蛋白偶联的标记蛋白；
在有效使融合蛋白在细胞上展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞；和
根据存在的标记蛋白使细胞成像。
本发明实施方案的方法，其中所述标记蛋白是荧光蛋白。
一种分选细胞的方法，所述方法包括：
提供融合蛋白或者编码所述融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和与所述ClyA蛋白偶联的标记蛋白；
在有效使融合蛋白在细胞上展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞；和
根据存在的标记蛋白对细胞进行分选。
本发明实施方案的方法，其中所述标记蛋白是荧光蛋白。
一种筛选候选化合物文库以鉴定结合靶蛋白的化合物的方法，所述方法包括：
提供待筛选的候选化合物文库；
提供展示ClyA融合蛋白的细胞或细胞小泡，所述ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白，其中所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含靶蛋白；
在有效使候选化合物与靶蛋白结合的条件下，使候选化合物文库与展示靶蛋白的细胞或小泡接触；和
鉴定结合靶蛋白的化合物。
一种将治疗药物递送至细胞的方法，所述方法包括：
提供展示包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白的ClyA融合蛋白的小泡，其中所述小泡含有待递送的治疗药物，且其中所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含寻靶蛋白；和
在有效递送治疗药物至细胞的条件下，将小泡给予细胞。
本发明实施方案的方法，其中所述治疗药物是核酸、蛋白质或小分子。
本发明实施方案的方法，其中所述治疗药物是RNAi分子。
本发明实施方案的方法，其中所述寻靶蛋白包含配体结合蛋白或抗原性蛋白或肽。
一种在哺乳动物体内诱导免疫应答的方法，所述方法包括：
提供展示ClyA融合蛋白的细胞或细胞小泡，所述ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白，其中所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含能够在哺乳动物体内诱导免疫应答的抗原性蛋白或肽；和
在有效诱导免疫应答的条件下，将细胞或小泡给予哺乳动物。
本发明实施方案的方法，其中所述抗原性蛋白或肽源自：致病性细菌、真菌或病毒生物、链球菌、念珠菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、鲍特氏菌、梭菌、诺沃克病毒、炭疽芽孢杆菌、结核杆菌、人免疫缺陷病毒(HIV)、衣原体、人乳头瘤病毒、流感病毒、副黏病毒毒株、疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、埃巴病毒、肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫、性传播疾病病原体、病毒性脑炎病原体、原生动物病病原体、真菌性疾病病原体、细菌性疾病病原体、癌细胞及组合。
一种药物或疫苗递送载体，所述载体包含展示ClyA融合蛋白的小泡，所述ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白。
本发明实施方案的递送载体，其中所述小泡含有待递送的药物或疫苗，且其中所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含寻靶蛋白。
本发明实施方案的递送载体，其中所述寻靶蛋白是细胞特异性配体结合蛋白或抗原性蛋白或肽。
本发明实施方案的递送载体，其中所述小泡含有待递送的核酸、蛋白质或小分子。
本发明实施方案的递送载体，其中所述小泡含有RNAi分子。
本发明实施方案的递送载体，其中所述在小泡上展示的ClyA融合蛋白的第二蛋白是抗原性蛋白或肽。
本发明实施方案的递送载体，其中所述小泡表面展示的ClyA融合蛋白的第二蛋白是疫苗亚单位蛋白。
附图简述
图1A-F表示ClyA和ClyA融合蛋白的亚细胞定位。图1A是由表达ClyA-GFP的JC8031细胞获得的小泡的电子显微照片。比例尺等于100nm。图1B是1ml小泡悬液的Z均粒径柱状图，小泡悬液含有～30μg/ml由无质粒JC8031细胞或表达ClyA-GFP的JC8031细胞得到的总蛋白质。误差棒表示一式三份的标准差。图1C是由表达GFP、ClyA-GFP和GFP-ClyA的大肠杆菌菌株JC8031分离的小泡流分的蛋白质印迹。该印迹用抗GFP血清探测。图1D是显示蛋白质检测的蛋白质印迹，图1E是周质(per)流分、胞质(cyt)流分和小泡(OMV)流分中GFP荧光检测的柱状图，这些流分由表达ClyA-His6、ClyA-GFP和GFP-ClyA的JC8031细胞或BW25113nlpI::Kan细胞制备。ClyA-His6印迹先用抗多聚组氨酸探测。ClyA-GFP和GFP-ClyA印迹用抗GFP探测。剥离膜后，印迹如所示用抗OmpA血清或抗DsbA血清再次探测。所有流分由相等数目的细胞制备。图1F是由表达ClyA-His6、ClyA-GFP和GFP-ClyA的JC8031细胞制备的小泡的荧光显微图像。
图2A-C表示小泡的密度梯度分级分离。图2A是表达ClyA-GFP的JC8031细胞从上部(泳道1，最低密度)到底部(泳道10，最高密度)的密度梯度流分的电泳分析。分别用抗GFP、抗OmpA和抗DsbA血清得到与ClyA-GFP(上部)，OmpA(中部)和DsbA(底部)相对应的条带。泳道(i)表示得自经纯化的不含细胞的上清液的输入小泡。图2B表示各流分中定量测定的ClyA-GFP水平(实心方形)，应用ImageJ软件通过光密度测定法进行测定。使条带密度值归一化至相应的流分7中测量的ClyA-GFP的最大密度。同样，曲线是各流分中测量并归一化至最大活性的GFP活性(空心方形)，同样也与流分7对应。图2C是梯度流分7和10中迁移的小泡的荧光显微图像。
图3A-B显示ClyA表达的显微镜分析。诱导生长在37℃下LB中的JC8031细胞表达GFP(图3A)和ClyA-GFP(图3B)。对于免疫荧光显微镜术，细胞用小鼠单克隆抗GFP处理，随后用罗丹明缀合的抗小鼠IgG处理。图中显示如所示利用绿色和红色发射光滤光器进行的相差显微镜检术和荧光显微镜检术。对于免疫电镜术，细胞用小鼠单克隆抗GFP处理，随后用金缀合的抗小鼠IgG处理。箭头表示25nm金颗粒。比例尺等于500nm。
图4A-D表示通过免疫-表面等离振子共振(SPR)检测的小泡和小泡相关抗原。图4A是在20分钟s-MV结合和20分钟PBS漂洗之后对荧光s-MV(浓度为0.35μg/μl)在试验通道与抗大肠杆菌抗体的结合以及在参比通道与BSA处理表面的结合的荧光显微镜检术分析。测量值表示聚二甲基硅氧烷(PDMS)版(master)的尺寸。图4B是SPR传感图的叠影图(overlay)，显示了OMV浓度依赖性结合于固定化抗大肠杆菌抗体。对于各结合实验，将200μl含有OMV的样品(稀释到指示浓度)放入试验通道或参比通道20分钟，紧接20分钟PBS漂洗。按波长位移(nm)相对于时间来记录SPR信号，并绘制为“传感图”。所有结合实验在25℃±1℃下进行，流速为10μl/分钟。每个小泡样品按一式三份进行测定，求出的标准误差小于5％。图4C显示使用SPR免疫传感器绘制的小泡标准曲线。将在加入OMV之前的初步PBS洗涤步骤期间所采集的平均SPR信号减去在OMV结合之后PBS洗涤步骤期间的平均SPR信号，计算得出稳态SPR信号变化。等式y＝0.92ln(x)+3.63(R2值为0.95)给出通过数据对数拟合的直线，应用SigmaPlot得出。结果是从三次独立结合测量的SPR信号变化计算出的平均值，其中误差棒表示±标准误差。值得注意的是，测出该系统的检出下限为0.01μg/μl(标准曲线中10％的补偿SPR波长位移)，小泡浓度的检出下限为≥0.18μg/μl，记录的SPR波长位移>2.5nm，该值比基线信号大10倍左右。图4D表示在试验通道和参比通道中结合展示GFP的s-MV表面的抗体的代表性传感图。制备相同的通道以使得在两个通道中均俘获荧光s-MV。在向俘获s-MV的表面加入1μg/μl抗GFP(黑线)或1μg/μl抗his6x(灰线)单克隆抗体之后，测定SPR信号随时间的改变。抗体结合进行20分钟，接着10分钟PBS漂洗。每种抗体按一式三份进行测定，求出的标准误差小于5％。
图5A-D表示ClyA定位的生化分析和遗传分析。通过小泡(由用蛋白酶K和SDS如所示处理表达ClyA-GFP的JC8031细胞制备)的荧光显微镜检术(图5A)以及小泡(用表达ClyA-GFP或GFP-ClyA的JC8031细胞制备)的蛋白质印迹(图5B)测定蛋白酶K对连接OMV的GFP的敏感性。印迹用小鼠抗GFP(左图)或抗ClyA血清(右图)探测。左边表示分子量(MW)梯条。在所有情况下都使用等量的小泡。图5C是周质流分和OMV流分的蛋白质印迹分析，所述流分得自如所示表达ClyA-GFP或ClyA-His6的JC8031(dsbA+)和JC8031dsbA::Kan细胞(dsbA-)。图5D表示如所示表达pClyA-GFP或pClyA-His6的野生型JC8031(dsbA+，左上图和中图)和JC8031dsbA::Kan细胞(dsbA-，左下图和中图)的免疫荧光，以及如所示得自相同细胞的小泡的荧光(右图)。对于免疫荧光，细胞用小鼠单克隆抗GFP或抗多聚组氨酸抗体处理，随后用罗丹明缀合的抗小鼠IgG处理。
图6A-D显示ClyA-GFP小泡与HeLa细胞的相互作用。图6A是如所示与HeLa细胞在37℃下孵育30分钟或3小时的含有ClyA-GFP的OMV的荧光图像。固定细胞用0.5mg/mL溴化乙锭染色(EtBr，上图)，用荧光显微镜镜进行观测。图6B是显示OMV-HeLa细胞温度依赖性相互作用的荧光图像。通过使HeLa细胞与GFP-ClyA OMV在指示温度下孵育来观察这种相互作用。在所有情况下都使用等量的OMV(～150μg)。图6C是比较未处理(-GM1)或预处理(+GM1)OMV的荧光图像，OMV得自与HeLa细胞在37℃下孵育3小时表达ClyA-GFP的JC8031细胞。固定细胞用0.5mg/mL溴化乙锭染色(EtBr，上图)，用荧光显微镜进行观测。在所有情况下都使用等量的OMV(～150μg)。图6D表示小泡的细胞毒性，采用使用HeLa细胞培养物的MTS实验测定。用小泡处理的HeLa细胞的存活率归一化至用PBS处理后的存活率来报告百分比存活率。HeLa细胞用小泡溶液处理，所述小泡溶液得自无质粒JC8031细胞和表达ClyA-His6、ClyA-GFP的JC8031细胞。在所有情况下都使用等量的OMV(～150μg)。每个样品按一式三份进行测定，其中误差棒表示±标准误差。
图7A-B表示通过ClyA-scFv嵌合体制备的免疫MV。图7A是如所示由表达scFv.Dig、ClyA-scFv.Dig或Lpp-OmpA-scFv.Dig的JC8031细胞制备的完整细胞和小泡的荧光显微图像。对于这些研究，细胞在室温下生长并经诱导后，将细胞或其衍生小泡用1μM Dig-BODIPY在室温下进行荧光标记1小时。图7B显示scFv.Dig定位的遗传分析，如所示采用菌株和质粒的流式细胞分析进行。细胞在室温下生长并经诱导后，在室温下用1μM Dig-BODIPY标记1小时。用各细胞群的平均荧光来报告荧光，按一式三份进行测定，其中误差棒表示±标准误差。
图8A-C显示GFP与ClyA的C端融合导致具有荧光和溶血活性的61kDa嵌合蛋白进行表达。图8A是纯化的加his6尾标的重组蛋白与抗多聚组氨酸IgG的蛋白质印迹。ClyA、GFP和ClyA-GFP融合的预期分子量分别为27kDa、34kDa和61kDa。图8B提供ClyA、ClyA-GFP和GFP的相对溶血活性。ClyA的固有溶血活性保留在ClyA-GFP融合蛋白中，并随浓度递增而增加。图8C表示GFP和重组ClyA-GFP的荧光强度，单位为相对荧光单位(RFU，任意单位)。ClyA-GFP和GFP的荧光强度随浓度递增而线性增加。
图9A-E表示得自表达ClyA-GFP的大肠杆菌小泡高产菌株JC8031的重组外膜小泡的特征。图9A是用乙酸双氧铀染色的空OMV的电子显微照片。比例尺表示200nm。该图也是代表性的含有ClyA-GFP的重组OMV。图9B是与重组OMV缔合的ClyA-GFP的荧光显微照片。图9C是与得自表达空质粒载体或ClyA-GFP的大肠杆菌培养物的不含细胞的培养物上清液及OMV悬液的抗GFP抗体的蛋白质印迹。图9D表示PBS中的空OMV和重组OMV悬液的Z均流体力学直径，通过动态光散射测定。图9E表示用蛋白质总含量归一化的空OMV和重组OMV悬液中的脂多糖含量。星号(*)表示统计显著性(p<0.05)，用斯氏t检验求出。
图10A-D表明当与ClyA融合时，GFP的免疫原性显著提高。在按1:12,800稀释的血清中各宿主的抗GFP IgG产生应答。5只一组的各组BALB/c小鼠用以下组分进行皮下免疫：2.5μg GFP(I组/图10A)、2.5μg ClyA(II组/图10B)、5μg ClyA-GFP融合(III组/图10)和2.5μg ClyA与2.5μg GFP混合(IV组/图10D)。在第0天和第28天对小鼠进行免疫，每张图中用箭头标出。剑号表示III组的抗体效价与II组和IV组的效价相比较的统计显著性(p<0.05)。
图11A-B表明在重组OMV中所给予的ClyA-GFP保持其在小鼠中的免疫原性。测定了按1:12,800稀释的血清中各个宿主抗GFP IgG的效价。5只一组的各组BALB/c小鼠用与空OMV混合的纯化的ClyA-GFP融合(V组/图11A)和与重组OMV缔合的ClyA-GFP融合(VI组/图11B)免疫。两个治疗组中ClyA-GFP的有效剂量为2.5μg。在第0天和第28天给小鼠进行免疫，每张图中用箭头标出。星号(*)表示在相应日期与纯化的ClyA-GFP治疗组(III组/图10C)的抗体效价相比较的统计显著性差异(p<0.05)。
发明详述
本发明第一个方面涉及使蛋白质在细胞表面展示的方法。该方法包括提供融合蛋白或编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白含有至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白。在有效使融合蛋白在细胞表面展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞。
本发明还涉及展示ClyA融合蛋白的细胞，其中ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与ClyA蛋白偶联的第二蛋白。
本发明另一个方面涉及使蛋白质在细胞小泡上展示的方法。该方法包括提供融合蛋白或编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白含有至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白。在有效使融合蛋白在细胞小泡上展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞。
本发明还涉及展示ClyA融合蛋白的小泡，其中ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分与ClyA蛋白偶联的第二蛋白。
用于本发明方法和组合物中的ClyA融合蛋白可包含得自大肠杆菌(Genbank检索号AJ001829)的全长ClyA蛋白或其多肽片段、类似物或衍生物。大肠杆菌ClyA蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO：1所示：
大肠杆菌ClyA蛋白由SEQ ID NO：2的核酸序列编码：
在本发明另一个本发明实施方案中，融合蛋白包含得自肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)伤寒血清变型(Genbank检索号AJ313034)的全长ClyA蛋白或其多肽片段、类似物或衍生物。伤寒肠沙门氏菌ClyA蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO：3中所示：
伤寒肠沙门氏菌ClyA蛋白由SEQ ID NO：4的核酸序列编码：
在本发明进一步的本发明实施方案中，融合蛋白包含得自副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)(Genbank检索号AJ313033)的全长ClyA蛋白或其多肽片段、类似物或衍生物。副伤寒沙门氏菌ClyA蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO：5所示：
副伤寒沙门氏菌ClyA蛋白由SEQ ID NO：6的核酸序列编码：
在本发明另一个本发明实施方案中，融合蛋白包含费氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)(Genbank检索号AF200955)的全长ClyA蛋白或其多肽片段、类似物或衍生物。费氏志贺氏菌ClyA蛋白的氨基酸序列由下面的SEQ ID NO：7表示：
费氏志贺氏菌ClyA蛋白由SEQ ID NO：8的核酸序列编码：
在另一个本发明实施方案中，本发明的融合蛋白包含由ClyA共有序列得到的全长ClyA蛋白或其多肽片段、类似物或衍生物。ClyA氨基酸共有序列由对SEQ ID NO：1、3、5与7进行的比对得到，由下面的SEQ ID NO：9表示：
SEQ ID NO：9的ClyA共有序列由下面SEQ ID NO：10中所示的核酸序列编码：
得自SEQ ID NO：1、3和5比对的替代性ClyA氨基酸共有序列如下面的SEQ ID NO：11所示：
SEQ ID NO：11的ClyA共有序列由下面SEQ ID NO：12中所示的核酸序列编码：
在如上所提供的ClyA氨基酸共有序列中，Xaa残基可为任何氨基酸，但优选为中性氨基酸或疏水氨基酸。在ClyA核酸共有序列中，n残基可以是任何核酸。
如上所述，本发明的ClyA融合蛋白可包含全长ClyA蛋白、类似物或其衍生物。在另一个本发明实施方案中，本发明的融合蛋白包含ClyA蛋白的肽或多肽片段。ClyA蛋白优选的多肽片段是保持正常细胞转运和外膜小泡(OMV)装配能力的多肽片段。ClyA的蛋白质或多肽片段可包含SEQ ID NO：1、3、5或7或者SEQ ID NO：9和11共有序列中提供的野生型氨基酸序列中的任一种。或者，ClyA蛋白或多肽片段可含有一个或多个氨基酸取代或缺失。在一个优选的本发明实施方案中，ClyA蛋白或多肽是含有氨基酸取代或缺失的变体，该变体丧失溶血活性却同时保持了其粘附/侵袭活性。这类氨基酸取代是本领域熟知的，包括例如Wallace等人报道的三重突变V185S-A187S-I193S(“E.coli Hemolysin E(HlyE,ClyA,SheA):X-ray Crystal Structure of the Toxin and Observation of Membrane Poresby Electron Microscopy(大肠杆菌溶血素E(HlyE、ClyA、SheA)：毒素的X射线晶体结构和通过电子显微镜术观察到的膜孔)”,Cell 100:265-76(2000)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，或者del Castillo等人报道的跨膜结构域内氨基酸183-202的缺失(“Secretion of the Escherichia coli K-12 SheA Hemolysin is Independent ofitsCytolytic Activity(大肠杆菌K-12 SheA溶血素的分泌与其细胞溶解活性无关)”,FEMSMicrobiol.Lett.204:281-285(2001)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。
用于本发明方法和组合物的ClyA融合蛋白另包含至少一部分第二蛋白(即融合配偶体)。在一个本发明实施方案中，第二蛋白是标记蛋白。标记蛋白是本领域众所周知的，包括亲和蛋白标记(affinity protein marker)，例如壳多糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶和聚His标签；表位标记，例如V5标签、c-myc标签或HA标签；以及荧光蛋白标记，例如绿色荧光蛋白及其变体(例如蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白)。许多其它的荧光蛋白标记是本领域众所周知的，并且是市售的，包括但不限于单体KusabiraOrange(mKO)蛋白、Midori-Ishi青色荧光蛋白、mCherry红色荧光蛋白和单体深青色(teal)荧光蛋白。
在另一个本发明实施方案中，ClyA融合蛋白的第二蛋白包含配体结合蛋白。合适的配体结合蛋白包括高亲和力抗体片段(例如Fab、Fab'和F(ab')2)、单链Fv抗体片段、纳米体(nanobodies)或纳米体片段、荧光体(fluorobodies)或适体。其它配体结合蛋白包括生物素结合蛋白、脂结合蛋白、周质结合蛋白、凝集素、血清白蛋白、酶、磷酸和硫酸结合蛋白、亲免蛋白、金属硫蛋白或各种其它受体蛋白。
本发明的ClyA融合蛋白另还包含至少一部分抗原性蛋白或肽。合适的抗原性蛋白或肽是由例如以下致病性细菌、真菌或病毒生物得到的抗原性蛋白或肽：例如链球菌(Streptococcus species)、念珠菌(Candida species)、布鲁氏菌(Brucella species)、沙门氏菌(Salmonella species)、志贺氏菌(Shigella species)、假单胞菌(Pseudomonasspecies)、鲍特氏菌(Bordetella species)、梭菌(Clostridium species)、诺沃克病毒(Norwalk virus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、人免疫缺陷病毒(HIV)、衣原体属(Chlamydia species)、人乳头瘤病毒、流感病毒、副黏病毒毒株、疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、埃巴病毒、肝炎病毒、疟原虫(Plasmodium species)、毛滴虫(Trichomonas species)。其它合适的抗原性蛋白或肽包括性传播疾病病原体、病毒性脑炎病原体、原生动物病病原体、真菌性疾病病原体、细菌性疾病病原体或癌细胞抗原(例如前列腺特异抗原、TAG-72和CEA、MAGE-1和酪氨酸酶)、移植抗原(例如CD3受体)或自身免疫抗原(例如IAS链)及其组合。
ClyA融合蛋白的第二蛋白还可包含治疗性蛋白。在本发明的情况下，治疗性蛋白是用于治疗患有适用于蛋白质疗法治疗的受治疗者的任何重组蛋白。这类疾病包括但绝不限于癌症、心脏病发作、中风、囊性纤维变性、戈谢病(Gaucher’s disease)、糖尿病、贫血症和血友病。
治疗性蛋白可以是免疫调节分子。合适的免疫调节分子包括但不限于生长因子，例如M-CSF、GM-CSF；以及细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12或IFN-γ。
可按照本文所述方法，或者采用本领域已知的任何其它标准技术来制备用于本发明方法的ClyA融合蛋白。例如，融合多肽可使符合读框融合的多核苷酸序列即杂合基因进行翻译来制备。将编码融合多肽的杂合基因插入用于转化或转染宿主细胞的表达载体。或者，将编码ClyA多肽或蛋白质的多核苷酸序列插入已经存在第二多肽的编码多核苷酸的表达载体。融合蛋白的第二多肽或蛋白质与ClyA多肽或蛋白质的N端融合，或者优选与C端融合。
ClyA蛋白或多肽与第二蛋白或多肽之间可如此融合，使得ClyA蛋白或多肽的氨基酸序列与第二蛋白的氨基酸序列直接邻接。或者，ClyA部分可通过接头序列的方式与第二蛋白或多肽偶联，例如本文所述的柔性5-残基Gly接头或Huang等人的美国专利第5,516,637号中公开的得自免疫球蛋白的柔性接头，该文献通过引用以其整体结合到本文中。接头还可含有蛋白酶特异性切割位点，使得第二蛋白可受控制地由ClyA上释放。蛋白酶位点的实例包括对切割因子Xa、肠激酶、胶原酶、Igase(得自淋病奈瑟氏球菌)、凝血酶和TEV(烟草蚀斑病毒)蛋白酶具有特异性的位点。
一旦构建成融合蛋白，将编码蛋白质的核酸构建体插入异源于该分子的表达系统。按相对于启动子和任何其它5’调节分子的有义(5’→3’)方向及正确的读框，将异源核酸分子插入表达系统或载体。核酸构建体的制备可以采用本领域众所周知的标准克隆方法来进行，参见Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringsLaboratory Press，Cold Springs Harbor，New York(1989)，该文献通过引用以其整体结合到本文中。Cohen和Boyer的美国专利第4,237,224号，也披露了采用限制性内切酶切割并用DNA连接酶连接的重组质粒形式的表达系统，该专利通过引用以其整体结合到本文中。
合适的表达载体包括含有衍生自与宿主细胞相容物种的复制子和调控序列的载体。例如，如果大肠杆菌用作宿主细胞，则可使用pUC19、pUC18或pBR322等质粒。
不同的遗传信号和加工事件控制多层次的基因表达(例如DNA转录和信使RNA(“mRNA”)翻译)及随后在细胞或小泡表面展示的融合蛋白的量。DNA的转录有赖于启动子的存在，它是指导RNA聚合酶结合的DNA序列，从而促进mRNA的合成。启动子的“强度”(即促进转录的能力)各有不同。为了表达克隆的基因，最好使用强启动子以获得高水平的转录，以及由此达到高水平的表达和表面展示。根据所采用的宿主系统，可以使用多种合适启动子中的任一种。例如，当使用大肠杆菌、其噬菌体或质粒时，可以使用例如以下的启动子来指导邻接DNA区段进行高水平转录：T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体λ的PR和PL启动子以及其它启动子，包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等。或者，可使用由重组DNA或其它合成DNA技术制备的杂合trp-lacUV5(tac)启动子或其它大肠杆菌启动子以供插入基因转录。
原核生物中mRNA的翻译有赖于合适的不同于真核生物信号的原核信号的存在。原核生物中，mRNA的有效翻译需要mRNA上称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合部位。这个序列是短mRNA核苷酸序列，位于起始密码子(通常为AUG)之前，起始密码子编码蛋白质的氨基端甲硫氨酸。SD序列与16S rRNA(核糖体RNA)的3’端互补，并可能通过与rRNA形成双链体以供核糖体正确定位，来促进mRNA与核糖体结合。有关使基因表达最大化的综述，参见Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68:473(1979)，该文献通过引用以其整体结合到本文中。
适于ClyA融合蛋白在细胞表面或细胞小泡表面表达和展示的宿主细胞包括大量普遍可获得的革兰氏阴性菌的任一种。合适的微生物包括铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、胃肠炎沙门氏菌(Salmonellagastroenteritis)(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimirium))、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、肠炎沙门氏菌(S.enteriditiss)、费氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内氏志贺氏菌(S.sonnie)、痢疾志贺氏菌(S dysenteriae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitide)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、大叶性肺炎嗜血菌(H.pleuropneumoniae)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)、多杀巴斯德氏菌(P.multilocida)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、齿垢密螺旋体(T.denticola)、T.orales、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、疏螺旋体(Borrelia spp.)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、摩氏变形菌(P.morganii)、奇异变形菌(P.mirabilis)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazeki)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)、立氏立克次氏体(R.richettsii)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)(牙龈拟杆菌(Bacteriodes gingivalis))、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、沙眼衣原体(C.trachomatis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、C.intermedis、胎儿弯曲杆菌(C.fetus)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularenisis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、百日咳鲍特氏菌(Bordetella pertussis)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderie pseudomallei)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪布鲁氏菌(B.susi)、马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)、狗布鲁氏菌(B.canis)、小螺菌(Spirillumminus)、鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)和鼠疫菌耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。用表达载体转化/转染宿主细胞的方法为本领域所熟知，该方法取决于所选择的宿主系统，参见Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Laboratory Press，ColdSprings Harbor，New York(1989)，该文献通过引用以其整体结合到本文中。
在用包含编码ClyA融合蛋白的核酸构建体的表达载体转化宿主细胞之后，使CylA融合蛋白在细胞表面以及外膜小泡表面表达和展示。
在本发明的一个本发明实施方案中，多种蛋白质或多肽在多种细胞或细胞小泡表面展示。在细胞或细胞小泡表面展示的多种蛋白质或多肽是ClyA融合蛋白，其中各ClyA融合蛋白具有不同的第二蛋白。多种ClyA融合蛋白构成适于在细胞或细胞小泡表面展示的蛋白质文库或肽文库。
按照本发明方法产生的多肽或蛋白质文库在细胞和小泡表面的展示，可用来促进对高亲和力抗体、抗体靶标或其它特异性配体结合蛋白或小分子进行鉴定。除了促进对蛋白质-配体结合相互作用进行鉴定以外，还可使用多肽在细胞表面和细胞小泡表面的展示对其它所需要的蛋白质性质进行测定，包括催化活性、抑制活性和改进的结构构象。
在本发明的一个优选本发明实施方案中，在细胞或小泡表面展示的多肽文库包括抗体、抗体片段或荧光体文库。如本文所述，ClyA与抗体编码核酸的融合促进抗体在宿主细胞或细胞小泡表面表达。可以从用选定抗原免疫的动物中获得抗体或抗体片段的编码核酸；或者，可以使用其它来源的抗体基因，例如由杂交瘤产生的抗体基因或通过已知抗体基因诱变所产生的抗体基因。获得核酸区段的一种优选方法是从免疫动物的抗体细胞中分离出mRNA。可以使mRNA通过例如PCR扩增，并用来制备用作ClyA融合配偶体的DNA区段。还可以使用自一种或多种从选定抗体或抗体片段的编码DNA诱变的DNA区段。
一旦制备出抗体表达文库，便用可检测标记对预期用来识别并分离一种或多种特异性抗体的选定抗原进行标记。存在多种可检测标记的类型，包括荧光标记(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、AlexaFluor 488、藻红蛋白(PE)、PE-德克萨斯红、PE-Cy5、PerCP、PerCP-Cy5.5和PE-Cy7)。在允许特异性抗原抗体结合的条件下，使标记的抗原与展示抗体表达文库的细胞接触。可以改变条件以便只发生非常紧密结合的相互作用；例如采用浓度非常低的标记抗原。
可按照基于检测已结合的可检测标记存在的方法，来鉴定抗体或抗体片段表达细胞。用于鉴定和分离的特别优选的方法是细胞分选或流式细胞术，例如荧光激活细胞分选术(FACS)。
本发明还涉及筛选候选化合物文库以鉴定与靶蛋白结合的化合物的方法。该方法包括提供待筛选的候选化合物文库和展示ClyA融合蛋白的细胞或细胞小泡。ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白，其中ClyA融合蛋白的第二蛋白包含靶蛋白。该方法还包括在有效使候选化合物与靶蛋白结合的条件下，使候选化合物文库与展示ClyA融合靶蛋白的细胞或细胞小泡接触，并鉴定出与靶蛋白结合的化合物。
本发明另一个方面涉及使细胞成像的方法。该方法包括提供融合蛋白或编码所述融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白含有至少一部分ClyA蛋白和与所述ClyA蛋白偶联的标记蛋白。该方法另包括在使融合蛋白在细胞上有效展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞，并根据存在的标记蛋白使细胞成像。
上述标记蛋白中的任一种可用作ClyA融合配偶体以利于细胞成像方法。在一个优选的本发明实施方案中，标记蛋白是荧光标记蛋白。如上所述，有许多本领域众所周知和市售的荧光蛋白标记，包括例如可促进本发明这一方面的细胞成像的绿色荧光蛋白(GFP)及其所有变体(例如BlueFP、YellowFP、CyanFP)。
可采用本领域已知的任何基于荧光的显微镜方法获得细胞成像，包括但不限于表面荧光显微镜术、双光子激发显微镜术(two-photon excitation microscopy)或共焦显微术。
本发明另一个方面涉及分选细胞的方法。该方法包括提供融合蛋白或编码所述融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白含有至少一部分ClyA蛋白和与所述ClyA蛋白偶联的标记蛋白。该方法进一步包括在使融合蛋白在细胞上有效展示的条件下，将融合蛋白或核酸构建体给予细胞，并根据存在的标记蛋白进行细胞分选。
任何的上述标记蛋白都可用作ClyA融合配偶体以利于细胞分选方法。例如，融合蛋白的第二蛋白可包含具有多聚组氨酸标签(His标签)的标记蛋白。因此，使用亲和纯化介质(例如NTA-琼脂糖、HisPur树脂或Talon树脂)，可容易地分选出展示融合蛋白的细胞和His标签。与his标签一样，包括V5标签、c-myc标签或HA标签在内的其它蛋白质标记“标签”也可适用于细胞分选目的。
根据本发明这个方面，标记蛋白可以是任何配体或配体结合蛋白，可根据其选择性结合其各自的结合配偶体来进行分选。采用 的磁激活细胞分选术(Magnetic activated cell sorting，MACS)是一种基于此方法的细胞分选示例性方法。是小磁珠，包被了任何所需要的对靶标记蛋白具有亲和力的配体(例如抗体、蛋白质或抗原)。一旦靶蛋白与结合，该磁珠便与磁性柱结合，这使得靶蛋白(和细胞)从混合样品或溶液中分离出来。然后，从磁柱上将磁珠结合细胞洗脱出来。
在一个优选的本发明实施方案中，标记蛋白是荧光标记蛋白，细胞用FACS分选。如上所述的任何荧光蛋白标记都适于促进本发明这个方面的细胞分选。一般选择具有以下性质的荧光蛋白：具有与照射光波长相匹配的激发波长(范围通常约为485nm至约491nm)及可通过合适检测器装置检测的发射光谱。举例来说，许多荧光蛋白的最大发射范围约为510nm至约750nm。
用于细胞分选的光学检测系统具有一个或多个能够激发荧光标记蛋白的光源，优选呈一种或多种放大光束或准直光束的形式；以及一个或多个能够检测由标记蛋白产生的荧光发射的检测器。合适的光学检测系统包括而不限于单激光流式细胞仪(single-laserflow cytometers)、双激光流式细胞仪或多激光流式细胞仪以及装备有合适照射装置(例如二极管、激光等)的血液分析仪。
本发明另一个方面涉及将治疗药物递送至细胞的方法，该方法包括提供展示ClyA融合蛋白的小泡，其中ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白。小泡含有待递送的治疗药物，ClyA融合蛋白的第二蛋白包含寻靶蛋白。在有效递送治疗药物至细胞的条件下将小泡给予细胞。
通过培养能够在治疗药物存在下产生膜小泡的微生物，可将治疗药物包封在膜小泡内。膜小泡通常获自革兰氏阴性菌。用于产生膜小泡的合适微生物包括但不限于铜绿假单胞菌、大肠杆菌、胃肠炎沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌)、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、费氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血菌大叶性肺炎嗜血菌、溶血巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、嗜肺军团菌、苍白密螺旋体、齿垢密螺旋体、T.orales、布氏疏螺旋体、疏螺旋体、问号钩端螺旋体、肺炎克雷伯氏菌、普通变形菌、摩氏变形菌、奇异变形菌、普氏立克次氏体、斑疹伤寒立克次氏体、立氏立克次氏体、牙龈卟啉单胞菌(牙龈拟杆菌)、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、空肠弯曲杆菌、C.intermedis、胎儿弯曲杆菌、幽门螺杆菌、土拉热弗朗西丝菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、百日咳鲍特氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、小螺菌、鼻疽假单胞菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌和鼠疫菌耶尔森氏菌。可用优选在周质间隙表达治疗药物的基因转化微生物，以通过此微生物产生治疗药物。
可将多种治疗药物的任一种包封在细胞小泡内，治疗药物包括抗微生物剂、代谢调节剂、免疫调谐剂、抗增殖药、化疗药物等。治疗药物可以是核酸分子、蛋白质或小分子。
在细胞小泡表面展示的ClyA融合蛋白可将治疗药物靶向最需要ClyA融合蛋白的组织。ClyA融合蛋白的第二蛋白包含靶蛋白。合适的靶蛋白包括上述任何配体结合蛋白，尤其是导向细胞特异性表面受体和蛋白质的抗体或抗体片段。或者，靶蛋白可以是任何与细胞特异性表面受体结合的配体。含有治疗药物的小泡仅靶向有风险的组织可降低其它组织暴露在治疗药物的潜在毒副作用中。治疗药物从小泡中缓慢释放还可延长治疗药物在其最需要部位的停留时间。
本发明还涉及在哺乳动物体内诱导免疫应答的方法。该方法包括提供展示ClyA融合蛋白的细胞或细胞小泡。ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白，其中ClyA融合蛋白的第二蛋白包含能够在哺乳动物体内诱导免疫应答的抗原性蛋白或肽。在有效诱导免疫应答的条件下将细胞或小泡给予哺乳动物。
可根据本发明这个方面使用能够在哺乳动物体内诱导免疫应答的任何抗原性蛋白或肽。多种由感染性或致病性细菌、真菌或病毒生物得到的示例性抗原以及肿瘤细胞特异性抗原、自身免疫抗原或移植抗原如上所述。
本发明还涉及由展示ClyA融合蛋白的细胞小泡组成的递送药物和疫苗的载体。ClyA融合蛋白包含至少一部分ClyA蛋白和至少一部分第二蛋白。
本发明的递药装置包含由上述细胞小泡包封的待递送的药物或治疗药物。待递送的合适药物或治疗药物包括核酸分子，例如RNAi、治疗性蛋白或小分子。将药物或治疗药物递送至其靶细胞是通过在细胞小泡表面上展示ClyA融合蛋白来促进的，其中ClyA融合蛋白的第二蛋白包含上述细胞特异性寻靶蛋白。
本发明的疫苗递送载体可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)的，但通常是预防性的。在本发明这个本发明实施方案中，ClyA融合蛋白含有第二免疫原性蛋白或抗原。合适的抗原性蛋白和肽如上所述。在一个优选的本发明实施方案中，ClyA融合蛋白的第二蛋白是疫苗亚单位蛋白质。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原以及所需要的任何其它组分。免疫有效量是以单剂量或作为系列剂量的组成部分给予个体的量，也即用于有效治疗或预防的量。用量可以改变，这取决于待治疗个体的健康状况和身体条件、待治疗个体(例如非人类灵长类、灵长类等)的年龄、分类群、个体免疫系统合成抗体的能力、所需要的保护程度、疫苗的制备、主治医生对医疗情况的评价和其它相关因素。预期用量将落入可通过常规临床试验确定的相对较大的范围内。
适于作为药物和疫苗递送载体给药的细胞小泡的制备方法以及用于给予细胞小泡的剂型的方法为本领域所知，有关方法参见本文和Kadurugamuwa和Beveridge的WO2002/0028215、Oster等人的WO2006/024946以及Foster等人的WO2003/051379，所述文献通过引用以其整体结合到本文中。
本发明的药物或疫苗递送载体可配制成用于给予患者的药学上可接受的组合物。将有效量的活性小泡与上述药学上可接受的载体混合，参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，USA 1985，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。在此基础上，药物组合物包括(但并非只包括)膜小泡以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂的溶液，并包含在适当pH和与生理体液等渗的缓冲溶液中。
本发明的小泡递送载体可以经口服、胃肠外(皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)给予、经鼻内滴注或用于鼻黏膜、咽喉黏膜和支气管黏膜等黏膜。它们可单独给予或与合适的药用载体一起给予，并且可以呈固体或液体形式，例如片剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。
本发明的递送载体可与例如惰性稀释剂或与可同化的食用载体一起经口服给予，或者可包封在硬壳胶囊剂或软壳胶囊剂内，或者可压制成片剂，或者可直接掺到膳食食品中。对于口服治疗性给药，递送载体可与赋形剂一起掺入，并且以片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等形式使用。这类组合物和制剂应含有至少0.1％的递送载体。当然，这些组合物中携带药物或疫苗的递送载体的百分比可以变化，且可适当地介于约2％至约60％的单位重量之间。这类治疗上有益的组合物中的药物或疫苗的量是可获得适当剂量的量。优选的本发明组合物应如此制备，以使得口服剂量单位含有介于约1mg和250mg之间的活性药物或疫苗。
片剂、胶囊剂等还可含有粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式为胶囊剂时，除上述类型的材料外，它还可含有液体载体，例如脂肪油。
可存在各种其它材料作为包衣材料，或者用来改进剂量单位的外形。例如，片剂可以用虫胶、糖或两者包衣。除活性成分外，糖浆剂还可含有作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料及矫味剂，例如樱桃香料或橙香料。
含有治疗药物或携带疫苗抗原的递送载体还可经胃肠外给药。可以在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备这些载体的溶液剂或混悬剂。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物的油溶液中制备分散剂。示例性的油为石油源、动物源、植物源或合成源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。一般而言，水、盐水、葡萄糖水溶液和有关糖溶液以及二醇类(例如丙二醇或聚乙二醇)为优选的液体载体，特别对于注射用溶液。在贮存和使用的一般条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。
适于注射用的药物剂型包括无菌水溶液剂或分散剂及用于临用时配制无菌注射溶液剂或分散剂的无菌粉针剂。在所有情况下，剂型都必须是无菌的，且必须是达到易于注射程度的流体。在制造和贮存条件下，剂型必须是稳定的，且必须防止受微生物(例如细菌和真菌)活动的污染。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。
本发明的递送载体还可以直接气雾剂的形式给予气道。至于用作气雾剂，本发明化合物的溶液剂或混悬剂与合适的抛射剂(例如如丙烷、丁烷或异丁烷等烃抛射剂与常规辅料)一起包装在压缩气雾剂容器中。还可以非压缩形式例如在雾化吸入器或喷雾器中给予本发明的材料。
下面的实施例对组合物在本发明治疗方法中的各种方法进行了说明。实施例旨在说明，而绝非限制本发明的范围。
实施例
实施例1-细菌菌株、质粒和生长条件
表1中描述了用于这些实施例的细菌菌株和质粒。
表1.细菌菌株和质粒
使用DHA作为供体，经P1vir转导将dsbA::Kan等位基因导入JC8031，来制备细胞菌株JCA。使PCR扩增的clyA基因在SacI和XbaI位点之间与pBAD18-Cm连接，来构建质粒pClyA。在XbaI和HindIII位点之间分别插入编码gfpmut2基因(Crameri等，“Improved GreenFluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling(通过使用DNA改组的分子进化来改进绿色荧光蛋白)”,Nat Biotechnol 14:315-9(1996)和DeLisa等，“Genetic Analysis of the Twin Arginine Translocator Secretion Pathway inBacteria(细菌中双精氨酸易位蛋白分泌途径的遗传分析)”,J Biol Chem 277:29825-31(2002)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)或6x多聚组氨酸序列的DNA，分别得到质粒pClyA-GFP和pClyA-His6。首先将gfpmut2基因克隆到pBAD18-Cm的SacI和XmaI位点之间，然后将clyA基因插入XmaI和XbaI位点之间，来构建质粒pGFP-ClyA。将PCR扩增的gfpmut2基因在SacI和HindIII位点之间与pBAD18-Cm连接，来构建质粒pGFP。对于pBAD24中的ClyA-X融合，将PCR扩增的配偶体基因(bla除外)的每一个插入XmaI和SphI位点之间，接着在NcoI和XmaI位点之间与clyA连接。按类似方法，在NcoI和XmaI之间连接融合配偶体，在XmaI和SphI之间连接clyA，以在pBAD24中构建X-ClyA融合。通过将融合配偶体X插入pBAD24的NcoI和SphI之间，来构建无clyA的对照质粒。对于有ClyA的Bla融合，采用上述相同策略，将clyA和bla在SacI和XmaI和SphI位点之间插入质粒pBAD18-Kan。使pB18D中的Lpp-OmpA-scFv.Dig嵌合体编码基因扩增并在NcoI和SphI之间连接pBAD24，得到pB24D。为了制备pClyA(Δ156-303)-scFv.Dig，将pClyA-scFv.Dig用HpaI和XmaI消化，然后在脱去悬垂碱基对后，通过平端连接来进行自身连接。为了制备pClyA(Δ293-303)-scFv.Dig，使ClyA首292个氨基酸的编码DNA进行PCR扩增，并替换野生型clyA插入pClyA-scFv.Dig。使用Strata基因位点定向诱变试剂盒，用pClyA-scFv.Dig作为位点定向诱变的模板，来制备质粒pClyA(Y288G)-scFv.Dig。使细胞在LB培养基中生长，培养基含有合适的抗生素：氨苄西林，100μg/ml；氯霉素，25μg/ml；以及卡那霉素，50μg/ml。使细胞在37℃下保持生长，除非另有说明。当细胞达到OD600≈0.5时，加入0.2％阿拉伯糖，诱导蛋白质合成6小时。
实施例2-细胞培养物
人宫颈上皮癌(Human epithelial cervical carcinoma，HeLa)细胞由美国典型培养物保藏中心(ATCC#CCL-2)获得，使之在补充了10％NuSerum和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改进的Eagles极限培养基(DMEM)中生长。将细胞维持在37℃、95％空气、5％CO2的加湿气氛下。对于荧光显微镜检术实验，在实验之前，使细胞在12-mm圆形玻璃盖玻片上生长2天。
实施例3-亚细胞分级分离
通过冷渗压震扰法(cold osmotic shock procedure)(Kim等，“Twin-ArginineTranslocation of Active Human Tissue Plasminogen Activator in Escherichiacoli(大肠杆菌中有活性的人组织纤溶酶原激活剂的双精氨酸易位)”,Applied andEnvironmental Microbiology71:8451-8459(2005)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，从表达融合蛋白的细胞中制备胞质流分和周质流分，除去可溶性流分后收集残留的沉淀作为不溶性流分。
实施例4-细菌小泡的分离
基本按前述方法(Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，从需氧生长在37℃LB培养基(除非另有说明)中的对数期后期的细菌培养物中分离出小泡。简单来讲，在4℃下，以5,000xg离心15分钟除去细菌细胞，将不含细胞的上清液通过0.2μm孔径大小的真空滤器过滤。在4℃下，滤出的上清液用28Ti转子(BeckmanInstruments，Inc.，Fullerton，CA)以141,000xg超速离心2小时以收集小泡，小心地取出含有OMV的沉淀，并悬浮于PBS(pH 7.0)中。将小泡制备物放到LB琼脂上，以证实完全除去细菌细胞。将小泡制备物保存在-20℃下。
实施例5-外膜小泡分级分离
按照文献方法，对已沉淀的外膜小泡样品进行了分离(Horstman等，“Enterotoxigenic Escherichia coli Secretes Active Heat-Labile Enterotoxin ViaOuter Membrane Vesicles(肠产毒性大肠杆菌通过外膜小泡分泌有活性的热不稳定肠毒素)”,J Biol Chem 275:12489-96(2000)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。简单来讲，按照上述方法分离小泡，只不过将小泡悬浮于50mM HEPES(pH 6.8)中，在0.15ml中调节至45％Optiprep(Sigma，St.Louis，MO)，并转移到12-ml超速离心管底部。如下依次加入不同的Optiprep/HEPES层：0.9ml 35％、0.9ml 30％、0.66ml 25％、0.66ml 20％、0.33ml15％和0.33ml 10％。进行梯度离心(180,000xg，180分钟，4℃)。依次取出相同体积的共10个流分，并用SDS-PAGE进行了分析。
实施例6-小泡表征
按照已公开的方案，通过测定小泡的总蛋白浓度或干质量，来确定纯化的不含细胞的上清液中小泡的量(Kadurugamuwa等，“Virulence Factors Are Released fromPseudomonas aeruginosa in Association with Membrane Vesicles During NormalGrowth and Exposure to Gentamicin:A Novel Mechanism of Enzyme Secretion(在正常生长和暴露于庆大霉素期间从铜绿假单胞菌释放出的毒力因子与膜小泡缔合：酶分泌的一种新机制)”,J Bacteriol 177:3998-4008(1995)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。采用标准方案，用Nanosizer Nano ZS仪(Malvern Instruments，Westborough，MA)测定1mL PBS中含有约30μg/mL总蛋白质的小泡样品的粒径分布和ζ电位。应用计算粒径分布的通用算法和测定ζ电位的Smoluchowski概算法，用Malvern Dispersion Technology软件获得数据并进行了分析。
实施例7-蛋白质测定
按照标准分光光度测定法，分别使用头孢硝噻吩(nitrocefin)(Sigma)、ONPG(Sigma)和对氧磷(paraoxon)(Sigma)，测定了完整细胞、OMV和亚细胞流分的Bla、LacZ和OPH活性(Cho等，“Bacterial Cell Surface Display of Organophosphorus Hydrolasefor Selective Screening of Improved Hydrolysis of Organophosphate NerveAgents(细菌细胞表面展示的用于选择性筛选有机磷神经毒剂水解得到改进的有机磷水解酶)”,Appl Environ Microbiol 68:2026-30(2002)；Francisco等，“Transport andAnchoring of Beta-lactamase to the External Surface of Escherichia coli(β-内酰胺酶转运并锚定在大肠杆菌外表面)”,Proc Natl Acad Sci U S A 89:2713-7(1992)；以及Miller J.H.，A Short Course in Bacterial Genetics.A Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria(细菌遗传学短期培训教程：大肠杆菌及相关细菌实验指南手册),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY(1992)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。按文献方法，将表达抗地高辛scFv的细胞用Dig-BODIPY标记，并通过流式细胞术进行了分析(Daugherty等，“Development of an Optimized Expression System for the Screening of AntibodyLibraries Displayed on the Escherichia coli Surface(筛选在大肠杆菌表面展示的抗体文库的最优化表达系统的开发)”,Protein Eng 12:613-21(1999)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)，对总蛋白浓度进行了测定。附上所述进行了蛋白质可及性测定，只不过用的是蛋白酶K(Proteaseaccessibility assays)(Kesty等，“Incorporation of Heterologous Outer Membraneand Periplasmic Proteins into Escherichia coli Outer Membrane Vesicles(大肠杆菌外膜小泡中异源外膜蛋白和周质蛋白的掺入中)”,J Biol Chem 279:2069-76(2004)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。简单来讲，在1％SDS不存在或存在下，在37℃下，用20mM Tris HCl(pH 8.0)与PK(0.1mg/ml)处理小泡30分钟。在平行对照实验中，已经IMAC纯化的ClyA-GFP和GFP-ClyA同样用PK处理。孵育之后，将所有样品置于冰上，加入1mM PMSF以猝灭所有蛋白酶解作用，用SDS-PAGE对样品进行了分析。按照Chen等人所述方法(“Isolation of High-Affinity Ligand-Binding Proteins by PeriplasmicExpression with Cytometric Screening(PECS)(通过周质表达与细胞计量筛选(PECS)分离高亲和力配体结合蛋白)”,Nat Biotechnol 19:537-42(2001)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，使用下列第一抗体：抗ClyA(由Sun Nyunt Wai，University，Sweden友情提供)、抗GFP(Sigma)、抗GroEL(Sigma)、抗多聚组氨酸(Sigma)、抗OmpA和抗DsbA(由Jon Beckwith，Harvard Medical School友情提供)，进行了蛋白质印迹法。使用免疫-StarTM HRP底物试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)，使膜在胶片上显影。
实施例8-表面等离振子共振(SPR)
SPR构件由传感器芯片、光学测量装置、流通池和注射泵组成，并与之前开发的类似(Baac等，“Antibody-Based Surface Plasmon Resonance Detection of Intact ViralPathogen(完整病毒病原体的基于抗体的表面等离振子共振检测)”,Biotechnol Bioeng94:815-9(2006)和Ferracci等，“Synaptic Vesicle Chips to Assay BotulinumNeurotoxins(分析肉毒杆菌神经毒素的突触小泡芯片)”,Biochem J 391:659-66(2005)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。SPR芯片是涂有一薄层(50nm)金的SF10玻璃，用折射率匹配油与由SF10制备的棱镜连接。将由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备的两个微液体通道(参比和试验)置于SPR传感器芯片上，用螺丝夹夹住以封住通道。通过使由氙灯(Oriel，Irvine，CA)产生的白光通过单色透镜(Oriel)，获得单波长光。使带宽小于1nm的光经过只透射p偏振光的偏振器。用具有约600nm的高感光度的CCD照相机(Sony)，测量反射光强度(RI)。当光束入射角固定在60度时，用PBS处理传感器芯片，使得SPR波长约为600nm。通过将相对于波长数据的RI与二阶多项方程拟合，在每个像素得到SPR波长，计算所得到SPR波长(覆盖预先确定的目标区域)的平均值。在每次测定前，记录每个像素的s偏振光的RI供参考。测出SPR传感器的可靠性检测极限小于0.2nm。
实施例9-采用SPR检测小泡和小泡抗原
用于检测小泡和小泡相关抗原的SPR芯片如下进行。首先，按照前述文献方法(Choi等，“Enhanced Performance of a Surface Plasmon Resonance Immunosensor forDetecting Ab-GAD Antibody Based on the Modified Self-Assembled Monolayers(高性能的表面等离振子共振免疫传感器用于检测基于改进的自组装单层的Ab-GAD抗体)”,Biosens Bioelectron 21:378-83(2005)和Lee等，“Characterization of a Self-Assembled Monolayer of Thiol on a Gold Surface and the Fabrication of aBiosensor Chip Based on Surface Plasmon Resonance for Detecting anti-GADAntibod(金表面上自组装的硫醇单层的表征和用于检测抗GAD抗体的基于表面等离振子共振的生物传感器芯片的制造)”,Biosens Bioelectron 20:1422-7(2005)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)，在传感器芯片表面的50-nm金层上用10mM 11-巯基十一烷酸(11-MUA)和6-巯基-1-己醇(6-MCH)的混合溶液(1:2摩尔比)进行烷基硫醇单层自组装。羟基为末端的自组装单层(SAM)用作间隔区以构建传感器表面，所述单层不被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’-(3-二乙基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)激活。其次，在SAM与0.1M NHS和0.4M EDC的1:1混合物混合10分钟激活末端羧基之后，注入链霉抗生物素(SA；200μg/ml；MP Biomedicals)的10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，在通过PBS漂洗，并用1.0M盐酸乙醇胺(pH8.5)封闭10分钟后，使之共价偶联15-20分钟。这导致SPR波长大幅增加。由于SA与羧基为末端的SAM的静电结合和共价结合之间存在密切关系，所以这种SPR信号的增强是对SA与SAM共价结合程度恰当的估计(Choi等，“Enhanced Performance of a Surface PlasmonResonance Immunosensor for Detecting Ab-GAD Antibody Based on the ModifiedSelf-Assembled Monolayers(高性能的表面等离振子共振免疫传感器用于检测基于改进的自组装单层的Ab-GAD抗体)”,Biosens Bioelectron 21:378-83(2005)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。第三，在通过PBS洗涤之后，在SA表面上注入生物素化兔抗大肠杆菌抗体(140μg/ml的PBS缓冲液；Cortex Biochem)20分钟，用PBS洗涤10分钟以除去未结合的生物素化抗大肠杆菌抗体。这导致SA与生物素缀合的蛋白质之间特有的静电结合的SPR波长增加。作为对照，将牛血清白蛋白(BSA；140μg/ml的乙酸钠缓冲液)替换抗大肠杆菌抗体加到SPR传感器芯片的SA包被的参比通道，正如所料，在加入BSA或随后的抗大肠杆菌抗体之后，没有观察到可检测的SPR波长位移。
实施例10-荧光显微镜检术
对于免疫荧光研究，将已被诱导表达GFP或ClyA-GFP的大肠杆菌细胞在PBS中洗涤3次，与1:500稀释的小鼠抗GFP(或抗多聚组氨酸)一起在4℃下孵育过夜，沉淀，在PBS中洗涤3次，与1:100稀释的罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG(Molecular Probes，Carlsbad，CA)一起孵育1小时，沉淀后再次用PBS洗涤3次。最后，通过配备Spotflex彩色数码照相机的ZeissAxioskop 40荧光显微镜以及用于GFP(激发为485nm，发射为505nm)和罗丹明(激发为540nm，发射为600nm)的滤光片组，对细胞进行了观察。对于OMV与真核细胞相互作用的荧光研究，将生长在玻璃盖玻片上的HeLa细胞用不含血清的OptiMEM(Life Technologies，Carlsbad，CA)洗涤，然后按照本文所述方法处理。处理之后，细胞用3.7％福尔马林的PBS溶液固定，在PBS中洗涤3次，在PBS/0.1％曲通(Triton)X-100中透化，用0.5mg/mL溴化乙锭的PBS溶液染色，最后在PBS中洗涤3次。使用Vectashield Hardset封固剂(VectorLaboratories，Burlingame，CA)将盖玻片封在玻璃载玻片上后，进行了宽视野落射荧光分析(wide-field epifluorescence analysis)。对于WGA研究，使未透化细胞与1μg/ml德克萨斯红WGA(Molecular Probes)一起在4℃下孵育1小时。对于GM1实验，使约150μg小泡与10μg GM1(Sigma)一起在25℃下预孵育30分钟。
实施例11-电子显微镜术
按照前述文献方法，通过负染色技术对小泡的超微结构进行了分析(Wai等，“TheRelease of Outer Membrane Vesicles from the Strains of EnterotoxigenicEscherichia coli(从肠产毒性大肠杆菌菌株释放的外膜小泡)”,Microbiol Immunol 39:451-6(1995)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。对于免疫金标记法，收集10μl经诱导的大肠杆菌细胞悬液，洗涤后，应用到400目Formvar包被和碳包被的铜栅极(ElectronMicroscopy Sciences，Hatfield，PA)上，与1:500稀释的抗GFP一起孵育1小时。细胞用PBS洗涤，与1:100稀释的25nm胶态金缀合的山羊抗小鼠IgG(Electron Microscopy Sciences)一起孵育1小时，再次洗涤，用0.25％磷钨酸(PTA，Electron Microscopy Sciences)与0.01％BSA的水溶液负染色，使用FEI/Philips Morgagni透射电子显微镜进行了观察。
实施例12-细胞毒性实验
在PBS中制备小泡，利用BSA蛋白质标准，通过Coomassie Plus Assay(Pierce)定量测定小泡流分中的总蛋白质。以5,000细胞/孔的初始密度，使HeLa细胞在透明平底组织培养聚苯乙烯96孔板(Costar)的200μl生长培养基中生长。24小时后，除去生长培养基，用110μl Opti-MEM(Invitrogen)无血清培养基、40μl未稀释(1x；～90-150μg/ml总蛋白质)或1:1稀释的(0.5x；～40-60μg/ml总蛋白质)OMV样品的PBS溶液更换。在小泡样品存在下，将细胞孵育4小时；之后，除去含有OMV的培养基，用175μl不含酚红的生长培养基更换。再次孵育48小时之后，将35μl CellTiterAqueous One Solution细胞增殖实验试剂(Promega，Madison，WI)加到各孔中。该实验利用四唑化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑内盐；MTS]和电子偶合试剂吩嗪硫酸甲酯。MTS被细胞化学还原成甲其浓度和在490nm下的光学吸光度可供衡量有代谢活性的活细胞。使样品孵育1小时，在微量培养板分光光度计中在490nm下读取吸光度。相对于PBS对照来报告细胞存活率。
实施例13-GFP当与ClyA融合时共定位在外膜小泡中
现有研究证实，大肠杆菌ClyA和报道分子蛋白(例如Bla和GFP)之间的遗传融合有效地跨胞质膜易位(del Castillo等，“Secretion of the Escherichia coli K-12 SheAHemolysin is Independent of its Cytolytic Activity(大肠杆菌K-12 SheA溶血素的分泌与其细胞溶解活性无关)”,FEMS Microbiol Lett 204:281-5(2001)和Galen等，“Adaptation of the Endogenous Salmonella enterica serovar Typhi ClyA-EncodedHemolysin for Antigen Export Enhances the Immunogenicity of AnthraxProtective Antigen Domain 4 Expressed by the Attenuated Live-Vector VaccineStrain CVD 908-htrA(抗原输出的内源性肠沙门氏菌伤寒血清变型ClyA编码的溶血素的修饰提高由活的减毒载体疫苗菌株CVD 908-htrA表达的炭疽保护性抗原第四结构域的免疫原性)”,Infect Immun 72:7096-106(2004)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)，这种定位不依赖于融合蛋白中ClyA的位置(N端或C端)(del Castillo等，“Secretionof the Escherichia coli K-12 SheA Hemolysin is Independent of its CytolyticActivity(大肠杆菌K-12 SheA溶血素的分泌与其细胞溶解活性无关)”,FEMS MicrobiolLett 204:281-5(2001)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。Wai及其同事分别证实了通过由外膜和周质组成的OMV从大肠杆菌细胞的实验室菌株中输出了ClyA(Wai等，“Characterization of dominantly negative mutant ClyA cytotoxin proteins inEscherichia coli(大肠杆菌中显性阴性突变型ClyA细胞毒素蛋白的表征)”,J Bacteriol185:5491-9(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。同是这几位作者报告了相对于其它腔结合和膜结合OMV蛋白，OMV中明显富含ClyA(Wai等，“Vesicle-Mediated Exportand Assembly of Pore-Forming Oligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的小泡介导的输出和装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。根据这些结果，推测与ClyA的N端或C端融合的蛋白质可有效地共定位在OMV中，并且在小泡定位后保持其天然功能。为了检验这一点，建立了GFP和ClyA的N端或C端的融合构建体。在OMV高产菌株JC8031中使这些融合蛋白表达(Bernadac 等，“Escherichia coli tol-pal Mutants Form Outer Membrane Vesicles(大肠杆菌tol-pal突变型形成外膜小泡)”,J Bacteriol 180:4872-8(1998)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，之后由不含细胞的培养物上清液中纯化出小泡，得到均质的s-MV(图1A)，其中平均直径(图1B)和ζ电位与由无质粒JC8031细胞产生的裸OMV的几乎无法区别。这个结果与不因掺入异源小泡蛋白而改变小泡密度和大小的早期结果一致(Kesty等，“Incorporation of Heterologous Outer Membrane and Periplasmic Proteinsinto Escherichia coli Outer Membrane Vesicles(大肠杆菌外膜小泡中异源外膜蛋白和周质蛋白的掺入)”,J Biol Chem 279:2069-76(2004)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。显著水平的ClyA-GFP或GFP-ClyA定位于小泡中，而在s-MV制备物中没有发现单独表达的未融合GFP(图1C)。与ClyA定位的早期研究一致(Wai等，“Vesicle-Mediated Exportand Assembly of Pore-Formin Oligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的小泡介导的输出和装配)”,Cell 115:25-35(2003)和Wai等，“Characterization of dominantly negative mutant ClyA cytotoxin proteinsin Escherichia coli(大肠杆菌中显性阴性突变型ClyA细胞毒素蛋白的表征)”,JBacteriol 185:5491-9(2003)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)，大肠杆菌细胞的亚细胞分级分离表明，未融合的ClyA聚集在胞质流分、周质流分和OMV流分中(图1D)。同样，加入GFP作为N端或C端过客蛋白产生类似的定位方式(图1D)，尽管不溶性流分中ClyA融合的量较之于未融合ClyA的量明显增加。两种融合蛋白在胞质流分、周质流分和OMV流分中发出荧光(图1E-F)，与表达ClyA-GFP或GFP-ClyA的细胞有关的完整细胞荧光几乎与只表达GFP的细胞一样明亮。总之，数据清楚表明GFP与ClyA易位并存，因为这些两种蛋白质间的嵌合体共定位于OMV中而不显著丧失荧光活性。
以下观察结果证实了分级分离方法的质量，内源性表达的外膜蛋白OmpA总是占优势地存在于OMV流分中(表示表达ClyA-GFP的细胞，图1D)，这与早期研究一致(Wai等，“Vesicle-mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of theEnterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，而GroEL仅存在于胞质流分中，DsbA存在于周质流分中(图1D)。DsbA也以高水平积累在OMV流分中(图1D)。虽然周质蛋白常常被包封在OMV中(Horstman等，“Enterotoxigenic Escherichia coliSecretes Active Heat-Labile Enterotoxin Via Outer Membrane Vesicles(肠产毒性大肠杆菌通过外膜小泡分泌有活性的热不稳定肠毒素)”,J Biol Chem 275:12489-96(2000)；McBroom等，“Outer Membrane Vesicles(外膜小泡)”,EcoSal-Escherichia coliand Salmonella:Cellular and Molecular Biology(III，R.C.出版)。ASM Press，Washington，D.C.(2005)；Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的小泡介导的输出和装配)”,Cell 115:25-35(2003)；以及Kesty等，“Incorporation of Heterologous Outer Membrane and Periplasmic Proteins intoEscherichia coli Outer Membrane Vesicles(大肠杆菌外膜小泡中异源外膜蛋白和周质蛋白的掺入)”,J Biol Chem 279:2069-76(2004)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)，但是根据Wai及其同事报告的DsbA蛋白不包括在其OMV流分中的结果(Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of theEnterobacterial ClyA Cytotoxin(肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的小泡介导的输出和装配)”Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，DsbA的存在是预料不到的。一种对该结果不一致的解释是这可能与使用tolRA突变型菌株JC8031有关，虽然该菌株JC8031有分泌大量小泡的倾向，但其也以渗漏性外膜为特征(Bernadac等，“Escherichia coli tol-pal Mutants Form Outer Membrane Vesicles(大肠杆菌tol-pal突变型形成外膜小泡)”,J Bacteriol 180:4872-8(1998)和McBroom等，“OuterMembrane Vesicle Production by Escherichia coli is Independent of MembraneInstability(由大肠杆菌产生的外膜小泡与膜不稳定性无关)”,J Bacteriol 188:5385-92(2006)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。然而，在ΔnlpI突变型细胞的亚细胞分级分离之后，观察到类似形式的ClyA-GFP和DsbA定位(图1D)，已知所述ΔnlpI突变型细胞产生相对大量的小泡，但却不表现膜不稳定性(McBroom等，“Outer Membrane VesicleProduction by Escherichia coli is Independent of Membrane Instability(由大肠杆菌产生的外膜小泡与膜不稳定性无关)”,J Bacteriol 188:5385-92(2006)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。因此，根据早期研究结果(Horstman等，“EnterotoxigenicEscherichia coli Secretes Active Heat-Labile Enterotoxin Via Outer MembraneVesicles(肠产毒性大肠杆菌通过外膜小泡分泌有活性的热不稳定肠毒素)”,J Biol Chem275:12489-96(2000)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，目前有利的解释是使用不同的宿主菌株导致小泡蛋白质性质发生改变。
为了确定已沉淀的上清液中ClyA-GFP是与完整小泡有关还是与释放的外膜片段有关，对同时与周质和外膜产物共迁移的融合蛋白进行了测试。为此，通过密度梯度离心，从表达ClyA-GFP的细胞分离经沉淀的上清液。对所得流分进行的蛋白质印迹法分析和光密度测定分析显示，在流分6-8出现峰值的ClyA-GFP的梯度分布(图2A和B)与OMV有关的α-溶血素的梯度分布相似(Balsalobre等，“Release of the Type I Secreted alpha-Haemolysin Via Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli(I型分泌性α-溶血素通过外膜小泡从大肠杆菌中释放)”,Mol Microbiol 59:99-112(2006)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。正如所料，在富含ClyA-GFPr的OMV的同一流分中检测出最大GFP活性(图2B和图C)，尽管在较稠密的流分中可能检出较弱的荧光(图2C)。含有大量ClyA-GFP的流分6-8同样富含外膜蛋白OmpA，但是在流分9和流分10也似乎出现强荧光条带(图2A)。有趣的是，DsbA更均匀地分布在流分5-10之间(图2A)，表明了与包含大量ClyA-GFP的小泡(流分6-8)以及与含有较少量ClyA-GFP的小泡(流分5、9和10)共迁移。
实施例14–Cly将正确折叠的GFP锚定于大肠杆菌外表面和s-MV表面
为了确定ClyA-GFP和GFP-ClyA嵌合体的拓扑结构，探测了GFP对完整细胞表面和对小泡表面的可及性。现有研究表明部分分泌的ClyA保持定位在细菌细胞表面(Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of theEnterobacterial ClyA Cytotoxin(肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的小泡介导的输出和装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。同样，观察发现ClyA-GFP和GFP-ClyA同时定位于细胞表面，正如通过GFP部分对交叉反应抗体的可及性所证实的一样。准确地讲，使用抗GFP抗体的阳性免疫荧光标记和免疫金标记，检测到表达与GFP融合的ClyA的JC8031细胞，但是在未融合ClyA或未融合GFP的情况下却未检测到(图3显示未融合GFP和ClyA-GFP)。
为了确定与小泡缔合的GFP是否同样可接近交叉反应抗体，对s-MV进行了免疫荧光标记，但是在本分析中仅观察到超过本底的微弱免疫荧光信号。这就促使了开发基于更灵敏和量化的表面等离振子共振(SPR)的策略，以用于检测小泡缔合的GFP。为此，将生物素化抗大肠杆菌抗体(试验通道)和牛血清白蛋白(BSA，参比通道)通过链霉抗生物素结合与SPR传感器芯片偶联。为了证实SPR表面可以俘获s-MV，掺入含有不同量的上述流分7的完整s-MV溶液，其中该流分中s-MV的初始浓度为13.5±1.34μg/μl。在向SPR掺入含有s-MV的ClyA-GFP之后，立刻留意到即使在数次PBS洗涤步骤之后，用抗大肠杆菌抗体包被的试验通道而不是BSA包被的参比通道发出极强的荧光(图4A)，这就表明在SPR表面特异性俘获s-MV。SPR结合显示在一系列s-MV浓度(0.02-0.70μg/μl)下，SPR波长发生浓度依赖性的位移(图4B和图4C)。重要的是，用PBS对表面俘获的s-MV进行处理时，在SPR波长方面没有可测得出的变化，这就表明荧光小泡与固定化抗大肠杆菌抗体稳定并紧密地结合。最后，为了确定SPR策略是否适于检测OMV缔合的抗原，将抗GFP单克隆抗体掺进试验通道，该通道含有表面俘获的展示活性GFP的s-MV。试验通道中SPR波长显著增加证实了抗GFP抗体与小泡缔合的GFP之间特异性结合(图4D，黑线)。还进行了对照试验，其中这些s-MV用非特异性抗His6x单克隆抗体处理，或者其中展示未融合ClyA的s-MV被俘获到SPR表面并用抗GFP抗体处理；两种情况均出现检测不到SPR波长的增加(图4D表示抗His6x处理的Cly-GFP s-MV，灰线)。
进行了蛋白酶K(PK)对ClyA-GFP和GFP-ClyA小泡的敏感性实验，以确定免疫可及性GFP是否受小泡结构保护。在破膜去垢剂不存在时，当得自表达ClyA-GFP或GFP-ClyA的JC8031细胞的s-MV与PK一起孵育时，与小泡相关的荧光完全消失(图5A，表示ClyA-GFP)，这就表明了大量功能性GFP暴露在表面，不受小泡结构保护。与此一致，蛋白质印迹分析证实几乎所有的s-MV缔合的ClyA-GFP在用PK处理时被降解成较低分子量的抗GFP或抗ClyA交叉反应类型(图5B，泳道1-3和泳道7-9)。有趣的是，在相同的GFP-ClyA s-MV处理之后，即使与2-5倍高PK浓度一起保持孵育2倍长时间，都观察到大量的PK抗性物质(图5B，泳道4-6和泳道10-12)。因为这些PK处理的s-MV是无荧光的，但却含有相当一部分的抗PK的GFP-ClyA，所以得出结论，即仅一部分融合蛋白与所连接的功能性GFP系留在OMV之外，而其余的则呈无活性构象，被小泡结构保护起来。对此，可能的原因包括由与ClyA-GFP相比相对高水平地表达GFP-ClyA所引起的定位缺陷和/或融合显然不稳定，正如由在PK不存在时观察的多个抗ClyA交叉反应条带所证实的一样(图5B，泳道10)。对于两种嵌合体，当膜在加入1％SDS破裂时，PK引起GFP被完全蛋白水解消化掉(图5B)。使用纯化的可溶性ClyA-GFP的对照实验显示该蛋白质在去垢剂存在或不存在下均易对PK敏感。
实施例15–周质二硫键形成机制是ClyA和ClyA融合定位于OMV所必需的
之前的研究证明，周质中ClyA由于多肽87位和285位的半胱氨酸残基形成分子内二硫键而呈单体构象(Atkins等，“Structure-function relationships of a novelbacterial toxin,hemolysin E.The role of alpha G (新的细菌毒素溶血素E的结构-功能关系：αG的作用)”,J Biol Chem275:41150-5(2000)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。二硫键的存在足以阻止ClyA寡聚化，并使其天然溶血性活性失活。与该研究结果一致，Wai等人报告了在含有ClyA的OMV中不存在周质蛋白中负责催化二硫键形成的酶DsbA，且不存在DsbA是ClyA寡聚成为其溶血构象所必需的(Wai等，“Vesicle-Mediated Exportand Assembly of Pore-Forming Oligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的小泡介导的输出和装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。与Wai等的研究结果相反，在这些研究中，DsbA共定位于含有ClyA融合的小泡中(参见图1)。因此，推测氧化的单体ClyA可能有利于融合蛋白的有效的细胞表面和小泡定位。为了检验这一假说，对在菌株JC8031中表达的ClyA-GFP和得自JC8031的等基因dsbA::Kan突变型进行了比较。蛋白质印迹分析显示，虽然两个菌株在周质中积累相同量的ClyA-GFP，但是只在存在DsbA的细胞中观察到ClyA-GFP的定位(图5C)。观察到得自表达ClyA-GFP的JC8031dsbA::Kan细胞的OMV完全缺乏荧光证实了这一点(图5D)。这类相同细胞的免疫荧光染色显示，定位在细菌细胞表面的ClyA-GFP还取决于DsbA(图5D)。预料不到地发现，对于未融合的ClyA也观察到DsbA依赖性小泡定位，表明了周质的氧化还原态是本文试验条件下调节蛋白质定位于小泡的效力的关键因素。有趣的是，观察到得自无质粒JC8031细胞的裸OMV有非常少、甚至没有明显的细胞毒性，与早期研究一致(Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of theEnterobacterial ClyA Cytotoxin(肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的小泡介导的输出和装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，对于含有ClyA-His6、ClyA-GFP或GFP-ClyA的s-MV也如此，这表明这些小泡中的ClyA不是其有溶血活性的寡聚体构象。
实施例16-工程改造的ClyA-GFP s-MV可用于观察小泡与真核细胞的相互作用
之前的研究表明，得自致病大肠杆菌或非致病大肠杆菌菌株的小泡可与真核细胞缔合(Kesty等，“Enterotoxigenic Escherichia coli Vesicles Target Toxin Deliveryinto Mammalian Cells(递送至哺乳动物细胞的肠产毒性大肠杆菌小泡靶毒素)”,EMBO J23:4538-49(2004)和Kesty等，“Incorporation of Heterologous Outer Membrane andPeriplasmic Proteins into Escherichia coli Outer Membrane Vesicles(大肠杆菌外膜小泡中异源外膜蛋白和周质蛋白的掺入)”,J Biol Chem 279:2069-76(2004)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。因此，研究了被ClyA-GFP官能化的s-MV是否适于跟踪与真核细胞缔合的小泡。对此的现有努力都集于在小泡通过双精氨酸易位(Tat)途径转运进入周质之后，将GFP加载到小泡腔内(Kesty等，“Incorporation of Heterologous OuterMembrane and Periplasmic Proteins into Escherichia coli Outer MembraneVesicles(大肠杆菌外膜小泡中异源外膜蛋白和周质蛋白的掺入)”,J Biol Chem 279:2069-76(2004)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。然而，含有GFP的OMV只是弱荧光的，在宿主细胞中无法用显微镜跟踪，可能是由于低产量的GFP通过Tat系统转运到周质所致。为了确定用ClyA-GFP经工程改造的s-MV是否足够亮以用于跟踪研究，进行了小泡-宿主细胞共孵育实验。将HeLa细胞与约150μg小泡经纯化的ClyA-GFP s-MV一起孵育30分钟后，观察到点状绿色染色，且该染色的强度随HeLa细胞与ClyA-GFP s-MV孵育时间的增加而加强(图6A)。这些结果提示小泡保持在细胞表面上，或者与靶细胞膜直接融合。为了证实这一点，与纯化的含有ClyA-GFP的s-MV一起孵育的HeLa细胞用荧光形式的细胞表面标记麦胚凝集素(WGA)染色，然后用PBS洗涤。共焦显微术显示ClyA-GFP OMV与WGA共定位在细胞外部。接着，通过研究点状荧光的出现是否是温度依赖性的(细胞内化的标志)，来研究ClyA-GFP小泡的命运(Kesty等，“Enterotoxigenic Escherichia coli Vesicles Target ToxinDelivery into Mammalian Cells(递送至哺乳动物细胞的肠产毒性大肠杆菌小泡靶毒素)”,EMBO J 23:4538-49(2004)和Pelkmans等，“Caveolar Endocytosis of SimianVirus 40Reveals a New Two-Step Vesicular-Transport Pathway to the ER(猿猴病毒40的胞膜窖胞吞作用揭示新的至ER的两步小泡转运途径)”,Nat CellBiol 3:473-83(2001)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。在4℃下与含有ClyA-GFP的小泡一起孵育的HeLa细胞具有非常低的细胞相关性荧光水平(与图6B比较)。然而，当HeLa细胞与ClyA-GFP s-MV在4℃下一起孵育3小时，然后转移到37℃3小时，观察到强的细胞荧光(图6B)，一些s-MV在37℃下内化的可能性仍存在。胞吞中的关键因素是神经节苷脂M1(GM1)，一种肠毒素例如LT和霍乱毒素(CT)的真核细胞表面受体，是得自非致病大肠杆菌的含有LT的OMV的胞吞所必需的(Kesty等，“Enterotoxigenic Escherichia coli Vesicles TargetToxin Delivery into Mammalian Cells(递送至哺乳动物细胞的肠产毒性大肠杆菌小泡靶毒素)”,EMBO J 23:4538-49(2004)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。因此，对所观察到的与ClyA-GFP s-MV一起孵育的HeLa细胞荧光是否依赖GM1进行了测定。实际上，在与用GM1预处理的纯化的ClyA-GFP s-MV一起孵育之后，与HeLa细胞有关的荧光显著降低(图6C)。此外，与GM1处理的小泡一起孵育导致少量的大荧光聚簇，且点状绿色荧光比所观察到的与未处理ClyA-GFP OMV一起孵育的HeLa细胞的少得多(图6C)。因此，GM1细胞表面受体似乎可在介导HeLa细胞与工程改造的小泡之间的相互作用中起重要作用。最后，为了分析小泡对靶细胞的细胞毒性作用，对培养的HeLa细胞如何受等量的不同小泡制备物的影响进行了分析。一般而言，对于这些小泡中的ClyA和ClyA-GFP，含有ClyA-His6或ClyA-GFP的小泡实际上不具有可检测的细胞毒性(图6D)，与单体DsbA+构象一致(Wai等，“Vesicle-Mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of the EnterobacterialClyA Cytotoxin(肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的小泡介导的输出和装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。
实施例17-共定位于s-MV的异源蛋白通过ClyA保持其活性
为了确定是蛋白质而不是GFP可与ClyA融合且同时仍保持其功能，在ClyA与下列酶之间建立了一系列N端和C端融合：β-内酰胺酶(Bla)、有机磷水解酶(OPH)和β-半乳糖苷酶(LacZ)。与GFP所观察的类似，ClyA-Bla导致Bla定位于JC8031细胞和小泡的表面，正如使用头孢硝噻吩水解实验所测定的一样(表2)。
表2.ClyA介导的有酶促活性的蛋白质的展示
括号中的值表示胞质流分中的活性。
所有数值表示3个重复实验的平均值，其中标准误差<5％。
因为胞质中表达的Bla不定位于细胞或小泡表面，且因为头孢硝噻吩对于外膜是相对不渗透的(Angus等，“Outer Membrane Permeability in Pseudomonas aeruginosa:Comparison of a Wild-type with an Antibiotic-Supersusceptible Mutant(铜绿假单胞菌的外膜通透性：野生型与抗生素敏感性突变型的比较)”,Antimicrob AgentsChemother 21:299-309(1982)和Good等，“Antisense PNA Effects in Escherichia coliare Limited by the Outer-Membrane LPS Layer(大肠杆菌中反义PNA的作用受外膜LPS层的限制)”,Microbiology 146:2665-70(2000)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)，所以这些数据为Bla部分定位于细胞和小泡外部提供了强有力的证据。使用对外膜渗透同样非常差的Bla底物青霉素G得到了类似结果(Nikaido等，“Sensitivity ofEscherichia coli to Various Beta-lactams is Determined by the Interplay ofOuter Membrane Permeability and Degradation by Periplasmic beta-lactamases:AQuantitative Predictive Treatment(通过外膜通透性与由周质β-内酰胺酶降解的相互作用测定大肠杆菌对各种β-内酰胺的敏感性：量化预测处理),Mol Microbiol 1:29-36(1987)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。有趣的是，正如上述ClyA和GFP间的嵌合体所观察的一样，Bla与ClyA的N端融合导致显著较低的Bla活性水平。与这些结果一致，ClyA与OPH酶的N端融合赋予细胞和小泡表面显著的OPH活性水平，而OPH-ClyA则导致无可检测的与表面有关的OPH活性(表2)。由于用于这些实验的OPH底物对氧磷是膜不通透性的(Richins等，“Biodegradation of Organophosphorus Pesticides by Surface-Expressed Organophosphorus Hydrolase(表面表达的有机磷水解酶对有机磷杀虫剂的生物降解)”,Nat Biotechnol 15:984-7(1997)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，因此得出的结论是ClyA-OPH随OPH定位，在外部与细胞和小泡两者结合。同样，由于OPH活性取决于同二聚体形成(Grimsley等，“Organophosphorus Hydrolase is a RemarkablyStable Enzyme that Unfolds Through a Homodimeric Intermediate(有机磷水解酶是通过同二聚化中间体解折叠的十分稳定的酶)”,Biochemistry 36:14366-74(1997)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，因此ClyA显然以允许与邻接的ClyA-OPH分子二聚化的构象与OPH连接。最后，为了确定展示多聚体酶的能力是否是ClyA介导的表面暴露的普遍特征，构建了与得自大肠杆菌的同四聚体LacZ酶的ClyA融合(Jacobson等，“Three-Dimensional Structure of Beta-galactosidase from E.coli(得自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的三维结构)”,Nature 369:761-6(1994)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。虽然ClyA-LacZ的表达导致强的胞质LacZ活性，但是在细胞或其衍生的s-MV表面无可测量的LacZ活性(表2)。实际上，在表达ClyA-LacZ的细胞周质中没有LacZ活性，与以下观察结果一致，即正常胞质LacZ蛋白含有阻碍转运的序列，这通常导致错折叠并因此产生无活性的蛋白质(Lee等，“Genetic Studies on the Inability of Beta-galactosidase tobe Translocated Across the Escherichia coli Cytoplasmic Membrane(β-半乳糖苷酶无法跨大肠杆菌胞质膜转移的遗传研究)”,J Bacteriol 171:4609-16(1989)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。
单链抗体片段(scFv)已成功用于制备将这些小泡及其有效负载靶向特定细胞类型的人工免疫脂质体(Kontermann，R.E.，“Immunoliposomes for Cancer Therapy(用于癌症疗法的免疫脂质体)”,Curr Opin Mol Ther 8:39-45(2006)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。按照同样方向，最好通过在大肠杆菌衍生小泡上展示scFv片段，来建立细菌“免疫-MV”。对于这些实验，使用得自以高亲和力(KD＝0.9±0.2×10-9M-1)与强心药糖苷地高辛(scFv.Dig)结合的26-10种单克隆抗体的scFv(Daugherty等，“QuantitativeAnalysis of the Effect of the Mutation Frequency on the Affinity Maturationof Single Chain Fv antibodies(突变频率对单链Fv抗体亲和力成熟的作用的定量分析)”,Proc Natl Acad Sci U S A 97:2029-34(2000)和Francisco等，“Production andFluorescence-Activated Cell Sorting of Escherichia coli Expressing aFunctional Antibody Fragment on the External Surface(在外表面表达功能性抗体片段的大肠杆菌的产生和荧光激活细胞分选法)”,Proc Natl Acad Sci U S A 90:10444-8(1993)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。使用荧光缀合的地高辛(Dig-BODIPY)，表达ClyA-scFv.Dig而并非仅表达scFv.Dig，产生能够与荧光探针结合的细胞和小泡(图7A)。由于在标准条件下Dig-BODIPY无法透过外膜(Chen等，“Isolation of High-Affinity Ligand-Binding Proteins by Periplasmic Expression with CytometricScreening(PECS)(通过周质表达与细胞计量筛选(PECS)分离高亲和力配体结合蛋白)”,Nat Biotechnol 19:537-42(2001)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，因此使用完整细胞检测出Dig-BODIPY的结合活性表明scFvs功能性地展示于细胞和小泡外表面。为了进行比较，表达与充分表征的Lpp-Omp杂合OM锚(anchor)融合的scFv.Dig的细胞(Francisco等，“Production and Fluorescence-Activated Cell Sorting ofEscherichia coli Expressing a Functional Antibody Fragment on the ExternalSurface(在外表面表达功能性抗体片段的大肠杆菌的产生和荧光激活细胞分选法)”,ProcNatl Acad Sci U S A 90:10444-8(1993)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)显示均匀但明显较弱的细胞表面荧光，OMV上无可检测的荧光(图7A)，尽管野生型OmpA定位于OMV中(Wai等，“Vesicle-mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomersof the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)(另见上述图1D)。
最后，测定了由ClyA-scFv.Dig俘获的Dig-BODIPY能否用作ClyA定位的遗传筛选。与上述荧光显微镜检术结果一致，对表达ClyA-scFv.Dig与Dig-BODIPY的JC8031细胞进行标记导致高荧光性细胞，正如流式细胞术所观察到的一样(图7B)。然而，当ClyA-scFv.Dig在JC8031dsbA::Kan细胞中表达时，荧光完全消失。同样，当只表达scFv.Dig时，由于N端与ClyA融合(scFv.Dig-ClyA)，或者由于C端与携带之前报道的破坏易位的突变ClyA变体融合(例如C端最后氨基酸10-147的缺失)(Wai等，“Characterization of dominantlynegative mutant ClyA cytotoxin proteins in Escherichia coli(大肠杆菌中显性阴性突变型ClyA细胞毒素蛋白的表征)”,J Bacteriol 185:5491-9(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，或者Tyr288残基被Gly取代(del Castillo等，“Secretion ofthe Escherichia coli K-12 SheA Hemolysin is Independent of its CytolyticActivity(大肠杆菌K-12 SheA溶血素的分泌与其细胞溶解活性无关)”,FEMS MicrobiolLett 204:281-5(2001)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，因此未检测到可测量的细胞荧光(图7B)。
实施例1-17的讨论
本研究描述了通过重组多肽与大肠杆菌细胞毒素ClyA的遗传融合而建立经工程改造的合成膜小泡(s-MV)的开发和表征。一般而言，观察发现大多数重组多肽融合与ClyA共定位在细菌细胞表面上以及定位在OMV中。准确地讲，我们的研究表明，Bla、OPH、GFP和抗地高辛scFv与ClyA的C端直接融合导致各个蛋白质功能性地展示在大肠杆菌细胞及其衍生的OMV的表面上，产生具有十分广泛的非天然功能(例如荧光、抗原结合)的s-MV。有趣的是，这些蛋白质的每一种与ClyA N端的融合都产生无法预测的结果。例如，scFv.Dig-ClyA没有可检测的细胞或OMV表面活性，而GFP-ClyA则导致活性蛋白展示。在后一种情况下，即使一部分融合是有活性的，但是大量的无荧光GFP-ClyA积累在OMV中。研究还发现，当每种酶Bla和OPH与ClyA的N端融合时，酶Bla和OPH的融合对细胞和OMV都几乎没有活性，甚至无活性。这些结果与早期研究一致，早期研究发现，ClyA-Bla相对于Bla-ClyA向胞外培养基的分泌增加2倍(del Castillo等，“Secretion of the Escherichia coli K-12 SheA Hemolysinis Independent of its Cytolytic Activity(大肠杆菌K-12 SheA溶血素的分泌与其细胞溶解活性无关)”,FEMS Microbiol Lett 204:281-5(2001)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。目前尚不清楚为什么与ClyA的N端融合与C端融不一致，C端融总是产生展示良好并保持其生物功能的蛋白质。可以观察中等分辨率的膜结合ClyA的结构来解释这些结果，该结构显示比起N端部分，ClyA的C端较深地嵌入膜内(即距外表面较近)，这就接近外膜的周质侧(Eifler等，“Cytotoxin ClyA from Escherichia coli Assembles to a 13-meric Pore Independent of its Redox-State(大肠杆菌的细胞毒素ClyA装配成不依赖于其氧化还原状态的13聚体的小孔)”,EMBO J 25:2652-61(2006)和Tzokov等，“Structureof the Hemolysin E(HlyE,ClyA,SheA)channel in its Membrane-Bound Form(溶血素E(HlyE、ClyA、SheA)通道在其膜结合形式中的结构)”,J Biol Chem 281:23042-9(2006)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。按照这个模型，与ClyA的C端融合较接近外表面，并更可能延伸到胞外环境，尤其是加入所有融合都包括的柔性5-残基Gly接头。
根据ClyA作为融合配偶体的相对可塑性，ClyA可用作以下有益的系留模件(tethering module)：(1)解析由细菌至靶宿主细胞完整的ClyA易位途径；以及(2)依赖于细胞或OMV表面展示的生物技术应用，例如抗体片段的亲和力成熟和疫苗佐剂开发(Daugherty等，“Quantitative Analysis of the Effect of the Mutation Frequencyon the Affinity Maturation of Single Chain Fv antibodies(突变频率对单链Fv抗体亲和力成熟的作用的定量分析)”,Proc Natl Acad Sci U S A 97:2029-34(2000)；Francisco等，“Production and Fluorescence-Activated Cell Sorting ofEscherichia coli Expressing a Functional Antibody Fragment on the ExternalSurface(在外表面表达功能性抗体片段的大肠杆菌的产生和荧光激活细胞分选法)”,ProcNatl Acad Sci U S A 90:10444-8(1993)；Chen等，“Cell-Surface Display ofHeterologous Proteins:From High-Throughput Screening to EnvironmentalApplications(异源蛋白的细胞表面展示：从高通量筛选到环境应用)”,BiotechnolBioeng 79:496-503(2002)；以及Georgiou等，“Display of Heterologous Proteins onthe Surface of Microorganisms:From the Screening of Combinatorial Librariesto Live Recombinant Vaccines(微生物表面上异源蛋白的展示：从筛选综合文库到活的重组疫苗)”,Nat Biotechnol 15:29-34(1997)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。例如，至于遗传分析，ClyA-GFP和ClyA-scFv.Dig两者的表达被证实能够报告ClyA定位于细菌细胞表面和定位在OMV中，且揭示了DsbA在易位过程中必不可少的作用。Uhlin及同事提出并受有关研究结果支持的小泡中ClyA装配的简单模型，是ClyA寡聚化和膜插入受ClyA的氧化还原态控制(Wai等，“Vesicle-mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers of the Enterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。然而，本发明的研究显示在周质中便产生较为还原性的环境，例如当DsbA不存在时，有利于ClyA和ClyA融合定位到小泡内。虽然DsbA的参与似乎是通过ClyA的直接氧化(Wai等，“Vesicle-mediated Export and Assembly of Pore-Forming Oligomers ofthe Enterobacterial ClyA Cytotoxin(小泡介导的肠细菌ClyA细胞毒素成孔寡聚体的输出与装配)”,Cell 115:25-35(2003)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，但是不能排除DsbA可能负责氧化介导ClyA定位和/或OMV形成的周质或膜组分。
就生物技术而言，ClyA在细菌细胞和小泡表面锚定和功能性地展示各种不同的原核蛋白和真核蛋白的能力可用于多项应用。首先，ClyA具有使其成为肽和蛋白质在细菌细胞表面展示的理想载体蛋白的性质，比被广泛接受的Lpp-OmpA表面锚有利，正如通过scFv结合的荧光标记的地高辛所证实的一样。其次，通过审慎地选择并在OMV展示的特异性scFv片段，能够将这些工程改造的“免疫-MV”重新定位于特定的细胞类型，或者对宿主-小泡相互作用进行工程改造以便达到所需要的治疗反应或免疫应答。按照这些方向，这些数据为工程改造小泡保持其特有的与哺乳动物细胞相互作用提供了令人鼓舞的数据(Kesty等，“Enterotoxigenic Escherichia coli Vesicles Target Toxin Delivery intoMammalian Cells(递送至哺乳动物细胞的肠产毒性大肠杆菌小泡靶毒素)”,EMBO J 23:4538-49(2004)和Kesty等，“Incorporation ofHeterologous Outer Membrane andPeriplasmic Proteinsinto Escherichia coli Outer Membrane Vesicles(大肠杆菌外膜小泡中异源外膜蛋白和周质蛋白的掺入)”,J Biol Chem 279:2069-76(2004)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，并且几乎完全无细胞毒性。另值得注意的是，本研究中所有ClyA融合的表达相对于表达未融合ClyA的细胞或空载体对照，对细菌细胞的生长率没有可测量的作用，因此对于任何基于OMV的应用都可获得相当可观的细胞或其衍生的OMV收率。
实施例18–质粒构建
用C端6x-组氨酸标签构建ClyA、GFP和ClyA-GFP的质粒以促进蛋白质产物的纯化。编码与6x-组氨酸标签5’端融合的大肠杆菌基因clyA的质粒pClyA-His6，以及编码与gfp-mut2(26)5’端融合的clyA的pClyA-GFP见上述实施例1。为了构建pClyA-GFP-His6，用质粒pClyA-GFP作为模板，使用引物(5’-TCGCAACTCTCTACTGTTTC-3’)(SEQ ID NO：13)和(5’-GCGATGAAGCTTTTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTATAGTTCATCCATGCC-3’)(SEQ ID NO：14)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增约1.7kb片段。将所得产物克隆到pBAD18-Cm的XbaI和HindIII位点(Guzman等，“通过含有阿拉伯糖PBAD启动子的载体进行紧密调节、调理和高水平表达”,JBacteriol 177:4121-4130(1995)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。对于构建pGFP-His6，用质粒pClyA-GFP作为模板，使用引物(5’-GCGATGGAATTCGAGCTCTTAAAGAGGAGAAAGGTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT-3’)(SEQ ID NO：15)和(5’-GCGATGAAGCTTTTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTATAGTTCATCCATGCC-3’)(SEQ ID NO：16)，通过PCR对约700bp片段进行扩增。利用SacI和HindIII限制位点，将扩增产物克隆到pBAD18-Cm中。DNA构建体经自动化双脱氧链终止测序法得到证实。质粒被转化进入大肠杆菌DH5α，在含有氯霉素的LB培养基中筛选。
实施例19-重组蛋白纯化
将大肠杆菌DH5α培养物在100mL含有氯霉素的LB培养基中生长。一旦OD600达到0.5左右，便加入L-阿拉伯糖至终浓度0.2％来诱导蛋白质表达。诱导后4小时收获细菌培养物，按照生产商说明书，通过固定化金属亲和层析法(Ni-NTA琼脂糖，Qiagen)，来纯化多聚组氨酸标记的蛋白质。用200mM咪唑的缓冲液(含有50mMNaH2PO4、300mM NaCl，pH 8.0)将蛋白质从亲和树脂中洗脱出来，随后使用PD-10大小排阻层析柱(Amersham Biosciences)脱盐进入磷酸缓冲盐溶液。
实施例20-外膜小泡的制备
按照之前已确立的方法纯化外膜小泡(Kolling，GL等，“Export of VirulenceGenes and Shiga Toxin by Membrane Vesicles of Escherichia coli O157:H7(通过大肠杆菌O157：H7的膜小泡输出毒力基因和志贺菌毒素)”,Appl Environ Microbiol 65:1843-1848(1999)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。将质粒pClyA-GFP-His6和pBAD18-Cm转化到过量产生大肠杆菌小泡的菌株JC8031中(Bernadac，A等，“Escherichiacoli tol-pal Mutants Form Outer Membrane Vesicles(大肠杆菌tol-pal突变型形成外膜小泡)”,J Bacteriol 180:4872-4878(1998)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，在LB-氯霉素培养基筛选。把过夜培养物接种到装有250mL培养基的培养瓶中，使之生长直到OD600达到0.5左右为止。加入L-阿拉伯糖至终浓度0.2％来诱导蛋白质表达。诱导后12小时收集不含细胞的培养物上清液，经0.45μm真空滤器过滤。小泡用超速离心(Beckman-Coulter Ti SW28转子，141,000g，3小时，4℃)分离，并重新悬浮于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。
实施例21-蛋白质分析
用牛血清白蛋白作为蛋白质标准，通过联辛可宁酸(bicinchoninic acid)测定法(BCA Protein Assay，Pierce)定量测定OMV和纯化的重组蛋白制备物中的蛋白质浓度。在微量培养板荧光分光光度计(Gemini EM，分子Devices)中，分别采用481nm和507nm的激发波长和发射波长，测定了蛋白质或OMV样品中GFP的荧光活性(Cormack，BP等，“FACS-Optimized Mutants of the Green Fluorescent Protein(GFP)(FACS优化的绿色荧光蛋白(GFP)突变体)”,Gene 173:33-38(1996)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。对于SDS-PAGE，样品在含有β-巯基乙醇的样品加样缓冲液中制备，在100℃下加热5分钟后在10％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。将蛋白质转移到聚偏二氯乙烯(polyvinylidinedifluoride)膜用于蛋白质印迹分析，并用单克隆小鼠抗GFP IgG(Invitrogen，1:2,000)或单克隆小鼠抗多聚组氨酸IgG(1:3000，Sigma)第一抗体及辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(1:10,000，Jackson Immunoresearch)第二抗体探查。用ECL检测试剂(Pierce)通过放射自显影使膜显影。
实施例22-液体溶血测定法
通过采纳自Rowe和Welch的液体溶血测定法(Rowe等，“Assays of HemolyticToxins(溶血毒素测定法)”Methods Enzymol 235:657-667(1994)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，测定了ClyA和ClyA-GFP的溶血活性。绵羊红细胞(Becton Dickinson)经洗涤后，以1:100稀释于PBS中。将经洗涤的等分红细胞转移到微量离心管中，在1mL最终体积的PBS中，将ClyA或ClyA-GFP加到合适的浓度。轻轻旋转的同时，使样品在37℃下孵育30分钟。细胞和碎片在微量离心机(4,000rcf，1.5分钟)中沉淀，在540nm波长下通过分光光度检测，定量测定上清液中释放出的血红蛋白。溶血活性用相对于去离子水37℃下溶解30分钟的红细胞(被视为100％溶解)报告。
实施例23-动态光散射
用Nanosizer Nano ZS(Malvern Instruments)进行了动态光散射测量，应用Dispersion Technology软件4.20版用于数据采集和分析。OMV样品在1mL PBS中含有60ug/mL总蛋白。水的折射率和粘度用作参数输入。
实施例24-显微镜
对于负染色电子显微镜术，小泡在400目Formar/碳包被的铜栅极上用2％乙酸双氧铀染色，在FEI Tecnai F20透射电子显微镜下进行观察。对于荧光显微镜检术，将小泡置于玻璃载玻片上，用盖玻片密封，用带有GFP滤光片组的Olympus BX41显微镜观察。
实施例25-脂多糖检测
通过按照之前所述的比色测定法，通过测定2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)的存在来确定细菌脂多糖(LPS)浓度(Karkhanis等，“New and Improved Microassay to Determine 2-Keto-3-Deoxyoctonate in Lipopolysaccharide of Gram-Negative Bacteria(测定革兰氏阴性菌脂多糖的2-酮基-3-脱氧辛酸的新改进的微量测定法)”,Anal Biochem 85:595-601(1978)和Herlax等，“Role of Lipopolysaccharide on the Structure and Functionof alpha-Hemolysin from Escherichia coli(脂多糖对大肠杆菌α-溶血素的结构和功能的作用)”,Chem Phys Lipids 135:107-115(2005)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。KDO与每分子含有两个反应性KDO部分的大肠杆菌LPS一起构成细菌PS分子的寡糖核心的一部分(Lee等，“Quantification of Bacterial Lipopolysaccharides by thePurpald Assay:Measuring Formaldehyde Generated from 2-keto-3-deoxyoctonateand Heptose at the Inner Core by Periodate Oxidation(用Purpald测定法定量测定细菌脂多糖：在内核通过高碘酸盐氧化作用测量由2-酮基-3-脱氧辛酸和庚糖产生的甲醛)”,Anal Biochem 267:161-168(1999)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。将OMV样品(45μL)的PBS溶液与0.2NH2SO4(5μL)混合，在100℃下加热20分钟。使样品冷却到室温5分钟，然后将25μL 0.04M NaIO4加到混合物中。在室温下孵育20分钟后，将2％NaAsO2(65μL)加到样品管中，涡旋直到特有的黄色消失为止。加入硫代巴比妥酸(0.3％，250μL)，把样品放回到沸水浴中10分钟，接着立即加入二甲亚砜(125μL)。使样品冷却至室温达5分钟，在微量培养板分光光度计中以550nm测量吸光度。由KDO铵盐(Sigma-Aldrich)制备校准标准液。
实施例26-免疫
每组5只共6组BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)，用100μL含有纯化的蛋白质或如上所述的OMV制备物的PBS溶液各进行皮下免疫。6个治疗组进行如下免疫：2.5μg GFP(I组)；2.5μg ClyA(II组)；5μg ClyA-GFP(III组)；2.5μg ClyA与2.5μg GFP混合(IV组)；2.5μg ClyA-GFP与空OMV混合(V组)；以及相当于2.5μg ClyA-GFP的重组OMV(VI组)。相隔4周给予2剂疫苗。第一次临免疫前或第一次免疫后2周、临加强剂量之前，以及之后以每周一次的间隔从下颌窦(mandibular sinus)采血。用于这些动物研究的方法获康奈尔大学学会动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee atCornell University)批准。
实施例27-酶联免疫吸附测定(ELISA)
GFP反应性抗体通过间接ELISA测定。聚苯乙烯微量滴定96孔板(Maxisorp，NuncNalgene)用GFP(5μg/mL的碳酸盐缓冲液，pH 9.6)包被后，在4℃下孵育过夜。板用3％无脂奶粉(Bio-Rad)的PBS封闭，PBS中含有0.05％吐温20(PBST)。样品用封闭缓冲液连续稀释2倍，以1:200-1:204,800的范围加到各孔中，在加湿箱内于37℃孵育1.5小时。板用PBST洗涤6次，然后将辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(1:5,000，Jackson Immunoresearch)加到孔中，在37℃下达1小时。再用PBST洗涤6次后，加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物(1-Step Turbo TMB，Pierce)，进行酶反应达20分钟。用2M H2SO4终止反应。在微量培养板分光光度计中以450nm的波长测定吸光度。用非参数Wilcoxan秩和检验求出治疗组间的统计显著性，其中p<0.05视为显著。
实施例28-模型抗原GFP与ClyA融合导致保持其组分天然活性的61kDa嵌合蛋白进行表达
为了证实ClyA、GFP和ClyA-GFP的表达，通过固定化金属亲和层析法从大肠杆菌培养物中纯化蛋白质，并用抗多聚组氨酸抗体通过蛋白质印迹法进行观察。图8A显示蛋白质条带，27kDa相当于GFP，34kDa相当于ClyA，61kDa相当于ClyA-GFP的预计分子量。还对ClyA-GFP融合的组成蛋白特有的溶血活性和荧光活性进行了进一步的观察。图8B显示绵羊红细胞的溶血程度随ClyA和ClyA-GFP两者浓度的增加而增加，其中在所有测试浓度下，ClyA-GFP的溶血活性比天然ClyA的低。同样，ClyA-GFP的荧光强度测量值显示荧光强度随浓度增加而增加，但是相对于游离GFP则降低(图8C)。总之，这些数据表明当两种蛋白质融合起来作为ClyA-GFP时，ClyA和GFP各自保留固有的溶血活性和荧光活性，尽管程度不及游离蛋白，可能是由于蛋白质接近所致。
实施例29-ClyA-GFP分泌到大肠杆菌培养物胞外培养基的外膜小泡中
由高产小泡的大肠杆菌菌株JC8031制备外膜小泡，JC8031用质粒pClyA-GFP-His6(重组OMV)或空pBAD18-Cm克隆载体(空OMV)转化。电子显微镜术显示，OMV的球形双分子层结构(图9A)的直径约为100nm。观察到ClyA-GFP荧光与重组OMV缔合(图9B)，通过用抗GFP抗体进行的蛋白质印迹法证实了这个发现(图9C)。荧光强度测量值和SDS-PAGE凝胶条带光密度测定表明，ClyA-GFP占OMV中蛋白质总含量约5％。因为大肠杆菌中clyA的表达在正常实验室条件下受到极大限制(Westermark等，“Silencing and Activation of ClyACytotoxin Expression in in Escherichia coli(大肠杆菌中ClyA细胞毒素表达的沉默与激活)”,J Bacteriol 182:6347-6357(2000)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，所以在重组外膜小泡或空外膜小泡中未检测到游离的ClyA。与早期发现一致(Kim等，“Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles with Enhanced Functionality(经工程改造功能得到提高的细菌外膜小泡)”,J Mol Biol，待发表：doi:10.1016/j.jmb.2008.1003.1076(2008)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，ClyA-GFP重组OMV的缔合对小泡的平均直径没有明显作用(图9D)。通过检测LPS的核心糖组分2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)的比色测定法，测定了空OMV和重组OMV中的细菌脂多糖(LPS)含量。KDO测定法表明比起空OMV，重组OMV含有略微较高的LPS浓度，该浓度用蛋白质总含量归一化(图9E)。
实施例30-当给予与ClyA的融合给予时小鼠中GFP的免疫原性显著提高
使绿色荧光蛋白(GFP)模型弱抗原与ClyA的C端融合，以研究在免疫小鼠中ClyA-抗原融合的免疫刺激作用。BALB/c小鼠用ClyA-GFP进行皮下免疫诱导GFP反应性抗体应答，所述应答比用ClyA与GFP混合免疫的应答显著较高(图10)。用ClyA-GFP免疫的小鼠中，初免后两周检测到GFP特异性IgG应答；经给予加强免疫后这种应答增强，在加强免疫之后保持长达4周。在任何其它治疗组中，直到加强免疫后才观察到可检测的抗GFP IgG抗体。有趣的是，在研究期间的任何时间，用GFP免疫几乎不诱导甚至不诱导可检测应答，而在只用ClyA免疫的2只小鼠在加强免疫之后，引发GFP交叉反应抗体类水平的波动。从本研究的第14天开始，ClyA-GFP免疫组(III组)中的抗体效价比未融合蛋白组分治疗组(IV组)的抗体效价显著较高(p<0.05)，并直到整个研究结束时一直保持显著较高的水平。在整个研究所有时间内，分别用ClyA和GFP免疫的治疗组(IV组)的GFP交叉反应抗体水平与只用ClyA免疫(II组)所产生的抗体水平有统计相似性。
实施例31-小鼠中OMV疫苗剂型中的ClyA-GFP保持其免疫原性而避免密集的蛋白质纯化过程
为了测定从完整大肠杆菌细胞中以外膜小泡形式分泌的ClyA-GFP的免疫原性，BALB/c小鼠用与ClyA-GFP混合的空的OMV或用含有ClyA-GFP融合的重组外膜小泡免疫(图11)。OMV剂型中ClyA-GFP的有效剂量(2.5μg)是用于纯化的蛋白质免疫量的一半，以试图观察与OMV缔合是否有助于额外的免疫刺激作用。在初免后2周开始，用与纯ClyA-GFP混合的空OMV免疫(V组)产生GFP特异性应答，在加强免疫之后持续4周。在初始剂量后2周开始，用ClyA-GFP重组OMV皮下免疫(IV组)诱导同样的GFP反应性IgG应答，然后在加强免疫后第28天显著增强。在整个研究的所有时间点上，V组和VI组的抗体效价保持统计等同性。此外，OMV免疫小鼠(V组和VI组)中的效价与III组中的效价在统计上等价，V组第56天和VI组第35天为例外，此时III组的效价显著较高(p<0.05)。
实施例18–31的讨论
疫苗依然是用于预防传染性疾病的最有成本效益的策略之一(Levine等，“NewGeneration Vaccines,3rd Edition(新一代的疫苗，第三版)”，出版(Marcel Dekker，Inc.，New York)(2004)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。蛋白质亚单位疫苗对整个生物的安全性使之对于给予各种人群，不论健康个体和免疫减弱个体，同样都特别具有吸引力。然而，进一步开发亚单位疫苗中的主要限制因素依然是纯抗原单用时免疫原性差。尽管在佐剂研究中取得进展，但是目前在北美获准用于人的唯一化合物依然是可能引起炎症反应或变态反应的铝盐(Gupta RK，“Aluminum Compounds as Vaccine Adjuvants(作为疫苗佐剂的铝化合物)”,Adv Drug DeliveryRev 32:155-172(1998)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。尽管已经出现作为有前景的抗原递送策略的微粒抗原递送系统，但是在大规模制造水平上用颗粒加载或吸附纯抗原的额外步骤使得这些系统的费用令人无法承担，这是尤其与有关用于发展中国家流行疾病的疫苗时要考虑的问题。
主要因为OMV的大小、可塑性和在人体中具有安全性质，所以OMV是用于疫苗递送的颇有吸引力的载体。在证明OMV显著可协调性的过程中，与天然细菌蛋白ClyA融合的异源蛋白以其天然功能形式有效地转运到小泡中(Kim等，“Engineered Bacterial OuterMembrane Vesicles with Enhanced Functionality(经工程改造功能得到提高的细菌外膜小泡)”,J Mol Biol，待发表：doi:10.1016/j.jmb.2008.1003.1076(2008)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。之前的研究还表明当从活的减毒沙门氏菌载体分泌出外源抗原时，ClyA在提高其免疫原性中的用途，这说明了抗原可由OMV中的活载体输出的可能性(Galen等，“Adaptation of the Endogenous Salmonella enterica serovar TyphiClyA-Encoded Hemolysin for Antigen Export Enhances the Immunogenicity ofAnthrax Protective Antigen Domain 4Expressed by the Attenuated Live-VectorVaccine Strain CVD 908-htrA(抗原输出的内源性肠沙门氏菌伤寒血清变型ClyA编码的溶血素的修饰提高由活的减毒载体疫苗菌株CVD 908-htrA表达的炭疽保护性抗原第四结构域的免疫原性)”,Infect Immun 72:7096-7106(2004)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。
本研究证实重组OMV是免疫原性不佳蛋白的强效佐剂和载体系统。准确地讲，含有与模型绿色荧光蛋白(GFP)外源抗原融合的ClyA的重组OMV疫苗在免疫小鼠中诱导强的GFP特异性体液应答。这些结果提出了重组OMV疫苗作为可能递送免疫原性不佳蛋白给宿主的多用途策略。OMV的一个重要特征是可用简单的超速离心进行分离，实际上省去了与其它微粒递送系统和传统蛋白质亚单位疫苗有关的昂贵的纯化或配制过程。
为促使ClyA新的分泌作用方式发生改变，通过使GFP与ClyA的C端融合来构建含有模型GFP抗原的重组OMV疫苗。与之前所观察的结果一致(Kim等，“Engineered BacterialOuter Membrane Vesicles with Enhanced Functionality(经工程改造功能得到提高的细菌外膜小泡)”,J Mol Biol，待发表：doi:10.1016/j.jmb.2008.1003.1076(2008)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，由大肠杆菌培养物纯化出的经工程改造的ClyA-GFP融合蛋白形成61kDa产物(图8A)。进行了功能性实验以证实融合中的ClyA-GFP保持ClyA以及GFP的天然生物活性。ClyA-GFP特有的荧光活性和溶血活性在规定实验条件下相对于未融合组成蛋白质减弱(图8B和图8C)，这与之前用其它ClyA融合配偶体所做实验的观察结果类似(del Castillo等，“Secretion of the Escherichia coli K-12 SheA Hemolysin isIndependent of its Cytolytic Activity(大肠杆菌K-12 SheA溶血素的分泌与其细胞溶解活性无关)”,FEMS Microbiol Lett 204:281-285(2001)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。这种蛋白质活性的保留表明，与ClyA融合的蛋白质保持其构象不变，并且表明ClyA可以是能够接纳线性表位和构象性抗原的载体。
由非致病大肠杆菌纯化出重组OMV，并研究了ClyA-GFP和LPS的存在(图9A)。用抗GFP抗体的蛋白质印迹法证实OMV中存在ClyA-GFP；通过自动分泌使活性融合蛋白包封在小泡内，因此不需要之前的抗原纯化，这与其它微粒递送系统不同。令人感兴趣的是，重组OMV含有的LPS水平比空小泡的高(当用蛋白质含量归一化时)。因为在疫苗中LPS可能起反作用，所以未来的研究可能需要从小泡中排除LPS，正如之前披露的脑膜炎疫苗的情况一样(Claassen等，“Production,Characterization and Control of a Neisseriameningitidis Hexavalent Class 1Outer Membrane Protein Vontaining VesicleVaccine(含有脑膜炎奈瑟氏菌六价1类外膜蛋白的小泡疫苗的生产、表征和控制)”,Vaccine 14:1001-1008(1996)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。
图10中的结果显示用纯化的蛋白质免疫的小鼠中的抗体效价，表明了ClyA是提高GFP在小鼠中的免疫原性的有效载体蛋白。ClyA融合蛋白的免疫原性最早披露于Galen等人的研究中(Galen等，“Adaptation of the Endogenous Salmonella enterica serovarTyphi ClyA-Encoded Hemolysin for Antigen Export Enhances the Immunogenicityof Anthrax Protective Antigen Domain 4 Expressed by the Attenuated Live-Vector Vaccine Strain CVD 908-htrA(抗原输出的内源性肠沙门氏菌伤寒血清变型ClyA编码的溶血素的修饰提高由活的减毒载体疫苗菌株CVD 908-htrA表达的炭疽保护性抗原第四结构域的免疫原性)”,Infect Immun 72:7096-7106(2004)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，其中观察到对抗原的免疫应答增强被假定是主要依赖于从活沙门氏菌载体的输出。本文的结果表明，与ClyA的抗原融合直接负责提高免疫原性。作为肠细菌源的细菌细胞溶解蛋白(Eifler等，“Cytotoxin ClyA from Escherichia coli Assembles to a13-meric Pore Independent of its Redox-State(大肠杆菌的细胞毒素ClyA装配成不依赖于其氧化还原状态的13聚体的小孔)”,Embo Journal 25:2652-2661(2006)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)，ClyA使多种其它已知毒素与佐剂性质联系起来，例如白喉毒素或热不稳定肠毒素(Lavelle等，“Vaccine Adjuvants:Immunological and ClinicalPrinciples(疫苗佐剂：免疫学原理与临床原理)”,主编Hackett CJ和Harn DA(HumanaPress，Totowa，New Jersey)，第111-154页(2006)，该文献通过引用以其整体结合到本文中)。本研究中，虽然在用ClyA免疫的小鼠中未观察到病理作用，但是ClyA通过突变、截短或化学方法解毒可减弱任何可能的毒性而同时保持其免疫调节能力。
然而，与其它已知细菌毒素佐剂不同，小鼠用未融合ClyA和GFP的混合物免疫时，没有观察到GFP免疫应答的提高。虽然尚不了解驱动ClyA免疫刺激作用方式的特定机制，但是与蛋白质载体的物理结合或化学结合常常通过增加抗原大小或改进抗原组构以使B细胞应答最优化，从而改进免疫原性不佳的抗原的免疫原性(Wu等，“Sustained High-TiterAntibody Responses Induced by Conjugating a Malarial Vaccine Candidate toOuter-Membrane Protein Complex(通过使候选疟疾疫苗与外膜蛋白络合物缀合诱导持久的高效价抗体应答)”,Proc Nat Acad Sci USA 103:18243-18248(2006)；Koser等，“Rabies Virus Nucleoprotein as a Carrier for Foreign Antigens(用作外源抗原载体的狂犬病病毒核蛋白)”,Proc Nat Acad Sci USA 101:9405-9410(2004)；以及Bachmann等，“The Influence of Antigen Organization on B-Cell Responsiveness(抗原组构对B细胞应答性的影响)”,Science 262:1448-1451(1993)，所述文献通过引用以其整体结合到本文中)。一般而言，适当结构中抗原呈现的激活B细胞增殖的能力需要通过抗原呈递细胞进行有效抗原加工和T细胞的共刺激。需要对ClyA及其与免疫系统的相互作用作进一步研究以充分表征ClyA的免疫增强活性。
为了研究当以OMV递送时对于ClyA-GFP的体液免疫应答，用与纯化的ClyA-GFP混合的空OMV(V组)，或者用含有ClyA-GFP的重组OMV剂型(图11，VI组)给小鼠免疫。结果显示小泡中保持ClyA-GFP的免疫刺激作用。比起对于纯化的ClyA-GFP的应答，对于重组OMV的抗体应答的动力学似乎略慢。在研究的第35天，重组OMV组(图11，VI组)中的抗GFP效价低于用ClyA-GFP免疫的组(图10，III组)，然而这两个治疗组的效价自第42天开始在统计上是彼此相等的。尤其当考虑到OMV剂型中ClyA-GFP融合的有效剂量为纯化的蛋白质治疗的一半时，重组OMV的这些结果显得十分显著。虽然剂量减少可能是用重组OMV免疫小鼠中ClyA-GFP延时应答超过用纯蛋白质免疫小鼠的因素，但是也可能是OMV提供了额外的免疫刺激活性。
空OMV和重组OMV治疗(图11)之间的比较表明，抗GFP效价在很大程度上同ClyA-GFP与OMV的直接缔合无关。然而，存在这样的可能性，即纯ClyA-GFP与空OMV的非特异性缔合可使免疫系统实际上无法分辨两个OMV群。然而，ClyA-GFP与小泡的缔合的确导致更长时间的抗体应答。在第56天，V组(空OMV与ClyA-GFP)的抗体效价相对于III组(纯化的ClyA-GFP)呈统计显著性的降低，而重组OMV治疗组的效价则不出现这类降低。与其它微粒递送系统类似，包封在OMV内的抗原可保护抗原在体内不受蛋白酶降解，这使得B细胞的活化更长久。
重组OMV是独特的具有佐剂和载体活性的微粒疫苗递送载体，将借助自合成的抗原递送系统和活的抗原递送系统的特征结合起来。这些小泡是非复制性实体，能够避免与减毒的活细菌有关的潜在安全隐忧。因为纳米尺度球形结构主要包含蛋白质和脂质，所以OMV可与脂质体或蛋白体载体共有某些结构或组成相似性，但是却不需要大量的配制工作。重组OMV不需要之前对抗原进行纯化，或许是与微粒系统或传统亚单位疫苗的最大不同。将ClyA-抗原融合转运到OMV内而同时保持生物活性的固有能力，省去了昂贵以及常常出现问题的蛋白质纯化操作。这些在加工和功能性上的优势，连同进一步改造腔特征或表面小泡特征的其它可能性一起，表明对于针对传染性疾病的疫苗，OMV是独特的递送免疫原性不佳抗原的可调平台。
由于出现新的疾病威胁，以及人道主义需要变得更加迫切，注意力持续集中在开发能安全诱导对在全球范围内引发衰弱性疾病的病原体具有保护性免疫应答的疫苗。本研究表明重组OMV技术在突破通常发生在疫苗开发中的重大安全和经济局限性的潜力。与细菌溶血素ClyA融合的模型绿色荧光蛋白在外膜小泡中分泌而同时保持了两个组分的生物活性。将这些重组OMV给予小鼠后发现具有高免疫原性，诱导针对GFP的高效价，而只用GFP免疫则不诱导任何显著的体液应答。通过将佐剂和载体活性联合起来，重组OMV提高了对免疫原性不佳的抗原的应答，并避免了传统亚单位疫苗和微粒抗原递送方式中蛋白质的纯化需要。
尽管本文详细描述和披露了优选的本发明实施方案，但是在不偏离本发明的精神的情况下，各种修饰、添加、取代等对于相关领域技术人员而言是显而易见的，因此这些都被视为属于随附本发明实施方案书中所限定的本发明范围。

Claims (14)

1.一种展示/包含ClyA融合蛋白的细胞或细胞小泡在制备用于在哺乳动物体内诱导免疫应答的疫苗中的用途，所述ClyA融合蛋白包含ClyA蛋白的至少一部分和第二蛋白的至少一部分，其中所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含能够在哺乳动物体内诱导免疫应答的抗原性蛋白或肽，其中所述细胞以及所述细胞小泡表达DsbA。
2.权利要求1的用途，其中所述抗原性蛋白或肽是来源于以下的蛋白或肽：致病性细菌生物、真菌生物、病毒生物、癌细胞及它们的组合。
3.权利要求1的用途，其中所述抗原性蛋白或肽是来源于以下的蛋白或肽：性传播疾病病原体、病毒性脑炎病原体、原生动物疾病病原体、真菌性疾病病原体、细菌性疾病病原体及它们的组合。
4.权利要求1的用途，其中所述抗原性蛋白或肽是来源于以下的蛋白或肽：链球菌(Streptococcus species)、念珠菌(Candida species)、布鲁氏菌(Brucella species)、沙门氏菌(Salmonella species)、志贺氏菌(Shigella species)、假单胞菌(Pseudomonasspecies)、鲍特氏菌(Bordetella species)、梭菌(Clostridium species)、诺沃克病毒(Norwalk virus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、人免疫缺陷病毒(HIV)、衣原体(Chlamydia species)、人乳头瘤病毒、流感病毒、副黏病毒(Paramyxovirus species)、疱疹病毒(Herpes virus)、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、埃巴病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒、疟原虫(Plasmodium species)、毛滴虫(Trichomonas species)及它们的组合。
5.一种细胞或细胞小泡在制备药物或疫苗中的用途，其中所述细胞为产生小泡并且展示ClyA融合蛋白的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述ClyA融合蛋白包含ClyA蛋白的至少一个片段和与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白的至少一个片段；且所述细胞小泡产生自所述革兰氏阴性细菌细胞；其中所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含能够在哺乳动物体内诱导免疫应答的抗原性蛋白或肽，其中所述细胞小泡表达DsbA。
6.一种表达DsbA并且展示ClyA融合蛋白的小泡，其中所述融合蛋白包含ClyA蛋白的至少一部分和与所述ClyA蛋白偶联的第二蛋白的至少一部分。
7.一种筛选候选化合物文库以鉴定结合靶蛋白的化合物的方法，所述方法包括：
提供待筛选的候选化合物文库；
提供展示ClyA融合蛋白的细胞或细胞小泡，所述ClyA融合蛋白包含ClyA蛋白的至少一部分和第二蛋白的至少一部分，其中所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含靶蛋白，其中所述细胞以及所述细胞小泡表达DsbA；
在有效使候选化合物与靶蛋白结合的条件下，使候选化合物文库与展示靶蛋白的细胞或小泡接触；和
鉴定结合靶蛋白的化合物。
8.一种药物或疫苗递送载体，所述载体包含表达DsbA并且展示ClyA融合蛋白的小泡，所述ClyA融合蛋白包含ClyA蛋白的至少一部分和第二蛋白的至少一部分。
9.权利要求8的递送载体，其中所述小泡含有待递送的药物或疫苗，且其中所述ClyA融合蛋白的第二蛋白包含寻靶蛋白。
10.权利要求9的递送载体，其中所述寻靶蛋白是细胞特异性配体结合蛋白或抗原性蛋白或肽。
11.权利要求9的递送载体，其中所述小泡含有待递送的核酸、蛋白或小分子。
12.权利要求11的递送载体，其中所述小泡含有RNAi分子。
13.权利要求8的递送载体，其中所述在小泡上展示的ClyA融合蛋白的第二蛋白是抗原性蛋白或肽。
14.权利要求13的递送载体，其中所述在小泡表面上展示的ClyA融合蛋白的第二蛋白是疫苗亚单位蛋白。
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