CN105911290B - 应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法 - Google Patents

应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105911290B
CN105911290B CN201610236084.8A CN201610236084A CN105911290B CN 105911290 B CN105911290 B CN 105911290B CN 201610236084 A CN201610236084 A CN 201610236084A CN 105911290 B CN105911290 B CN 105911290B
Authority
CN
China
Prior art keywords
butyl ester
pesticide
nematode
expressing quantities
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610236084.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105911290A (zh
Inventor
王云彪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Original Assignee
Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS filed Critical Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority to CN201610236084.8A priority Critical patent/CN105911290B/zh
Publication of CN105911290A publication Critical patent/CN105911290A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105911290B publication Critical patent/CN105911290B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，本发明涉及一种农药滴丁酯的检测方法，它为了解决现有农药滴丁酯的检测方法的检出限较低的问题。鉴定方法：一、配置培养液；二、加入待测液体；三、再接入秀丽隐杆线虫进行培养；四、配置浸泡液；五、冻融后的线虫置于浸泡液中；六、配置反应试剂；七、反应试剂中加入Hsp12.2蛋白抗体和线虫，孵育处理；八、加入荧光标记的二抗染色；九、进行荧光强度检测，完成滴丁酯的检测。本发明通过线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯，可检测出浓度为0.002％的滴丁酯，实现了对可疑农药的高效检测。

Description

应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的 方法
技术领域
本发明涉及一种农药滴丁酯的检测方法。
背景技术
滴丁酯是一种在我国广泛应用的除草剂，主要防除水稻等禾本科作物田中双子叶杂草，莎草及某些恶性杂草。现有农药常用检测方法包括高效液相色谱法、色谱‐质谱联用法、化学分析法等。应用分子生物学方法进行化学品的靶位标识，可提高待测物质的检出限与精确度。线虫对滴丁酯农药反映敏感，应激蛋白Hsp12.2受滴丁酯诱导表达显著。荧光免疫定位化学法(Immunostaining)可选择相应抗体，使用荧光标识，根据荧光表达量换算出蛋白表达量。
发明内容
本发明的目的是要解决现有农药滴丁酯的检测方法的检出限较低的问题，而提供应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法。
本发明应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法按下列步骤实现：
一、将0.3g KH2PO4、0.6g Na2HPO4和0.4～0.6g NaCl溶于100mL去离子水中，得到培养液；
二、将步骤一得到的10mL培养液置于培养皿中，然后加入待测液体，得到待测培养液体；
三、向待测培养液体中接入100～120条秀丽隐杆线虫进行培养，得到接有秀丽隐杆线虫的待测培养液；
四、将0.8gNaCl、0.02g KCl、0.18gNa2HPO4·2H2O和0.01gKH2PO4混合，用蒸馏水定容至100mL，调节体系的pH＝7.0～7.5，再加入10g牛血清蛋白，得到浸泡液；
五、取出步骤三中的秀丽隐杆线虫置于液氮中反复冻融多次，然后放入步骤四的浸泡液中，得到浸泡处理的秀丽隐杆线虫；
六、将2.4g的Tris-Base、8.8g的NaCl和0.5mL的Tween 20混合，然后用去离子水定容至1000mL，得到反应试剂；
七、将0.1g Hsp12.2蛋白抗体加入5mL步骤六的反应试剂中，然后加入浸泡处理的秀丽隐杆线虫，在摇床上摇动孵育处理，得到孵育处理的秀丽隐杆线虫；
八、通过浸泡液清洗孵育处理的秀丽隐杆线虫，然后加入0.1g荧光标记的二抗染色处理，得到染色后的秀丽隐杆线虫；
九、在荧光显微镜下进行荧光强度检测，通过显微分析量化Hsp12.2蛋白表达量，检测待测液体中是否含有农药滴丁酯。
本发明通过线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯，弥补了常规化学分析中检出限较低的不足，本发明对目标检测物特异性高，可检测出浓度为0.002％的滴丁酯，实现了对可疑农药的高效检测。
附图说明
图1为实施例不同滴丁酯浓度诱导下线虫Hsp12.2蛋白表达相对量的柱状图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法按下列步骤实施：
一、将0.3g KH2PO4、0.6g Na2HPO4和0.4～0.6g NaCl溶于100mL去离子水中，得到培养液；
二、将步骤一得到的10mL培养液置于培养皿中，然后加入待测液体，得到待测培养液体；
三、向待测培养液体中接入100～120条秀丽隐杆线虫进行培养，得到接有秀丽隐杆线虫的待测培养液；
四、将0.8gNaCl、0.02g KCl、0.18gNa2HPO4·2H2O和0.01gKH2PO4混合，用蒸馏水定容至100mL，调节体系的pH＝7.0～7.5，再加入10g牛血清蛋白，得到浸泡液；
五、取出步骤三中的秀丽隐杆线虫置于液氮中反复冻融多次，然后放入步骤四的浸泡液中，得到浸泡处理的秀丽隐杆线虫；
六、将2.4g的Tris-Base、8.8g的NaCl和0.5mL的Tween 20混合，然后用去离子水定容至1000mL，得到反应试剂；
七、将0.1g Hsp12.2蛋白抗体加入5mL步骤六的反应试剂中，然后加入浸泡处理的秀丽隐杆线虫，在摇床上摇动孵育处理，得到孵育处理的秀丽隐杆线虫；
八、通过浸泡液清洗孵育处理的秀丽隐杆线虫，然后加入0.1g荧光标记的二抗染色处理，得到染色后的秀丽隐杆线虫；
九、在荧光显微镜下进行荧光强度检测，通过显微分析量化Hsp12.2蛋白表达量，检测待测液体中是否含有农药滴丁酯。
本实施方式步骤八是将孵育处理的线虫置于浸泡液中进行清洗。步骤九通过Hsp12.2蛋白表达量来鉴定待测液体是否含有农药滴丁酯，当蛋白表达量高于正常值15％即表明待测液体中含有滴丁酯，其中正常值是指步骤二的待测液体为纯水时的蛋白表达量。
本实施方式中所使用的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)编号为N2，取自美国线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)。通过线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯特异性高，可检测出浓度为0.002％的滴丁酯，通过荧光免疫定位化学法表征线虫Hsp12.2蛋白表达量可实现食品安全与环境保护要求下农药滴丁酯的高效检测。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中所述培养的时间为3.5～4.5h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤五放入浸泡液中浸泡1～2小时。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤五取出步骤三中的线虫置于液氮中反复冻融3～5次。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤七在摇床上摇动孵育处理1小时。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤八通过浸泡液反复清洗孵育处理的线虫3～5次。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤八加入0.1g荧光标记的二抗染色处理1小时。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是当步骤二所述的待测液体为纯水时，步骤九通过显微分析得到量化Hsp12.2蛋白表达量设为正常值。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤九当通过显微分析量化Hsp12.2蛋白表达量高于正常值时，则鉴定结果为待测培养液体中含有农药滴丁酯。其它步骤及参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是步骤九当通过显微分析量化Hsp12.2蛋白表达量高于正常值15％时，则鉴定结果为待测培养液体中含有农药滴丁酯。其它步骤及参数与具体实施方式九相同。
实施例一：本实施例应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法按下列步骤实现：
一、将0.3g KH2PO4、0.6g Na2HPO4和0.5g NaCl溶于100mL去离子水中，得到培养液；
二、将步骤一得到的10mL培养液置于培养皿中，然后加入100μL含0.002％滴丁酯液体，得到待测培养液体；
三、向待测培养液体中接入100条秀丽隐杆线虫进行培养4h，得到接有秀丽隐杆线虫的待测培养液；
四、将0.8gNaCl、0.02g KCl、0.18gNa2HPO4·2H2O和0.01gKH2PO4混合，用蒸馏水定容至100mL，调节体系的pH＝7.4，再加入10g牛血清蛋白，得到浸泡液；
五、取出步骤三中的秀丽隐杆线虫置于液氮中反复冻融3次，然后放入步骤四的浸泡液中1小时，得到浸泡处理的秀丽隐杆线虫；
六、将2.4g的Tris-Base、8.8g的NaCl和0.5mL的Tween 20混合，然后用去离子水定容至1000mL，得到反应试剂；
七、将0.1g Hsp12.2蛋白抗体加入5mL步骤六的反应试剂中，然后加入浸泡处理的秀丽隐杆线虫，在摇床上摇动孵育处理1小时，得到孵育处理的秀丽隐杆线虫；
八、通过浸泡液反复清洗孵育处理的秀丽隐杆线虫3次，然后加入0.1g荧光标记的二抗染色处理1小时，得到染色后的秀丽隐杆线虫；
九、在zeiss荧光显微镜(Axio Observer A1)下进行荧光强度检测，利用AxioVision LE图像软件显微分析系统量化Hsp12.2蛋白表达量，蛋白表达量高于正常值15％，完成农药滴丁酯的鉴定。
本实施例步骤二所述的含0.002％滴丁酯液体是指质量浓度为0.002％滴丁酯的水溶液。
实施例二：本实施例与实施例一不同的是步骤二加入100μL含0.01％滴丁酯液体。
本实施例步骤九利用AxioVision LE图像软件显微分析系统量化Hsp12.2蛋白表达量，蛋白表达量高于正常值30％。
实施例三：本实施例与实施例一不同的是步骤二加入100μL含0.05％滴丁酯液体。
本实施例步骤九利用AxioVision LE图像软件显微分析系统量化Hsp12.2蛋白表达量，蛋白表达量高于正常值50％。
实施例四：本实施例与实施例一不同的是步骤二加入100μL含0.1％滴丁酯液体。
本实施例步骤九利用AxioVision LE图像软件显微分析系统量化Hsp12.2蛋白表达量，蛋白表达量高于正常值70％。
实施例中所述的正常值是当步骤二中加入100μL纯水，得到的Hsp12.2蛋白表达量。
实施例一至四不同浓度下滴丁酯诱导下线虫Hsp12.2蛋白表达相对量的柱状图如图1所示，图1显示出通过荧光免疫定位化学法表征线虫Hsp12.2的蛋白表达量，实现了对农药滴丁酯的高效检测。

Claims (7)

1.应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于是按下列步骤实现：
一、将0.3g KH2PO4、0.6g Na2HPO4和0.4～0.6g NaCl溶于100mL去离子水中，得到培养液；
二、将步骤一得到的10mL培养液置于培养皿中，然后加入待测液体，得到待测培养液体；
三、向待测培养液体中接入100～120条秀丽隐杆线虫进行培养3.5～4.5h，得到接有秀丽隐杆线虫的待测培养液；
四、将0.8gNaCl、0.02g KCl、0.18gNa2HPO4·2H2O和0.01gKH2PO4混合，用蒸馏水定容至100mL，调节体系的pH＝7.0～7.5，再加入10g牛血清蛋白，得到浸泡液；
五、取出步骤三中的秀丽隐杆线虫置于液氮中反复冻融多次，然后放入步骤四的浸泡液中浸泡1～2小时，得到浸泡处理的秀丽隐杆线虫；
六、将2.4g的Tris-Base、8.8g的NaCl和0.5mL的Tween 20混合，然后用去离子水定容至1000mL，得到反应试剂；
七、将0.1g Hsp12.2蛋白抗体加入5mL步骤六的反应试剂中，然后加入浸泡处理的秀丽隐杆线虫，在摇床上摇动孵育处理，得到孵育处理的秀丽隐杆线虫；
八、通过浸泡液清洗孵育处理的秀丽隐杆线虫，然后加入0.1g荧光标记的二抗染色处理，得到染色后的秀丽隐杆线虫；
九、在荧光显微镜下进行荧光强度检测，通过显微分析量化Hsp12.2蛋白表达量，检测待测液体中是否含有农药滴丁酯。
2.根据权利要求1所述的应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤五取出步骤三中的线虫置于液氮中反复冻融3～5次。
3.根据权利要求1所述的应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤七在摇床上摇动孵育处理1小时。
4.根据权利要求1所述的应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤八通过浸泡液反复清洗孵育处理的线虫3～5次。
5.根据权利要求1所述的应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤八加入0.1g荧光标记的二抗染色处理1小时。
6.根据权利要求1所述的应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于当步骤二所述的待测液体为纯水时，步骤九通过显微分析得到量化Hsp12.2蛋白表达量设为正常值。
7.根据权利要求6所述的应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤九当通过显微分析量化Hsp12.2蛋白表达量高于正常值15％时，则鉴定结果为待测培养液体中含有农药滴丁酯。
CN201610236084.8A 2016-04-15 2016-04-15 应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法 Expired - Fee Related CN105911290B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610236084.8A CN105911290B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610236084.8A CN105911290B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105911290A CN105911290A (zh) 2016-08-31
CN105911290B true CN105911290B (zh) 2018-05-18

Family

ID=56747226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610236084.8A Expired - Fee Related CN105911290B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105911290B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999054436A2 (en) * 1998-04-17 1999-10-28 Exelixis Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids and proteins of c. elegans insulin-like genes and uses thereof
WO2012162260A2 (en) * 2011-05-21 2012-11-29 Kdt, Llc. Transgenic biosensors
CN103076444A (zh) * 2013-01-04 2013-05-01 中国科学院东北地理与农业生态研究所 利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法
CN104977389A (zh) * 2015-06-29 2015-10-14 中国科学院东北地理与农业生态研究所 基于线虫趋避行为的草甘膦农药检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999054436A2 (en) * 1998-04-17 1999-10-28 Exelixis Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids and proteins of c. elegans insulin-like genes and uses thereof
WO2012162260A2 (en) * 2011-05-21 2012-11-29 Kdt, Llc. Transgenic biosensors
CN103076444A (zh) * 2013-01-04 2013-05-01 中国科学院东北地理与农业生态研究所 利用秀丽隐杆线虫鉴定白酒中塑化剂的方法
CN104977389A (zh) * 2015-06-29 2015-10-14 中国科学院东北地理与农业生态研究所 基于线虫趋避行为的草甘膦农药检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Small heat shock proteins (sHSPs) as potential drug targets;Crabbe,M等;《Current Pharmaceutical Biotechnology》;20011003;第2卷(第1期);第77-111页 *
基于线虫Hsp响应的As毒理机制的体内与体外研究;李铸衡;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20141215(第12期);第1-90页 *
秀丽隐杆线虫在毒理学研究中的应用进展;王云彪等;《毒理学杂志》;20131025;第27卷(第5期);第382-386页 *
铅、镉与草甘膦复合对秀丽隐杆线虫的污染胁迫及HSPs响应;邓茗芩;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20150215(第02期);第1-63页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105911290A (zh) 2016-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Moran et al. Microbial metabolites in the marine carbon cycle
Pett-Ridge et al. Using stable isotopes to explore root-microbe-mineral interactions in soil
Purin et al. The arbuscular mycorrhizal fungal protein glomalin: Limitations, progress, and a new hypothesis for its function
Ainsworth et al. Fluorescence in situ hybridization and spectral imaging of coral-associated bacterial communities
Bacquet et al. Selection on male sex pheromone composition contributes to butterfly reproductive isolation
Bhartia et al. Label-free bacterial imaging with deep-UV-laser-induced native fluorescence
Kanchiswamy et al. Calcium imaging perspectives in plants
Faget et al. Disentangling who is who during rhizosphere acidification in root interactions: combining fluorescence with optode techniques
Zhang et al. Rare Earth Ion Mediated Fluorescence Accumulation on a Single Microbead: An Ultrasensitive Strategy for the Detection of Protein Kinase Activity at the Single‐Cell Level
Piljić et al. Rapid development of genetically encoded FRET reporters
Sung et al. Live cell imaging and systems biology
Maaß et al. Environmental filtering vs. resource-based niche partitioning in diverse soil animal assemblages
WO2002029411A3 (en) Magnetic in situ dilution
FI20020355A0 (fi) Reagenssi ja prosessi biologisten solujen identifioimiseksi ja laskemiseksi
Kürsten et al. Cultivation of Chlorella vulgaris in microfluid segments and microtoxicological determination of their sensitivity against CuCl2 in the nanoliter range
Pargett et al. Single-cell imaging of ERK signaling using fluorescent biosensors
Ramírez-Reinat et al. Prevalence of Ca2+-ATPase-mediated carbonate dissolution among cyanobacterial euendoliths
Fang et al. Combining multiple high-resolution in situ techniques to understand phosphorous availability around rice roots
Riegraf et al. Detection and quantification of photosystem II inhibitors using the freshwater alga Desmodesmus subspicatus in combination with high-performance thin-layer chromatography
CN105606800B (zh) 一种广谱农药检测金标试纸及方法
CN105911290B (zh) 应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法
Pascoal et al. Linking microbial decomposer diversity to plant litter decomposition and associated processes in streams
Kürsten et al. Identification of response classes from heavy metal‐tolerant soil microbial communities by highly resolved concentration‐dependent screenings in a microfluidic system
Brockmann et al. Visualizing acidophilic microorganisms in biofilm communities using acid stable fluorescence dyes
ATE440968T1 (de) Verfahren zur diagnostizierung von aspirinunverträglichkeit

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180518

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee