CN105875231A - 一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，属农业植物保护领域，该方法选用表皮完好的待测薯块，进行表面消毒及高温愈合处理；消毒后的线虫悬浮液滴加到创可贴止血棉上，贴于待测薯块表面，后用保鲜膜包裹保湿；将接种茎线虫的薯块在25℃，80％湿度条件下暗培养30d后取出，去除创可贴；沿接种位点横切，测量薯块横截面周长及表皮层发病组织周长，再沿接种位点将薯块纵切，测量薯块长度及发病组织长度；计算发病组织面积与薯块表面积比值及防治效果，根据平均防效进行分级，评价甘薯品种的抗感特性。该鉴定方法科学有效，操作简单，实验周期短，较好的避免接种线虫的流失及固定侵入位点，能够准确表现甘薯品种对茎线虫病的侵入抗性。

Description

一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种农作物病虫害抗侵入性鉴定方法，具体涉及一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，属农业植物保护领域。
背景技术
我国是世界最大的甘薯生产国，年均甘薯种植面积6500万亩，鲜薯总产量达1.0亿吨以上。甘薯茎线虫病(Ditylenchus destructor Thorne)是我国北方薯区最为严重的病害之一，通常可导致甘薯减产10-20％，严重时可达50-60％，甚至绝收。此外，该病害在甘薯收获后储藏期还可导致甘薯烂窑，在育苗期引起烂床，为害时期涵盖整个甘薯生育期。
培育抗性品种一直是作物病害综合防治中最为经济有效的手段，而抗性育种工作的首要任务就是抗性资源的筛选。目前被广泛采用的甘薯抗茎线虫病抗性鉴定方法主要是田间自然诱发法和室内打孔接种法。前者易受到环境因素的影响，因此鉴定结果不稳定，且实验周期较长；后者在打孔接种时已经破坏了甘薯表皮结构，虽能准确的评价甘薯品种对茎线虫病的抗扩展性，但无法评价抗侵入性。
林茂松等(林茂松，贺丽敏，文玲，方中达，宋伯符.甘薯形态结构对茎线虫病的抗性机制.中国农业科学，1996.29(3):8-12)曾采用将含有2000头线虫的悬浮液直接滴加到薯块表皮，后用脱脂棉吸附的方法评价甘薯对茎线虫的抗侵入性。该方法的主要缺陷在于线虫液的流动性会导致接种线虫的大量流失及无法固定线虫的侵染位点，降低了后续抗性评价结果的可靠性。因此，研发一种有效的甘薯茎线虫病抗侵入性鉴定方法对全面评价甘薯品种的茎线虫病抗性具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为满足茎线虫病抗性育种工作对抗侵入性鉴定方法的需求以及克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效的甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法。
本发明采用的技术方案是一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，包括以下步骤：
1)茎线虫分离及消毒：在田间采集发病薯块，用浅盘法分离获得茎线虫悬浮液，将获得的茎线虫悬浮液离心浓缩，弃上清，用消毒液对茎线虫表面消毒1h，用灭菌水清洗3次，配成浓度为1000头/ml的线虫悬浮液，4℃保存备用；
2)参试甘薯品种准备：挑选表皮完好的待鉴定甘薯品种薯块，清洗干净后酒精消毒，消毒后将待鉴定薯块在35℃，85-90％湿度环境下高温愈合24h，消除薯块表面的细微伤口，高温愈合后的薯块置于已消毒的塑料箱中保存备用，选取完好的栗子香薯块进行相同处理，作为感病对照；
3)接种鉴定：用移液器吸取200μl线虫悬浮液滴加到创可贴的止血棉上，将带有线虫的创可贴贴于薯块中部表面，后用保鲜膜包裹保湿，接种线虫后的薯块置于消毒的塑料箱中，在25℃,80％湿度条件下暗培养30d，进行调查评价；
4)调查评价：去除薯块表面的保鲜膜及创可贴，测量薯块外表面长度L，沿接种位点将薯块横切，测量薯块截面周长A，及薯块表皮层内发病组织的横向长度a，再将薯块沿接种位点纵切，测量发病组织纵向长度l；
5)防效计算方法：依据薯块病健面积比R，即发病组织面积与薯块表面积的比值评价薯块的发病程度，根据步骤4)的测量数据，病健面积比的计算方法为R＝al/AL，防治效果通过对照病健面积比与测试品种病健面积比的差值除以对照病健面积比进行计算，具体计算公式如下：
6)分级标准：通过防效数值的范围评价测试甘薯品种的抗性等级，具体分级标准为：
高抗：平均防效≥80％；
抗病：60％≤平均防效＜80％；
中抗：40％≤平均防效＜60％；
感病：20％≤平均防效＜40％；
高感：平均防效＜20％。
作为改进，所述步骤1)中茎线虫悬浮液在8000rpm离心5min浓缩。
作为改进，所述步骤1)中消毒液含0.1％硫酸链霉素和0.002％放线菌酮。
作为改进，所述步骤2)中薯块表面喷施75％的酒精消毒。
作为改进，所述步骤2)中采用的待鉴定种薯为徐18、徐781或郑红22。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该鉴定方法科学有效，操作简单，实验周期短，且有效克服了现有技术的缺陷，能较好的避免接种线虫的流失及固定侵入位点；通过创可贴将200头茎线虫固定接种于薯块表皮，25℃下暗培养30天，计算防治效果，是科学有效的甘薯茎线虫病抗侵入性评价方法。
附图说明
图1为本发明方法在栗子香薯块上的实施例：
图中(A)甘薯品种栗子香表皮接种；(B)接种30d发病症状；(C)接种50d发病症状。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例一
一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，按如下步骤进行：
1)茎线虫分离及消毒：在田间采集发病薯块，用浅盘法分离获得茎线虫悬浮液，将获得的茎线虫悬浮液在8000rpm离心5min浓缩，弃上清，加入含有0.1％硫酸链霉素和0.002％放线菌酮的消毒液对茎线虫表面消毒1h，用灭菌水清洗3次，配成浓度为1000头/ml的线虫悬浮液，4℃保存备用；
2)参试甘薯品种准备：分别挑选表皮完好的徐18、徐781、郑红22作为种薯，清洗干净后表面喷施75％的酒精消毒，消毒后将待鉴定薯块在35℃，85-90％湿度环境下高温愈合24h，消除薯块表面的细微伤口，高温愈合后的薯块置于已消毒的塑料箱中保存备用，选取完好的栗子香薯块进行相同处理，作为感病对照；
3)接种鉴定：用移液器吸取200μl线虫悬浮液(含200头茎线虫)滴加到创可贴的止血棉上，将带有线虫的创可贴贴于薯块中部表面，后用保鲜膜包裹保湿，接种线虫后的薯块置于消毒的塑料箱中，在25℃，80％湿度条件下暗培养30d，进行调查评价；
4)调查评价：去除薯块表面的保鲜膜及创可贴，测量薯块外表面长度(L)，沿接种位点将薯块横切，测量薯块截面周长(A)，及薯块表皮层内发病组织的横向长度(a)，再将薯块沿接种位点纵切，测量发病组织纵向长度(l)；
5)防效计算方法：依据薯块病健面积比(R)，即发病组织面积与薯块表面积的比值评价薯块的发病程度，根据步骤4)的测量数据，病健面积比的计算方法为R＝al/AL，防治效果通过对照病健面积比与测试品种病健面积比的差值除以对照病健面积比进行计算，具体计算公式如下：
(6)分级标准：通过防效数值的范围评价测试甘薯品种的抗性等级，具体分级标准为：
高抗：平均防效≥80％；
抗病：60％≤平均防效＜80％；
中抗：40％≤平均防效＜60％；
感病：20％≤平均防效＜40％；
高感：平均防效＜20％。
采用本发明方法获得徐18、徐781、郑红22在不同茎线虫接种剂量下的抗侵入性鉴定结果，具体如下表1所示。
表1.甘薯品种茎线虫病抗侵入性鉴定
结合表1、图1，从上述列举的鉴定结果可以看出：
①利用创可贴将茎线虫接种于甘薯薯块表皮，能够有效防止线虫流失及固定线虫侵入位点，且对茎线虫的侵入无影响。
②茎线虫侵入甘薯30d后内主要在薯块表皮层内扩展(图1B)，侵入50d后已扩展至薯块内部(图1C)。由于本方法目的在于鉴定甘薯品种的抗侵入性，所以选择接种30d后调查更为适宜。
③当线虫接种剂量为50头、100头时，感病对照栗子香薯块的平均病健面积比仅分别为23.7％和55.6％，未达到理想发病程度；而接种剂量为200头时，栗子香的平均病健面积比为93.5％，达到作为感病对照的要求。因此，本鉴定方法选择的线虫接种剂量为200头。
④通过本方法对不同甘薯品种的茎线虫病抗侵入性进行鉴定，筛选出部分具有抗性的甘薯品种，证明本鉴定方法是有效的甘薯茎线虫病抗侵入性鉴定方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)茎线虫分离及消毒：在田间采集发病薯块，用浅盘法分离获得茎线虫悬浮液，将获得的茎线虫悬浮液离心浓缩，弃上清，用消毒液对茎线虫表面消毒1h，用灭菌水清洗3次，配成浓度为1000头/ml的线虫悬浮液，4℃保存备用；
2)参试甘薯品种准备：挑选表皮完好的待鉴定甘薯品种薯块，清洗干净后用75％酒精消毒，消毒后将待鉴定薯块在35℃，85-90％湿度环境下高温愈合24h，消除薯块表面的细微伤口，高温愈合后的薯块置于已消毒的塑料箱中保存备用，选取完好的栗子香薯块进行相同处理，作为感病对照；
3)接种鉴定：用移液器吸取200μl线虫悬浮液滴加到创可贴的止血棉上，将带有线虫的创可贴贴于薯块中部表面，后用保鲜膜包裹保湿，接种线虫后的薯块置于消毒的塑料箱中，在25℃,80％湿度条件下暗培养30d，进行调查评价；
4)调查评价：去除薯块表面的保鲜膜及创可贴，测量薯块外表面长度L，沿接种位点将薯块横切，测量薯块截面周长A，及薯块表皮层内发病组织的横向长度a，再将薯块沿接种位点纵切，测量发病组织纵向长度l；
5)防效计算方法：依据薯块病健面积比R，即发病组织面积与薯块表面积的比值评价薯块的发病程度，根据步骤4)的测量数据，病健面积比的计算方法为R＝al/AL，防治效果通过对照病健面积比与测试品种病健面积比的差值除以对照病健面积比进行计算，具体计算公式如下：
6)分级标准：通过防效数值的范围评价测试甘薯品种的抗性等级，具体分级标准为：
高抗：平均防效≥80％；
抗病：60％≤平均防效＜80％；
中抗：40％≤平均防效＜60％；
感病：20％≤平均防效＜40％；
高感：平均防效＜20％。
2.如权利要求1所述一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)中茎线虫悬浮液在8000rpm时离心5min浓缩。
3.如权利要求1所述一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)中消毒液含0.1％硫酸链霉素和0.002％放线菌酮。
4.如权利要求1所述一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)中薯块表面喷施75％的酒精消毒。
5.如权利要求1所述一种甘薯茎线虫病室内抗侵入性鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)中采用的种薯为徐18、徐781或郑红22。
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