CN105874055B - 经有性杂交产生木霉菌节段性非整倍体(san)菌株之方法及所制得的san菌株 - Google Patents

Abstract

本发明系关于一种提供木霉菌节段性非整倍体后代菌株之技术。具体而言，本发明关于一种藉由有性杂交两种带有染色体杂合性(例如，一个具有支架M及支架33，另一个具有支架F及支架X)之亲代单倍体菌株，以产生木霉菌节段性非整倍体后代菌株之方法；较佳地，至少其中一者包含一个非同源性末端接合(non‑homologous end joining；NHEJ)基因。本发明亦关于因此产生之一种稳定的木霉菌节段性非整倍体后代菌株，具体而言该菌株具有增强的醣类活性酵素(carbohydrate‑active enzymes；CAZymes)基因表现或活性，以及更具体的，可避免该菌株经一段时间后恢复成整倍体。

Description

经有性杂交产生木霉菌节段性非整倍体(SAN)菌株之方法及 所制得的SAN菌株

相关申请案

依据35U.S.C.§119(e)，本申请案享有美国临时申请案的优先权(申请日：2013年10月2号；申请号：61/886,043)，其中所有内容皆引入本文以参酌。

技术领域

本发明关于一种产生木霉菌节段性非整倍体后代菌株之技术。具体而言，本发明关于一种藉由有性杂交两个带有染色体杂合性之亲代单倍体菌株，以产生木霉菌节段性非整倍体后代菌株之方法；尤其其中一者进一步包含一个非同源性末端接合(NHEJ) 基因缺失。本发明亦关于一种因此产生之稳定的木霉菌节段性非整倍体后代菌株，该菌株具有增强的醣类活性酵素(CAZymes)基因表现或活性，以及更具体的，可避免该菌株经一段时间后恢复成整倍体。

背景技术

木霉属之真菌可存在于泥土及其他多样之栖息地。其对于植物而言，也是一种有益的共生伙伴，尤其是农作物。木霉菌会分泌纤维素酶及半纤维素酶，以分别降解β- 葡聚醣及木聚醣，木质纤维素生物原料的主要结构成份，以形成葡萄醣及木醣。迄今多种使用中之高量酵素生产菌株(如QM9414、Rut-C30)系藉由化学诱变剂及/或辐射处理木霉菌QM6a菌株以产生的，并广泛应用于工业中。然而，经过多次化学及/或物理突变，该等高分泌性之突变体之基因组存在太多的突变、缺失及重组[1-3]，进而导致基因组的不稳定性。再者，该等工业菌株所分泌之木聚醣降解半纤维素酶的量较β-葡聚醣降解纤维素酶的量少。

木霉菌是泛热带子囊菌红褐肉座菌的无性型[4]。红褐肉座菌CBS999.97野生分离株进行一种异宗配合的生殖周期，以产生CBS999.97(1-1)及CBS999.97(1-2)单倍体，并分别带有MAT1-1及MAT1-2交配型基因座。QM6a带有MAT1-2交配型基因座，且亦可与CBS999.97(1-1)单倍体交配以形成子实体，其含有子囊及16颗之子囊孢子[5]。

减数分裂是一种特殊形式的细胞分裂，其可使得有性生殖之生物体可产生基因的多样性。计划性DNA双股断裂(double-strand breaks；DSBs)系为整个基因组中藉由减数分裂特定Spo11核酸内切酶以自然产生的[6]。于模式生物体，像是酵母及老鼠，该Spo11 诱发的DSBs可藉由无错误同源重组方式以进行修复，进而确保同源染色体准确的分离，及基因组之稳定性。相反地，先前研究显示非整倍体，或节段性非整倍体(SAN) 的减数分裂产物，系于部分丝状真菌中产生的。例如，真菌的人类病原菌新隐球菌，于减数分裂过程中会进行大型的节段性复制，其系藉由与两个不同染色体间，进行端粒-端粒融合及染色体转位[7、8]。植物的病原菌真菌禾生球腔菌(小麦叶枯病菌的无性型)产生之子囊孢子，其具有高达8个非必要之染色体[9、10]。植物致病性真菌红球丛赤壳菌交配世代VI(茄镰孢菌的无性型)之部分子囊孢子分离株含有「过多的」染色体，称作「条件式之非必要的」染色体[11-13]。值得注意的是，红球丛赤壳菌交配世代VI，于较老的麦角菌目中，与木霉菌属于基因近似之品种[13、14]。

目前仍有需要发展一种技术，以得到新颖的木霉菌菌株，其具有增强的醣类降解酵素之表现或活性，尤其是半纤维素酶。

发明内容

在本发明中，意外发现可存活的节段性非整倍体后代，其可藉由将两个带有染色体杂合性(一者具有支架M及支架33，另一者具有支架F及支架X)之单倍体之木霉菌菌株进行有性生殖，经减数分裂及后减数的有丝分裂而产生，其中所得到之SAN后代，包含一约长度为500Mbp之复制的染色体片段(如下述之D片段)，其可增强各种不同之醣类降解酵素之表现或活性。此外，亦发现一非同源性末端接合(NHEJ)基因之缺失(tku70 或连接酶IVtmus53)可稳定片段之复制，即预防SAN后代转变回整倍体，这表示负责整倍体之复原是NHEJ而不是同源性重组。吾人进而应用此技术以产生稳定的SAN菌株，其可产生较RUT-C30(一种广泛使用的工业菌株，系用于木质纤维素生物原料之降解) 更多之半纤维素酶。

因此，于一方面中，本发明提供一种用于制备木霉菌节段性非整倍体菌株之方法，包含下列步骤：

(a)辨识及挑选木霉菌第一菌株，其具交配能力，且其基因组中带有支架33及支架M；

(b)辨识及挑选木霉菌第二菌株，其具交配能力，可与步骤(a)之第一菌株交配，且其基因组中带有支架F及支架X；

(c)有性杂交步骤(a)之第一菌株与步骤(b)之第二菌株；

(d)从步骤(c)中辨识及挑选节段性非整倍体(SAN)后代，其之基因组中具有D 复制片段。

于部分具体实施例中，该第一菌株具有MAT1-1基因座，及第二菌株具有MAT1-2基因座，或该第一菌株具有MAT1-2基因座，及第二菌株具有MAT1-1基因座。

于部分具体实施例中，于步骤(a)中，该第一菌株系藉由进行一聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction；PCR)分析来辨识，藉此判定其基因组中支架33及支架M之存在与否。

于部分具体实施例中，于步骤(b)中，该第二菌株系藉由进行一聚合酶链锁反应(PCR)分析来辨识，藉此判定其基因组中支架F及支架X之存在与否。

于部分具体实施例中，于步骤(d)中，该SAN后代系藉由比较基因组杂交(comparative genomic hybridization；CGH)分析或南方墨点分析来辨识，藉此判定D复制片段。

于特定具体实施例中，该SAN后代具有一个或多于一个之编码醣类活化酵素(CAZyme)之基因，其基因表现系增强的。

于部分具体实施例中，该第一菌株或第二菌株进一步包含非同源性末端接合(NHEJ)基因缺失，该所得之SAN后代，系由第一菌株及第二菌株进行有性杂交所生成，其之基因组中经辨识及挑选，确认具有D复制片段及NHEJ基因缺失。

于部分实例中，该NHEJ基因为tku70或tmus53。

于再一方面中，本发明提供一种制备稳定之木霉菌节段性非整倍体菌株之方法，包含：

(a)将两个具有染色体杂合性之单倍体可交配之木霉菌菌株进行有性杂交，其中该两个菌株中至少一者包含一NHEJ基因缺失；及

(b)从步骤(a)中辨识及挑选出一后代，其为节段性非整倍体(SAN)且具有NHEJ 基因缺失。

本发明亦提供一稳定之木霉菌节段性非整倍体菌株，系藉由本文所述方法制得。

本发明一种或多种具体实施例之细节系于以下说明中详述之。其他本发明之特征或优点，可藉由以下各种具体实施例之详细说明以及所附之申请专利范围得以明了。

附图说明

先前的摘要，以及之后本发明之详细说明，阅读时配合所附之图式得以更佳的了解。为了阐述本发明之目的，于图式中所示之具体实施例仅为较佳者。然应可理解的是，本发明不局限于该等所示之准确组成及达成方式。

图式中：

图1显示十六颗子囊孢子之分离及其结果。(A)上图，基质；下图，发育中之子囊，其含有16颗子囊孢子。每一颗子囊孢子根据其位于子囊之位置予以编码。从十六颗子囊孢子来的16颗孢子接着将之分离，并于个别100mm之麦芽萃取洋菜胶(malt-extract agar；MEA)盘上生长。分离从一颗子囊孢子生成之单一聚落，并将之个别转移到一 60mm之马铃薯葡萄糖洋菜培养基(potato dextrose agar；PDA)盘上。(B)将野生分离株 CBS999.97(1-1)与CBS999.97(1-2)(n≥20)、QM6a(n≥10)、RUT-C30(n≥10)或QM9414 (n≥10)进行有性杂交，以于持续黑暗中生成十六颗子囊孢子。于持续黑暗中生成16颗野生型子囊孢子。该16颗单一子囊孢子聚落系根据子囊孢子之顺序以依序排列。无法存活的子囊孢子系以哭脸符号表示。

图2显示基因型鉴定之结果。基因组PCR分析于所有16颗存活之子囊孢子之 mat1-1、mat1-2及tact1(肌动蛋白)基因，该孢子系由CBS999.97野生分离二倍体及一 tku70Δ二倍体所生成。该亲源野生分离单倍体菌株，CBS999.97(1-1)及CBS999.97(1-2)，作为对照组。

图3显示微数组比较基因组杂交法(aCGH)之结果。CBS999.97(1-1)基因组DNA作为一标准，以测量DNA套数的改变。于图谱中每一条线代表一个寡核苷酸及其位于QM6a 及CBS999.97(1-2)基因组序列中之位置。该QM6a基因组组合包含89个支架。三个连续的支架(27,28,36)重组成一较大的支架M。该寡核苷酸包含87个支架之正规化平均值如图所示。该87个支架根据其长度依序从左到右排列。支架M之长度稍微较支架11短。该两个亲源野生分离单倍体(A)及该野生分离株(B-F)之代表性子囊孢子聚落之基因套数，显示于左边。数据可于基因表达库登录码GSE-40850取得。该带有复制片段之5个菌株(D1-D5)及7个整倍体之对照菌株(N0-N6)亦如图所示。

图4显示经红褐肉座菌子囊孢子形成/成熟期间之四次核分裂之影像。(A-G)手工剖解发育中之子囊，以DAPI染色，接着以荧光显微镜观察。DIC及DAPI荧光染色影像如图标。核(N)系以白色箭头标示。(H)发育中之子囊的DIC影像显示8个核(8N)同步分裂成16个核(16N)。

图5显示代表性微数组比较基因组杂交法(aCGH)结果，显示可存活的节段性非整倍体(SAN)后代。该寡核苷酸包含支架25-37之正规化平均值如图所示。该等支架系根据其长度由左至右排序。

图6显示于减数分裂期间，经由同源性重组，可存活的SAN子囊孢子及无法存活的子囊孢子之假设的形成模式。该染色体杂合性加速形成节段性非整倍体。

图7显示于QM6a及CBS999.97基因组中之差别染色体之构成。(A)于QM6a及野生分离株CBS999.97(1-2)基因组中之支架33及支架M。支架27、28、33及36系分别以墨绿色、蓝色、黑灰色、及绿色箭头表示。支架28系位于靠近端粒(黑色)之位置，由于支架M之 3’端系与一重复的六核甘酸序列(TTAGGG)相连，其为QM6a之端粒重复。该支架(L片段)之5’端系以亮灰色表示。新颖基因(ID:112288)之三个外显子(E1、E2、E3)系如图所示。该第一外显子(E1)仅存在于QM6a基因组中。(B)支架F及支架X存在于野生分离株 CBS999.97(1-1)基因组中。

图8显示于减数分裂中，是染色体杂合性，而非NHEJ，系与节段性非整倍体后代之形成有关。图8(A)阐述分别用于进行支架(M、F、33及X)基因型鉴定之PCR引子对(A、 B、C、及D)之位置。图8(B)显示所示之单倍体菌株之PCR基因型鉴定。CBS999.97(1-1)、 CBS999.97(1-2)及QM6a作为对照组。两个新的单倍体，CBS999.97(1-1,M,33)及 CBS999.97(1-2,F,X)，系从该两亲源单倍体CBS999.97(1-1,F,X)及CBS999.97(1-2,M, 33)之后代中被找到。吾人发现所有从有性杂交CBS999.97(1-2,F,X)及CBS999.97(1-2, F,X)或有性杂交CBS999.97(1-1,M,33)及CBS999.97(1-2,M,33)所生成之16颗子囊孢子皆为可存活的。再者，无论将tku70或tmus53缺失皆不会影响各种相关菌株之减数分裂、子囊孢子数目或子囊孢子之存活。请参阅实例2.2之表6。

图9显示CGH结果，于两亲源CBS999.97菌株之支架M(27+28+36)及支架33中，3 个存活的节段性非整倍体(SAN)子囊孢子、1颗存活的整倍体子囊孢子及2颗恢复成整倍体(return-to-euploid；RTU)之菌株，指出于该存活的节段性非整倍体(SAN)子囊孢子中L片段是不存在的。该CGH结果显示于该两亲源CBS999.97菌株之支架M(27+28+36) 及支架33中，3个存活的节段性非整倍体(SAN)子囊孢子、1颗存活的整倍体子囊孢子及2颗恢复成整倍体(RTU)之菌株。该3个SAN子囊孢子含有两个D片段，遗失了L片段，然而，该2个RTU菌株具有一个D片段及没有L片段。

图10显示节段性非整倍体(SAN)后代可产生较高程度之木聚醣酶。(A)所述菌株之木聚醣酶及纤维素酶活性(每1mg之菌丝体中之活性单位(U))系以木聚醣酵素AX锭及 Azo-CM-纤维素分别作为受质来测量。实验以三重复进行，且以标准偏差呈现。(B)由热图产生，比较基因组野生型转录图谱，5株菌株带有复制片段(D1-D5)及7个整倍体对照菌株(N0-N6)(P<0.05)。基因表达库登录码为GSE-41965。(C)全身性转录之基因套数之影响。5株带有节段性复制之菌株(D1-D5)及7个整倍体对照组菌株(N1-N6)之基因组野生型mRNA量之平均比率(上图)及基因套数(下图)，如图示。所有测量系以三重复进行(P<0.05)。

图11显示NHEJ基因之缺失，可稳定节段性复制及增强生长优势。(A)两个野生型SAN(D2、D3)、tku70ΔSAN及tmus53ΔSAN(WTH1994)后代之aCGH结果。于含葡萄糖之麦芽萃取洋菜胶(MEA)培养基中子囊发芽后天数，如图右所示。基因表现库之登录码为GSE-42359。(B)于木聚醣为主之Mandels Androeotti培养基中，该SAN菌株较 CBS999.97整倍体菌株或恢复成整倍体菌株产生更多的生物原料。实验系以两个不同的聚落，进行三次试验，并以平均值±SEM(误差线)表示。(C)该SAN(D2)突变株较亲源整倍体菌株于稻秆上长的更好。(D)该Δmus53SAN(WTH1994)菌株可维持高量之木聚醣酶活性长达50天。(E、F)相较于RTU-C30，一种广泛使用之木霉菌过度分泌型突变株，该tmus53ΔSAN突变株(WTH1994)显示约～2倍之专一木聚醣酶活性及～0.8倍专一纤维素酶活性。实验系以三次重复试验进行，且以平均值±SEM(误差线)表示。

图12显示在RTU前后，两个D片段之南方墨点分析。BsmBI限制酶位置及用于南方墨点分析之DNA探针系如右图所示。于支架F及支架M之D片段的限制酶切片段，长度约分别为～400-bp及～1500-bp。该两个亲源半倍体菌株，CBS999.97(1-1)及 CBS999.97(1-2)，作为阳性对照组。

具体实施方式

除非另有定义，所有本文所使用之技术及科学性术语与属于本发明领域之具有通常技艺者所习知之意义相同。

本文所用之术语「一」及「一种」系指一种或多于一种(即至少一种)本文章之语法对象。举例而言，「一种组件」意旨一种组件或多于一种组件。

本文所用之「约」或「近乎」或「大约」乙词系指所给之数值或范围之±20％以内，较佳地为±15％以内，更佳地为±10％以内，以及最佳地为±5％以内。

「多核苷酸」或「核酸」乙词系指一由核苷酸单元所组成之聚合物。多核苷酸包含自然存在之核酸，像是脱氧核醣核酸(DNA)及核醣核酸(RNA)以及核酸相似物，包含该等具有非天然存在之核苷酸。多核苷酸可被合成，例如，使用自动化DNA合成仪。「核酸」乙词典型地系指大型多核苷酸。可被理解的是当一核苷酸序列以DNA序列(即 A、T、G、C)代表，或包含RNA序列(如A、U、G、C)，其中「U」取代了「T」。「cDNA」乙词系指一DNA为互补的或与一mRNA相同，无论是单股或双股的形式。

「互补」乙词系指拓扑兼容性或两多核苷酸之交互作用表面可吻合。因此，该两分子可被称为互补，且进一步该接触表面特征与另一者的为互补的。若第一多核苷酸之核苷酸序列与第二多核苷酸之多核苷酸结合对象之核苷酸序列相同，则第一多核苷酸与第二多核苷酸为互补的。因此，该多核苷酸之序列5′-TATAC-3′系与一多核苷酸序列5′-GTATA-3′为互补的。

「编码」乙词系指一多核苷酸中之核苷酸之特定序列与生俱来的特性(如一基因、一cDNA、或一mRNA)，可于生物反应中作为合成其他聚合物及大分子之模板，其具有一特定之核苷酸序列(如rRNA、tRNA及mRNA)或一特定之胺基酸序列及其所衍生之生物特性。因此，若一基因所产生之mRNA转录及转译，可于细胞或其他生物系统中产生蛋白，则称该基因编码蛋白质。具有技艺者可知的是多种不同的多核苷酸及核酸可编码相同的多胜肽，其为基因密码之简并性。该等具有技艺者亦知，可使用常规技术以进行核苷酸取代，而不会影响由前述之多核苷酸所编码之多胜肽序列，以对应出任何特定宿主生物体之密码子利用性来表现该多胜肽。因此，除非另有定义，「一核苷酸序列编码一胺基酸序列」包含所有核苷酸序列，其为彼此之简并形式，且编码相同的胺基酸序列。核苷酸序列编码蛋白及RNA可包含内含子。

本文所用之「整倍体」乙词系指所指之物种特征之染色体正常套数。「节段性非整倍体」乙词系指一生物体基因组之状态，其中部分染色体片段呈现不正常之套数，例如，于染色体特定区域发生复制。

该领域习知，提及基因组定序，主要序列数据都是短序列读取的。许多该等序列与彼此重迭，且可被结合以产生较长的邻近序列，如片段重迭群。邻近的片段重迭群可为导向的，有序的及互相连结成较长的支架，其多被安置于染色体上。木霉菌QM6a 已被报告有89个支架(套数或次序及具方向的片段重迭群)以产生约34Mbp之基因组序列[1]。该基因组序列可于美国联合基因组研究所之木霉菌基因组数据库v2.0中取得 (http://genome.jgi- psf.org/Trire2/Trire2.home.html)。

本文所用之「同源重组」乙词意指两DNA分子或染色分体间之DNA片段，于具有同源性核苷酸序列之区域，发生交换。

本文所用之「同源」乙词意指DNA序列之结构特征，与对照序列相比，具有至少约70％序列相同性，相比于对照序列，具体上至少约85％序列相同性，更具体为至少约95％序列相同性，更加具体为约99％序列相同性，最具体为约100％序列相同性。可理解的是同源序列之核苷酸序列中可具有插入、缺失及置换。因此，若部分核苷酸残基不会完全对应或对准，该核苷酸之线性序列可被认为本质上彼此相同。该对照序列可为一组较长的序列，像是一基因或邻近序列的一部份、或染色体重复的一部分。

为了决定两个核苷酸或胺基酸序列之相同百分比，将该等序列对准以进行适化的比较(如可于第一序列之序列中引入沟道以与第二序列适化对准)。计算百分比相同性时，一般完全吻合者会被计算。两序列间之百分比同源性或相同性之判定，可藉由使用该领域所习知之数学算法进行，例如BLAST及Gapped BLAST程序、NBLAST及 XBLAST程序、或ALIGN程序。

本文所用之真菌「有性杂交」乙词是指真菌提供者及真菌接受者间之杂交，其可进行交配。该真菌提供者及真菌接受者一般为相同品种但具有不同的交配类型(MAT) 基因座或基因，其编码可能的交配型无性形及/或性基因。例如，该真菌提供者可能具有一种MAT基因座类型，以及该真菌接受者可能具有相反的MAT基因座类型，其中该提供者之MAT基因座可与真菌接受者之MAT基因座互补，以使该真菌接受者进行有性周期。一般说来，丝状的子囊孢子真菌可具有两种交配型，MAT1-1及MAT1-2，以及例如于具有MAT1-1基因座之第一菌株可与带有互补基因座(即MAT1-2基因座)之第二菌株发生有性杂交。

本发明提供经由有性杂交以产生节段性非整倍体木霉菌后代菌株之技术，及其产生之菌株。

于一方面中，本发明提供一种产生节段性非整倍体木霉菌后代菌株之方法，其包含辨识及挑选具有染色体杂合性之两个亲源可交配的单倍体菌株，例如其中一者具有支架M及支架33，另一者具有支架F及支架X，接着将该两个亲源菌株进行有性杂交，并从有性杂交中辨识及挑选出一节段性非整倍体后代，其具有D复制片段于其基因组中。

如本文所述，存在于木霉菌(QM6a及CBS999.97)基因组中之支架M、33、F及X及 D片段，如图6及图7所示。

具体上，本文所用之支架33包含：

(i)支架33之5’端，约33kb(称作L片段)，及

(ii)支架33之3’端，约171kb(称作33(3’)片段)；

支架M包含：

(i)D片段，包含：

支架28之3’端，长度约37kb(称作28(3’)片段)，

全长的支架27，长度约427kp，及

支架36之5’端，长度约52kb(称作36(5’)片段)，以及

(ii)一非D片段，包含：

支架36之3’端，长度约83kb(称作36(3’)片段)，以及

支架28之5’端，长度约370kb(称作28(5’)片段)；

支架F包含：

(i)D片段及

(ii)33(3’)片段；及

支架X包含：

(i)L片段及

(ii)非D片段。

表1显示根据本发明之特定具体实施例之第一菌株及第二菌株之基因组特征。

表1

*该4个支架(M、33、X、F)之核苷酸序列可上网取得：

http://bc.imb.sinica.edu.tw/～lab229/Text_file_T1-4.rar.

本文所述可用于判定木霉菌株之基因组特征之不同方法皆为该领域可知之方法。具体而言，该方法可利用一种或多种寡核苷酸探针或引子，包含，例如，用于聚合酶连锁反应(PCR)之引子对，其可专一地与支架序列的目标区域杂合。例如，(1)第一引子对(引子C及引子B)可被设计以标靶界于L片段及支架33之3’端间的桥接区域，以判定支架33之存在与否；(2)第二引子对(引子A及引子D)可被设计以标靶界于D片段及非D 片段间之桥接区域(如横跨该断裂位置，支架36：54323-54324)，以判定支架M之存在与否；(3)第三引子对(引子A及引子B)可被设计以标靶界于D片段及支架33之3’端间之桥接区域，以判定支架F之存在与否；及(4)第四引子对(引子C及引子D)可被设计以标靶界于L片段及非D片段间之桥接区域，以判定支架X之存在与否。请参阅图8A所示，显示用于鉴定支架基因型之PCR引子A、B、C及D之位置。表2-3显示引子A、B、C及 D之特定序列，以作为一示例。

表2

表3以引子对增幅之核苷酸片段

根据本发明，该第一菌株及第二菌株为具交配能力的，且可与彼此交配，即其中一者为一种交配型，另一者为相反之交配型。于一具体实施例中，该第一菌株具有 MAT1-1基因座，及第二菌株具有MAT1-2基因座。于另一具体实施例中，第一菌株具有MAT1-2基因座，及第二菌株具有MAT1-1基因座。

当第一具交配能力之菌株(含有支架33及支架M)及第二具交配能力之菌株(含有支架F及支架X)被找到及挑选出来后，将两者进行有性杂交。可使用常规方法将木霉菌株进行有性杂交。具体而言，可以使用含有适合的培养基之洋菜胶盘，如麦芽萃取洋菜胶(MEA)。为了进行有性杂交，将第一菌株及第二菌株接种在洋菜胶盘上，彼此间间隔适当距离。适合诱发有性杂交之环境为25℃持续黑暗2-3周、或置于12小时的光周期 (12小时光/暗周期)达8-10天。经培养后，分析盘上有性结构之生成情形。将有性结构(基质或子实体)从盘上取出，于无菌水进行清洗。接着，将其切开，并将子囊孢子释放出来，以置于个别的麦芽萃取洋菜胶盘(MEA)上以判定孢子存活与否。将每一个从一颗子囊孢子来的存活的聚落分离出来，并将之转移到马铃薯葡萄糖洋菜培养基(PDA)盘上。进而分析其特征，包含聚落型态、聚落颜色、基因型及/或基因组野生型之基因套数。

接着，从经有性杂交后之存活的子囊孢子中挑选出其基因组中具有D复制片段之节段性非整倍体后代。该D片段为约0.5Mbp之核苷酸片段，5’端至3’端包含：支架28 之3’端，长度约37kb、全长支架27，长度约427kp、及支架36之5’端，长度约52kb。该 D片段可藉由aCGH技术或南方墨点分析确认。

根据本发明，该木霉菌SAN后代具有D复制片段，且具有许多有益特征，包含增强的基因表现、或酵素活性、或对于产生生物原料之有益的生长优势。

于一具体实施例中，藉由本发明之方法所产生之具有D复制片段的木霉菌SAN后代，具有一种或多种编码醣类活性酵素(CAZyme)基因表现增强之特征，不仅是位于D 片段者，亦包含该等非位于D片段者。

具体而言，该CAZyme编码基因系选自由：位于支架27之内源-β-1,4-木聚醣酶基因(xyn2；ID：123818)、位于支架28之β-甘露糖苷酶基因(ID：69245)、位于支架2之α-L- 阿拉伯呋喃糖酶基因(GH54，ID：55319)、位于支架5之GH71α-1,3-L-葡聚糖苷酶基因 (GH71，ID：120873)、及位于支架5之β-1,3-L-葡聚糖苷酶基因(cel3d，GH3，ID：46816) 所组成之群组。

于部分实例中，本发明之木霉菌SAN后代具有增强的木聚醣酶活性。

于另一具体实施例中，本发明之木霉菌SAN后代可于木聚醣为主的培养基上产生更多的生物原料。

如本文所用者，当提及本发明木霉菌SAN后代之一种或多种有益特性，「增强的」、「增加的」、或「更高的」等词是可互换使用的，是用于比较本发明木霉菌SAN后代之有益特征与对照木霉菌菌株(例如一亲源菌株或一整倍体后代菌株，其不含有D复制片段)之对应特征之差异。例如，一种或多种基因之「增强的」基因表现程度，酵素活性之「增加的」程度、或本发明木霉菌SAN后代之「较高的」生物原料产量，意指该程度增加20％或更多、30％或更多、50％或更多、75％或更多、100％或更多、2倍或更多、3倍或更多、5倍或更多、或10倍或更多，相较于对照菌株而言，如一亲源菌株或一整倍体后代菌株，其不含有D复制片段。该增加或强化可藉由具有技艺者所熟悉之方法判定之。该等方法之示例包含，但不限于蛋白分析、北方或南方杂交法、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酵素连结免疫吸附法，enzyme-linkedimmunosorbent assay)、西方墨点法、或放射免疫分析法(radioimmunoassay；RIA)。于部分具体实施例中，本发明之方法可进一步包含(e)挑选一带有D复制片段之SAN后代，其具有一种或多种本文所述之有益特征。

于吾人研究中，进一步发现丧失非同源性末端接合(NHEJ)基因可稳定节段性复制，即预防本发明SAN后代恢复回整倍体。

具体而言，本发明提供一种产生稳定木霉菌SAN菌株之方法，包含：

(a)将两个具有染色体杂合性之单倍体可交配之木霉菌菌株进行有性杂交，其中该等亲源菌株中至少一者包含一NHEJ基因缺失；及

(b)从步骤(a)中辨识及挑选出一所得之木霉菌SAN后代，其具有NHEJ基因缺失。

「非同源性末端接合」乙词系指一自然、细胞反应，其中双股DNA断裂系藉由两个非同源性DNA片段之直接接合而修复。木霉菌NHEJ基因编码Ku70、Ku80及Lig4，先前分别称作tku70、tku80及tmus53。Ku70及Ku80形成一异二聚体，以及其功能作为位于DSV端点之一分子支架，与其他NHEJ蛋白(如DNA接合酶IV、Lig4)结合。

根据本发明，NHEJ基因可于有性杂交前，自一个或两个亲源菌株中移除，如此，经有性杂交两亲源菌株，即可产生及挑选出具有NHEJ基因缺失之SAN后代。于部分具体实施例中，本文所用之NHEJ基因为tku70或tmus53。基因缺失可藉由该领域所习知之方法进行[16、17]。

根据本发明，带有NHEJ基因缺失之SAN后代可稳定节段性复制一段时间，如2周或更久、3周或更久、4周或更久、5周或更久、6周或更久、或7周或更久。

于部分具体实施例中，第一具交配能力之菌株(支架33及支架M)及第二具交配能力之菌株(支架F及支架X)，至少其中有一者之NHEJ基因是缺失的，接着进行两菌株之有性杂交，经挑选及辨识出所得具有D重复片段，及NHEJ基因缺失之后代。

特定而言，根据本发明，SAN后代具有D复制片段及NHEJ基因缺失，且具有优异的特征，不仅可产生更多之生物原料，亦于较长时间具有更高产量之半纤维素酶(如7 周以上，50天)。请参阅图11B及图11D。

本发明进一步以下列实施例阐述，系用于提供示例目的而非用于限制。该领域具有技艺者应可藉由本发明之揭示，可明了各种于所接露之特定具体实施例中之改变，且仍可获得相似或相近结果者，仍不背离本发明之精神及范畴。

实施例

吾人报告该16颗子囊孢子系藉由减数分裂及两次后减数分裂之有丝分裂生成。值得注意的是，该CBS999.97(1-1)单倍体基因组，相较于该等CBS999.97(1-2)及 QM6a(1-2)，于两个基因组支架中包含节段性重组。由于序列的杂合性，大部分的16 颗子囊孢子基因座(>90％)含有4或8个无法存活之子囊孢子，及相同数量之可存活之节段性非整倍体子囊孢子。一约0.5Mbp之染色体复制片段可增强半纤维素酶之生成。再者，值得注意的，将非同源性末端接合(NHEJ)基因(tku70或连接酶IV tmus53)缺失后，可稳定节段性复制，暗示是NHEJ而非同源性重组，负责整倍体之复原。吾人将此发现应用于生成一突变株，其可生产出比RUT-C30(一种广泛使用的工业菌株，系用于木质纤维素生物质之降解)更多之半纤维素酶。

1.材料及方法

1.1菌株及有性杂交

红褐肉座菌CBS999.97野生型分离单倍体菌株[5、15]，tku70ΔQM6a突变株[16]及tmus53ΔQM6a突变株[17]已于先前研究被报告过。该两个CBS999.97单倍体突变株系藉由将每一个QM6a突变株分别与野生分离株CBS999.97(1-1)进行杂交以生成。相对所生成之子代突变株系与CBS999.97(1-1)或CBS999.97(1-2)菌株回交至少两次。有性杂交之施行方式系如先前研究中所述者[5、15]。

木霉菌有性杂交之施行方式如前述[15]。简言之，于一10公分之麦芽萃取洋菜胶盘(MEA)上，将CBS999.97(1-1)与CBS999.97(1-2)或QM6a杂交。将该MEA盘置于25℃培养，并以持续黑暗方式2-3周，或经12小时光周期(12小时光/暗交替之周期)8-10天方式培养。一带有光强度约80μmol/m²/s之植物培养箱系被用于本研究中。

1.2十六颗子囊孢子分离

为了将子囊孢子(或有性孢子)分离，成熟的十六颗子囊孢子系以手动从基质收集分离而得，并将之转移到一10cm麦芽萃取洋菜胶(MEA)盘之中央。真菌四分体的分离系使用显微操作器以连续地分离及单离出每一个于16颗子囊孢子中之子囊孢子。玻璃纤维针可轻易破碎脆的囊壁，并分离出每一个子囊孢子，使得剩下的部分是完整的。于25℃植物培养后，每一个存活的子囊孢子发芽生成一菌丝体聚落。将每一个菌丝体聚落转移到马铃薯葡萄糖洋菜胶(PDA)盘上，以判定聚落型态及聚落颜色，接着藉由基因型鉴定及aCGH分析以分析其特征。

1.3野生型CBS999.97(1-2)基因组之深度定序及全基因定序

使用GS Rapid Library Prep套组(Roche 454；454Life Sciences,Connecticut,USA)，依制造商之操作手册，从野生分离的CBS999.97(1-2)单倍体中分离出0.5μg基因组DNA，以建立454个定序之散弹枪基因库。所得到之基因库系藉由BioAnalyzer DNA Chip法分析(Agilent Technologies；California,USA)，以及使用Modulus荧光测量仪 (TurnerBiosystems；California,USA)以FAM荧光定量之。于中国台湾中央研究院 生物多样性研究中心之高速定序核心中心进行定序，并使用GS FLX Titanium系统进行之。原始读值从 2.5次定序中取得，全部共873Mb，于五组资料中，中间可读长度介于351至454nt间。全基因定序系以Newbler v.2.5.3(Roche 454)，于单一CPU上执行。初步基因组重组包含1,087片段重迭群，其大小介于500bp至404,555bp，其平均片段重迭群及N50大小，分别为29,833bp及66,873bp。其他全基因定序组装及基因批注系藉由自家的计算机中心执行。组装完成的CBS999.97(1-2)基因组序列可从网络上取得 (http://140.109.32.39/～lab229/contig_ info/index.php)。

为了要评估深度定序的结果，群体批注包含Gene Ontology(GO)分类可从木霉菌基因组数据库v.2.0(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)中取得。使用BLAST 以进行批注，藉此找寻木霉菌(Trichoderma reesei)v.2.0及木霉菌(Trichoderma virens) Gv29-8v2.0之同源基因。基因序列可从联合基因组研究所(JointGenome Institute；JGI) 数据库中下载(http://genome.jgi-psf.org/)；其中QM6a有9,143基因，木霉菌中有12,427 基因。吾人发现8,106个CBS999.97(1-2)及QM6a之同源基因，具有高度的序列相似性(≥ 90％)。其他剩下的基因(<90％)，吾人发现有49个仅存在于QM6a中，且与CBS999.97(1-2) 基因组之基因无任何相似性。

1.4微数组比较基因组杂交法(aCGH)及数据分析

使用标准技术将基因组DNA分离，并藉由Bioruptor Sonicator(Diagenode， UCD-200)，使用75秒(高)及75秒关，共15分钟之反复周期以取得片段，以生成平均DNA 大小为500bp(介于200-1000bp范围)。将片段化之DNA以NanoDrop ND-1000UV-VIS光谱仪定量，以了解gDNA浓度及纯度。使用NimbleGen双色DNA标记套组(Roche NimbleGen,Madison,WI)，将片段化之基因组DNA样本以Cy5或Cy3进行标记。将测试样本的基因组DNA以Cy3终端标记，而CBS999.97(1-1)或QM6(1-2)基因组DNA则以Cy5 标记，以作为一参考标准，藉此测量DNA套数的改变。该Cy5及Cy3标记的基因组DNA 样本遂与客制化的寡核苷酸数组(4×72000构成)杂合；该数组系藉由Roche-NimbleGen 分别基于CBS999.97(1-2)基因组序列及木霉菌v2.0基因组序列所制成[15、18]。

DNA终端标记、杂合及筛选系于中国台湾中央研究院 之分子生物微数组核心研究所执行，系使用NimbleGen系统技术(NG_CGH&CNV_Guide_v7p0)，依供货商之标准操作方法进行之。影像数据系以NimbleScan软件2.6.3版(Roche NimbleGen)以进行处理，以获得原始强度的数据(.pair file)。数据分析及正规化系使用Agilent GeneSpring GX 11.5.1，藉由自家的生物信息中心进行。原始强度规模系使用分位数正规化转换；该正规化是被用于将数组中偏差修正，并使得所有的分布一致化。吾人发现QM6a微数组之aCGH 结果，系与CBS999.97微数组之结果一致，且之后会于Gene Expression Omnibus(GEO) 提交。

1.5基因组-野生型微数组杂合

全RNA分离及基因组-野生型mRNA微数组实验已于先前被报告过[15]。所有实验系以三次技术重复试验进行，且使用至少三组不同的生物复制样本。使用AgilentGeneSpring GX 12.0进行数据分析及正规化。原始强度规模系使用分位数正规化转换；该正规化是被用于将数组中偏差修正，并使得所有的分布一致化。同时应用t-test及倍数改变指针以辨别不同的基因表现程度(P值≤0.05及倍数改变≥1.5)。于菌株丛分析中，使用分层法以进行分层算法，及使用欧式距离法用于相似性的测量。

1.6角瓶震荡培养

以1ml之灭菌的孢子溶液[0.8％NaCl，0.05％Tween 20(Sigma)]，从三天之盘(直径 10cm之培养皿)上收集分生孢子，剧烈震荡后以玻璃绵过滤。将体积调整至OD_600nm等于0.3，并将1ml的孢子悬浮液转移到250ml之锥形瓶中，瓶中含有50ml之 Mandels-Andreotti基础培养基；该培养基系以0.1M柠檬酸-磷缓冲液(pH 5.0)，及1g L^-1蛋白胨及0.33g L^-1尿素制成。将10g L^-1Solka Floc 200(International Fiber Corporation, NorthTonawanda,USA)或桦木木聚糖(Sigma Aldrich,USA)加入作为炭源，以分别诱导纤维素酶或木聚醣酶表现。经三天于持续黑暗中、25℃、于一旋转震荡器(200rpm) 中培养后，将角瓶用于生物原料测定及酵素分析。

1.7生物原料测定

为了测量生物原料，将50ml震荡角瓶培养物，以干式Miracloth(Calbiochem,Darmstadt,Germany)进行过滤，并以蒸馏水冲洗，并以纸巾擦干。将真菌的菌丝体收集，以液态氮冷冻、存于-80℃备用。为了进行总蛋白之量化，将真菌样本溶解于5ml 之0.1N NaOH中。将溶液以数字符音波降解器(Branson)将之碎破，所使用之循环为30％ 6分钟(30秒开及30秒关)。将样本接着于室温培养3小时，并以5251×g离心10分钟。上清液的蛋白浓度系以修饰的Lowry蛋白分析法测定，使用牛血清白蛋白作为标准。

1.8酵素分析

为了测定内源的1,4-β-聚葡萄糖酶(纤维素酶)之活性，将上清液以1:2至1:10之比例稀释，并加入Azo-CM-纤维素溶液中(S-ACMCL；Megazyme International,Ireland)。此步骤系根据制造商之操作建议进行。Azo-CM-纤维素酶为一种染色的多糖，其RemazolBrilliant Blue R浓度约为每20个糖残基有一个染剂分子(Megazyme International)。此方法较滤纸法(如DNS法)要更敏感(50-100倍)。

为了测定内源的1,4-β-木聚糖酶(木聚糖酶)之活性，将上清液以1:2至1:10之比例稀释，并于40℃加热5分钟。将木聚醣混合酶AX试验锭受质(T-XAX200；MegazymeInternational)加入上清液中(0.5mL)，并于40℃培养10分钟。加入10ml中止溶液(2％Trizma Base,pH～9)以停止反应。将样本以2000×g进行离心10分钟，并于590nm吸光质进行测量。黑曲菌木聚糖酶(～300mU/mL)系作为一对照组，并按照制造商所使用之方法进行。

2.结果

2.1于木霉菌中之四个减数分裂产物进行两次进一步的有丝分裂

吾人应用酵母菌四聚体分离，以连续从子囊分离出16颗子囊孢子于洋菜胶盘上。根据每一个子囊孢子于子囊中之线性序列将之编号，并于25℃、黑暗中培养两天，以判定孢子是否存活。为了避免交叉污染，将每一个存活的聚落个别转移至另一个盘中 (图1A)。将该16颗子囊孢子依存活性、聚落型态、聚落颜色进行比较及分类(图1B-图 1E)，PCR基因型分析(图2)及使用NimbleGen微数组之aCGH分析[15、18](图3)。用于基因组PCR之引子如下所示：

表4

从每一个16颗子囊孢子中所得之16颗子囊孢子可被分类成四类线性排列的组别，且每一组含有4个基因上相同的子囊孢子。此发现显示16颗子囊孢子系藉由减数分裂，并接着两轮的后减数之有丝分裂所产生。藉由将发育中之子囊以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色，吾人使用荧光显微镜亦发现两次减数分裂以及两次进一步的有丝分裂(图4)。

2.2于减数分裂中诱导节段性非整倍体

吾人发现将CBS999.97(1-1)与CBS999.97(1-2)进行有性杂交(图1B)或QM6a(1-2)进行有性杂交(图1C)，可产生高比例的无法存活的子囊孢子。该等16颗子囊孢子大多数 (>90％，n≥30)含有8个或12个存活的子囊孢子。该两个纤维素酶过度表现的突变株， RUT-C30(图1D)及QM9414(图1E)，亦可与CBS999.97(1-1)交配，但常产生带有0或4 个可存活的子囊孢子的16颗子囊孢子。

QM6a具有7个染色体，且其基因组大小为34.1Mb。木霉菌v2.0QM6a基因组数据库(联合基因组研究所，USA)包含89个支架及97个片段重迭群[1]。吾人应用aCGH技术以鉴定基因组野生型基因套数目。aCGH结果显示两个CBS999.97亲源的单倍体株为整倍体(图3A)。相反地，所有从8个存活的子囊孢子产生之存活的后代(图3B)具有一套源自于全长支架27(134个基因及～424kb)、支架28之3’端(12个基因，～31kb)，及支架36 之5’端(15个基因，～54kp)(图5)。藉由深度定序CBS999.97(1-2)基因组，吾人发现该复制的区域(系指「D片段」，如图6及图7所示)于该三个支架(27、28、及36)中为连续的片段。该三个支架接着重组为一个较长的支架，系指支架「M」(图3B、图6及图7)。基因组PCR、定序、南方墨点分析进一步显示支架M位于端粒附近，由于支架M的3’段与一重复的六核苷酸序列相连接，TTAGGG，此即为QM6a之端粒重复序列[1]。吾人亦发现所有于16颗子囊孢子中之孢子具有16颗存活的子囊孢子为整倍体，且不具有 D复制片段(图3C)。相反的，野生型CBS999.97 16颗子囊孢子带有之12颗存活孢子，有 8颗为整倍体子囊孢子及4颗带有D复制片段之SAN子囊孢子(图3D-图3F)。

aCGH结果进一步显示，于一新基因(ID 112288)之第二内含子中，假设的DNA双股断裂位置(支架36：54323-54324bp)负责片段性复制残基。额外的PCR及定序分析显示，于野生分离的CBS999.97之两个单倍体基因组中，该新颖QM6a基因之第一个外显子(支架36：53664-53943bp)是被去除的(图7)。值得注意的，比较野生分离 CBS999.97(1-2)及QM6a基因组，野生分离CBS999.97(1-1)基因组存在大量的节段性转位：(1)支架33之5’端(1-33，249bp；系指「L」片段)与支架M非复制区域连接以形成一新的支架「X」于CBS999.97(1-1)中；(2)支架33的3’端(33250-297,000bp)与支架M的 D片段物理性连接以形成一新的支架「F」于CBS999.97(1-1)中(图6及图7)。为了判定于减数分裂中，是否染色体杂合性与节段性复制有关，吾人将两个野生分离之单倍体CBS999.97(1-1、F、X)及CBS999.97(1-2、M、33)杂交以生成两个新的单倍体 CBS999.97(1-1、M、33)及CBS999.97(1-2、F、X)(图8)。于该等单倍体中之四个支架的存在系由诊断型PCR分别使用4个专一引子(A-D)测定之(表5)。

表5

引子名稱	序列
		A	5’CTTCCAGCCTAAGTACTC3’
B	5’GTCGATCGTGCTAATGAAG3’
		C	5’CAAGGCTATTATCCGCAG3’
D	5’CTCTGAGGGGATTAGAAG3’

吾人发现由杂交CBS999.97(1-1,F,X)及CBS999.97(1-2,F,X)，或CBS999.97(1-1,M,33)及CBS999.97(1-2、M、33)所产生之16个子囊孢子皆存活。于任何相关菌株中，将非同源性末端接合(NHEJ)基因，tku70或DNA连接酶IV tmus53去除不会影响减数分裂、子囊孢子数目或子囊孢子的存活率(表6)。

该等结果显示，于减数分裂期间，两对同源性支架(M/F及33/X)间的同源性重组于SAN子囊孢子的形成有关。因此，吾人提出一模式(图6)，描述如何藉由同源重组以得到存活的SAN子囊孢子，且具有两个D片段，但不具有L片段，以及带有两个L片段之无法存活的子囊孢子。此假设与吾人aCGH结果(图9)一致，所有SAN子囊孢子(D2、D3 及D5)缺乏L片段。

2.3南方墨点分析

为了进一步确认D复制片段之有无，遂进行南方墨点分析。

以BsmBI将木霉菌基因组DNA酶切，于0.8％洋菜胶上电泳，以³²P-标记之DNA探针进行南方墨点分析，接着使用Fujifilm影像分析仪成像。DNA探针(304bp)(SEQ ID NO:9)以PCR增幅，所使用之两个寡核苷酸引子为PA7543 (5′-AGCTACATGAGATCCTGCAT)(SEQ ID NO:10)及PA7544 (5′-TCAGGTGCACTCTGCACGAA)(SEQ ID NO:11)。

表7

南方墨点藉由曝露在X光片上得以影像化(GE Healthcare,USA)。分子量标记位于左侧。该CBS999.97(1-1)亲源单倍体株具有443bp片段(SEQ ID NO:12)；而CBS999(1-2) 亲源单倍体株具有1512bp片段(SEQ ID NO:13)。该SAN后代具有该两个片段。经恢复成整倍体(RTU)后，仅有433bp片段遗失。请参阅图12。

2.4先代的木霉菌基因组可能含有支架M及支架33

具有性交配能力之CBS999.97菌株系从一位于法国盖亚那之蓄水湖中分离出来[23]，然而QM6a系于第二次世界大战时于所罗门群岛发现。许多其他非CBS999.97之单倍体菌株是从其他不同的地理位置所分离的[5]。于此使用诊断式PCR以研究该四个支架(M,33,F,X)于9个代表性之非CBS999.97分离株中之分布情形，其分别从法国盖亚那、巴西、印度尼西亚、及新喀里多尼亚所分离。使用前述四组引子(A-D)(表2、表5 及图7)，吾人可于8个分离株中侦测到支架33(除了G.J.S 84-473以外)，及可于6个分离株中侦测到支架M(除了G.J.S 84-473、G.J.S 86-410及G.J.S 93-23以外)。有趣地，支架F 及支架X于该9个非CBS999.97分离株中皆无法测得(表8)，指出，相较于 CBS999.97(1-1)，该等非CBS999.97分离株之基因组可能与该等QM6a及CBS999.97(1-2) 更为相似。

表8

藉由有性杂交及单一子囊孢子单离实验进一步验证此假设：首先，CBS999.97(1-2, M,33)可与3个法国盖亚那分离株(G.J.S.86-404,86-410及G.J.S.84-473)交配，且产生具有16颗可存活的子囊孢子于子囊中，虽然吾人诊断式PCR方法无法测得支架M及支架 33于G.J.S.84-473中。第二，藉由有性杂交CBS999.97(1-1,M,33)与G.J.S.89-7(Brazil,Para)、G.J.S.97-178(Brazil,Para)、G.J.S.93-23(New Caledonia)及G.J.S.85-236(Indonesia,Celebes)可生成16颗存活的子囊孢子于几乎所有所生成的子囊中(表9)。

表9

*:诊断式PCR无法分别于G.J.S.84-473及G.J.S.93-23测得M、F、33或X。

因此，吾人推测先代木霉菌基因组可能含有支架M及支架33，以及支架F及支架X，之后于法国盖亚那进化，其于支架M及支架33间发生不一致之DNA重组。有趣的是，该经检测之9个非CBS999.97分离株可能仅与CBS999.97(1-1)或CBS999.97(1-2)发生有性杂交，而非与彼此发生交配(表10)。

表10

有性杂交CBS999.97(1-1)与RUT-C30(图1D)及QM9414(图1E)多生成带有0或4颗存活的子囊孢子之子囊，此结果可能与序列杂合性有关。如前述，该两个纤维素酶过度产生的突变株经过多次的物理性及化学性突变导致具有已存在多种突变、缺失及染色体重组[2、3]。

2.5节段性复制影响局部及全面性的转录作用

QM6a基因组之检验证明发现，许多编码该醣类活性酵素基因(CAZymes)为非随机散布于多个基因簇中[1]。该CAZymes可切割、建构及重组寡-及多醣类[24]。多数 CAZyme基因于该等基因簇中编码糖苷水解酶，其用于降解木质纤维素及植物细胞壁。先前转录学研究亦发现邻近或附近的邻近基因可于于支架1、6、28及29之4个CAZyme 基因簇中共同表现[1]。值得注意的是，于支架28之CAZyme基因簇位于D片段，且包含一内源的-β-1,4-木聚糖酶基因(ID 69276)、β-甘露糖苷酶(ID 69245)及该cip2葡糖醛酸酯酶基因(ID 123940)。该D片段亦于支架27(ID 123818)含有xyn2木聚糖酶II基因。该4 个基因皆编码具有半纤维素酶活性之酵素[24]。的确，相较于整倍体后代或其亲源的单倍体菌株，带有两个D片段之后代存在较高的木聚糖酶活性(图10A)。

接着，藉由比较5个具有复制片段(D1-5)之后代的转录学图谱及其亲源株(N0)及6个整倍体后代(N1-6)，吾人检验是否该节段性复制会影响全面的转录作用。热图及分簇分析结果显示于该5个带有复制片段之后代的转录学图谱与该7个整倍体对照菌株的图谱不同(图10B)。令人意外地，节段性复制不仅增强该复制基因之局部转录，亦全面性促进许多非复制基因的转录(图10C)。于该3个SAN菌株(D2、D3及D5)具有较高之木聚糖酶活性(图10A)，其中相较于存在于该6个整倍体后代菌株者(N1-N6；图10C)，该3 个SAN菌株有五个CAZymes之转录作用系中度的、显着的增强，包含xyn2(3.5-倍，P＝ 0.010；支架27，ID：123818)、β-甘露糖苷酶(3.4-倍，P＝0.019；支架28，ID：69245)、 GH54α-L-阿拉伯呋喃糖酶(2.3-倍，P＝0.019；支架2，ID：55319)、候选的GH71α-1,3-L- 葡聚糖苷酶(2.5-倍，P＝0.030；支架5，ID：120873)及cel3d GH3β-1,3-L-葡聚糖苷酶 (1.9-倍，P＝0.009；支架5，ID：46816)。

于该5个节段性非整倍体菌株(D1-5)，至少有42个已批注的或可能的基因(包含23个CAZymes、7个转录因子、8个醣类运输子、4个Gcn5-相关的N-乙酰基转移酶)，较存在于该7个整倍体对照菌株之基因(N0及N1-6)，具有至少增高两倍(p<0.05)转录量之现象。请参阅表11。

表11节段性基因组复制诱导局部及全身性转录增幅

*於支架1、6、28及29之CAZyme基因簇中之基因为Martinez et al,2008所报告过。

#该等后述已注解CAZyme基因，包含糖苷水解酶基因(GHs)、醣类酯解酶(CEs)、及多醣解离酶(PLs)(Hakkinen et al,2012)。

2.6于木聚醣为基底之培养基上，节段性复制提供生长优势

DNA套数的改变是很有害的[25]。该aCGH结果指出从野生型CBS999.97所产生之SAN后代，经过2-3周之无性繁殖后，于富含葡萄醣培养基上培养，总是会回复成整倍体状态(图11A)。于多种微生物上之研究也显示DNA套数的改变可为有益的，于特定压力下可增加存活[8、11、12、25-30]。吾人发现，当培养于木聚醣为基底的培养基上时，相较于该亲源CBS999.97整倍体菌株及回复成整倍体(RTU)突变株者，将该SAN突变株培养于木聚醣为基底的培养基上时可产生更多的生物原料(图11B)。于该RTU突变株中缺乏L片段(图9，下两图)，吾人可结论D复制片段，而非L片段缺失，与在木聚醣为基底的培养基上之生长优势有关系。有趣地，该SAN株亦较CBS999.97整倍体单倍体者于稻秆上长的更好(图11C)。结论是该等结果显示减数分裂所造成的节段性复制显然提供一优势，可短暂地增强降解及利用木质纤维素生物原料之能力。

2.7NHEJ基因缺失可预防SAN恢复成整倍体

值得注意地，吾人发现将tku70或tmus53去除可稳定节段性复制高达7周以上(图11A)。吾人亦发现两个tmus53ΔSAN突变株(WTH1994及WTH4503)，较野生型及 tmus53Δ整倍体株，不仅产生更多的生物原料(图11B)，且可维持半纤维素酶高生产量长达7周以上(图11D)，系指出NHEJ，而非同源重组，调控回复成整倍体之机制。该 tmus53ΔSAN株(WTH1994)，较工业株RUT-C30，可分别分泌多于2倍以上之木聚糖酶 (图11E)以及约0.8倍之纤维素酶(图11F)。于先前结果一致[31]，RUT-C30较QM6a多分泌约3倍之纤维素酶(图11F)。该等结果显示该tmus53ΔSAN突变株具有有用的工业应用潜力。

表12非同源性末端接合基因的丧失可预防节段性非整倍体(SA)恢复成整倍体(E)¹

1.节段性非整倍体(SAN)及整倍体(E)系由微阵列比较基因组杂交法(aCGH)实验所判定。

2.ND表示无法判定。

3.摘要及讨论

本研究显示木霉菌有性发育及基因组可塑性之至少5个新颖特征。

首先，木霉菌经由减数分裂及另外两次之有丝核分裂以产生具有16颗子囊孢子之子囊[4]。有趣的是，大多其他的子囊孢子真菌，分别经由减数分裂，产生具有4颗子囊孢子之子囊(如酿酒酵母)；或经由减数分裂及一次的后减数分裂产生8颗子囊孢子(如粉色面包霉菌)。

第二点，与其他许多丝状真菌相似，具有性交配能力之CBS999.99野生分离株常产生无法存活的子囊孢子。两个同源的单倍体菌株(如CBS999.97)可于自然环境中发生有性杂交，以及该两个CBS999.97单倍体基因组之染色体杂合性与产生无法存活的子囊孢子有关，让人感到有趣的提出假设，或许木霉菌可藉由两次后减数分裂，以增加每个子囊中之整体子囊孢子数量，以克服此一缺陷。

第三点，吾人结果显示先代木霉菌基因组，如CBS999.97，含有支架M及支架33。于支架M及支架33间发生不均等的DNA重组可产生含有支架X及支架F之 CBS999.9(1-1)单倍体基因组。因此，吾人推测G.J.S.85-249(1-1,M,33)基因组可能于其他染色体区域含有不同的同源性序列或重组现象，因为将G.J.S.85-249(1-1,M,33) 与无论是CBS999.97(1-1,M,33)或CBS999.97(1-2,F,X)进行有性杂交，皆导致带有4、8 或12颗无法存活的子囊孢子的子囊(表2)。藉由有性杂交两个带有染色体杂合性之单倍体菌株(一个含有支架33+M，及另一个含有支架F+X)，一种带有D复制片段之SAN后代具有增强的醣类活性酵素(CAZymes)之表现程度或酵素活性，或可产生更多的生物原料产生。

第四点，许多木霉菌品种被发现与无性型生物一样存在于土壤中，其可作为对植物有益的真菌[32]。相反地，该有性型的肉座菌品种常被发现于脱皮的木头或腐木真菌上(如木耳、暗礁菌、或蘑菇)。吾人于本研究中所述之SAN有性后代具有对于木质纤维素生物原料有较好的降解能力，可提供其于自然环境中适应性优势，尤其是于聚落化之早期(生长时之前两周)。

最后，本发明之一重要发现在于将NHEJ基因去除可预防SAN后代恢复成整倍体。于多种微生物及哺乳动物细胞中之研究显示，SAN及非整倍体已知可于多数正常细胞造成增生性缺陷。除非经过特定压力，或于一与增强的增生能力有关之情况下(如癌细胞)，该SAN及非整倍体细胞可准备进行RTU[8、25、27-30]。亦发现泛素蛋白酶体降解于抑制SAN及非整倍体之不良反应中扮演重要角色[33]，仍不清楚的是怎样的DAN 修复及/或重组机制牵涉于RTU中。吾人结果证明NHEJ修复路径于木霉菌中促进RTU 中扮演重要脚色。本研究一个令人意外的发现为该tmus53ΔSAN突变株具可期的工业化潜力，可用于增加的木质纤维素生物原料降解。

序列信息

引子A(SEQ ID NO:1)

5′-CTTCCAGCCTAAGTACTC-3′

引子B(SEQ ID NO:2)

5′-GTCGATCGTGCTAATGAAG-3′

引子C(SEQ ID NO:3)

5′-CAAGGCTATTATCCGCAG-3′

引子D(SEQ ID NO:4)

5′-CTCTGAGGGGATTAGAAG-3′

藉由引子C及B增幅的片段(SEQ ID NO:5)

(547bp，对应于支架33:32892-33438bp)

引子C+B

CAAGGCTATTATCCGCAGTGGGACAATTGTGCTTTGATGTTGGTTCGCTCTACAC TGGGTCAAACATGAACAGGCAGTGGAGGGGGGTGTGATGAGAATGAAACCAAG AGCCAACCTGTGGATCAATTTCAACGTGGGGCGATGTGCATGTAGGGACTCCGA AGTGTTTTCGGGACGGAACCGGCCTAAACAAGACCATGTTCGACGGTTTATTAAGCAGGCAAATATCGACAGGCATGGCGTATGTCAAGACCTAATCAATCATTGTCCTG GTGAGGCCTATACCTGCCGTTGTGGAAAGATACTCGCGATGTATTTTTTTCTTCTG TCTCTGTCATCGATACTTGCCTACTGGATCATCAAGACGGCCGTCTCTTCAAACA AAGATCGACTTTATGCCCGCCGAAAAGCATGTCAACCCTGCGCGCGCCTACCAC AAACTGAAAGGGTCATTGGCTATTCTTTGTTCAAGCAAGATGCTACCATTGCACG CCAGGGGAGGTCCTTGCAAACAGCCCAAGACCGCTTCCGTTTGCTCGGTGACAC G

藉由引子A及D增幅的片段(SEQ ID NO:6)

(467bp，对应于支架36:54048-54514bp)

引子A+D

CTTCCAGCCTAAGTACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGT TACTGCATTGTAAAGCCAAACACTGCGGGCTTCCATATGGGAAATTGATCTATCT CAATAGCGCTCAGTAGGTACGAAGAGTAGGCATCCCTCGAGACAAACCCTCCTC CACGAGCCCCTCAAGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAACGCTGACT GCACATCAGACGCACTTGGTGCTGATTCTCGCTGCAGAGGAGTGAGGTACCCGT ATCACCCTACTCCAATCGCCTGAGAAGCTTGTATCTTGCTCAACATTCCGGAGCA GCACCTACATGTACTACATGTGAATCGCCCTATATCTCATTCTGACCGGAGAACG AGACAGCACCCACGTATTCATACCTATTTACTTTCTTCTGTTTTTTACCTCTTCTCGATCTTCTTTTCTTCTAATCCCCTCAGA

藉由引子A及B增幅的片段(SEQ ID NO:7)

(462bp，对应于支架36:54048-54320bp(底线)及支架33:33250-33438bp(双底线))

引子A+B

CTTCCAGCCTAAGTACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTA AAGCCAAACACTGCGGGCTTCCATATGGGAAATTGATCTATCTCAATAGCGCTCAGTAGGTACGAAGAGTAGGCAT CCCTCGAGACAAACCCTCCTCCACGAGCCCCTCAAGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAACGCTGACTG CACATCAGACGCACTTGGTGCTGATTCTCGCTGCAGAGGAGTGAGGTACCCGT

藉由引子C及D增幅的片段(SEQ ID NO:8)

(552bp，对应于支架33:32892-33249bp(底线)及支架36:54321-54514bp(双底线))

引子C+D

CAAGGCTATTATCCGCAGTGGGACAATTGTGCTTTGATGTTGGTTCGCTCTACACTGGGTCAAACATG AACAGGCAGTGGAGGGGGGTGTGATGAGAATGAAACCAAGAGCCAACCTGTGGATCAATTTCAACGTGGGGCGATG TGCATGTAGGGACTCCGAAGTGTTTTCGGGACGGAACCGGCCTAAACAAGACCATGTTCGACGGTTTATTAAGCAG GCAAATATCGACAGGCATGGCGTATGTCAAGACCTAATCAATCATTGTCCTGGTGAGGCCTATACCTGCCGTTGTG GAAAGATACTCGCGATGTATTTTTTTCTTCTGTCTCTGTCATCGATACTTGCCTACTGGATC

DNA探针之核苷酸序列(SEQ ID NO:9)

AGCTACATGAGATCCTGCATACCGTATCTTTGTCCTGGTAAACTATTGTTTCGTAG TTCAAGAGGACATTCTGAAGGAACACCGAGAGCATTTCTTCCAGCCTAAGTACTC TGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTAAAGCC AAACACTGCGGGCTTCCATATGGGAAATTTTCTTATTTCAATAGCGCTCAGTAGG TACGAAGAGTAGGCATCCCTCGAGACAAACCCTCCTCCACGAGCCCCTCAAGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAA

引子PA7543(SEQ ID NO:10)

AGCTACATGAGATCCTGCAT

引子A7544(SEQ ID NO:11)

TCAGGTGCACTCTGCACGAA

443bp条带之核苷酸序列(SEQ ID NO:12)

TTAAATCCCACAACTACCTATTACTACATGTACATTTGATCAATTGCAAGCCGTG ACCGAGCTACATGAGATCCTGCATACCGTATCTTTGTCCTGGTAAACTATTGTTTC GTAGTTCAAGAGGACATTCTGAAGGAACACCGAGAGCATTTCTTCCAGCCTAAG TACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTAA AGCCAAACACTGCGGGCTTCCATATGGGAAATTTTCTTATTTCAATAGCGCTCAG TAGGTACGAAGAGTAGGCATCCCTCGAGACAAACCCTCCTCCACGAGCCCCTCA AGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAACGCTGACCGCACATCAGACGC ACTTGGTGCTGATTCTCGCTGCAGAGGAGCGAGGTACCCCTATCAAGACGGCCGTCTCT

1512bp条带之核苷酸序列(SEQ ID NO:13)

TTAAATCCCACAACTACCTATTACTACATGTACATTTGATCAATTGCAAGCCGTG ACCGAGCTACATGAGATCCTGCATACCGTATCTTTGTCCTGGTAAACTATTGTTTC GTAGTTCAAGAGGACATTCTGAAGGAACACCGAGAGCATTTCTTCCAGCCTAAG TACTCTGCTAAAGGGCGTATCTTGTAATGTATACTTTAACTGTTACTGCATTGTAA AGCCAAACACTGCGGGCTTCCATATGGGAAATTTTCTTATTTCAATAGCGCTCAG TAGGTACGAAGAGTAGGCATCCCTCGAGACAAACCCTCCTCCACGAGCCCCTCA AGTGGTAGGTAGTTCAGGTGCACTCTGCACGAACGCTGACCGCACATCAGACGC ACTTGGTGCTGATTCTCGCTGCAGAGGAGCGAGGTACCCCTATCACCCTACTCCA ATCGCCTGAGAAGCTTGTATCTTGCTCAACATTCCGGAGCAGCACCTACATGTAC TACATGTGAATCGCCCTATATCTCATTCTGACCGGCGAACGAGACAGCACCCACC ACGTATTCATGCCTATTTACTTTCTTCTGTATTTTACCTCTTCTCGATCTTCTTTTC TTCTAATCCCCTCAGAGCCTCAACAACCTCCACCTCTTTCTGCATCAGCACACGA GTGACATCCTGCATCTTCCACACCATCAGATACGTTGGTCCTCCTTTTAAGAAAG CTACAAAACTTGTAAGAAATCTTCACTTAAGGTACTGAGAGGTTCTTGTTTCTTT ATGCTACAGTCCTTCGAGATAACTGACACATAGTGTTTCATTCAGCATCGCTTCC ATTGCGCTCGTTTTCTCGGCTCACCTCAAAGACATCTCAGCCATCTTGGAGGCCA AGAGCAAGATATCAAACAATCTTCTCTTTGAACTGGTGGCAATGAGCAGCGATA GCTATTGGATTGTTCCTCCTCAACCCCCGGGTGGTGGCACGTGGAAAGGCTGTGC TCTGCTCAAGAAGCCAGATGGAGGAGATTTCGTGCTATTTTCTCCCAATGCCGTG CATCTGAGTGCGATGCTCCAGGTGCATGACGCGCACCAAGCATCTGTCGTCAGTA ATGCATCTCAGTCGACCTCACAAGACAATGAGATGACTGAGTTCATGGTAATGG GACGATGCAGACATTTGTTGGATGGCTATTCGCACACGAACCCTCAAAGCTCATC CGGACAAATGGCAGAGAGCTTGAACAGGCTACATGCCGATTTGAAAGGAACAAGGTCCCGAGGGCAGAAGTTCATCACTGCAGCATACGTCGGCTTCGACTCCTGCATG CAGGGTCCTGTCTTTGCCAGGGCGGCTAAAGATGCGGCCAGCTCCAACCCCTCCA AATCGATCGCTTCGAATGAAGCAAATCAGTCAAGAGGGTCAAACGGTATCCTTG ACCTGAAGGATCTGAGCTTCAGTTGTGGCTCTGCGTCCTCTTCTGTGGGACTGGGATTCATTCCACATTATGCAGTAACGTCTCG

参考文献

1.Martinez D,Berka RM,Henrissat B,Saloheimo M,Arvas M,et al.(2008)生质降解真菌木霉菌(Trichoderma reesei(syn.Hypocrea jecorina))的基因定序及分析Nat Biotechnol 26:553-560.

2.Peterson R,Nevalainen H(2012)木霉菌(Trichoderma reesei RUT-C30)--菌种的三十年发展Microbiology 158:58-68.

3.Vitikainen M,Arvas M,Pakula T,Oja M,Penttila M,et al.(2010)具有提升的纤维酶产生性质的木霉菌菌种的数组比较基因杂合分析BMC Genomics 11: 441.

4.Samuels GJ,Petrini O,Manguin S(1994)施韦尼兹肉座菌(Hypocreaschweinitzi)及其木霉属变形真菌的行态学及具分子特性分析.Micologia 86:421-435.

5.Seidl V,Seibel C,Kubicek CP,Schmoll M(2009)工业主力木霉菌(Trichoderma reesei)的有性生殖Proc Natl Acad Sci U S A 106: 13909-13914.

6.Cole F,Keeney S,Jasin M(2010)减数分裂DSB蛋白质的演化转变：不只是Spo11基因Genes Dev 24:1201-1207.

7.Fraser JA,Huang JC,Pukkila-Worley R,Alspaugh JA,Mitchell TG,et al.(2005) Chromosomal translocation and segmental duplication in新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的染色体转位及节段性复制Eukaryot Cell 4: 401-406.

8.Ni M,Feretzaki M,Li W,Floyd-Averette A,Mieczkowski P,et al.(2013)单性及异性减数生殖在酵母菌新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)重新产生非整倍体及表型多样性PLoS Biol 11:e1001653.

9.Wittenberg AH,van der Lee TA,Ben M'barek S,Ware SB,Goodwin SB,etal. (2009)减数分裂在单倍体真菌植物病原禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)启动特殊的基因体可塑性PLoS One 4:e5863.

10.Goodwin SB,M'Barek S B,Dhillon B,Wittenberg AH,Crane CF,et al.(2011) 真菌小麦病原禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)的完成基因体显示分散体结构(dispensome structure)、染色体可塑性及隐形致病机制PLoS Genet 7:e1002070.

11.Tegtmeier KJ,VanEtten H(1982)红球丛赤壳菌(Nectria haematococca)经选择性状的基因研究72:604-607.

12.Taga M,Murata M,VanEtten HD(1999)藉由原位杂合的荧光显现丝状子囊菌属的红球丛赤壳菌(Nectria haematococca)中的有条件分散的染色体 Fungal GenetBiol 26:169-177.

13.Coleman JJ,Rounsley SD,Rodriguez-Carres M,Kuo A,Wasmann CC,et al.(2009)红球丛赤壳菌(Nectria haematococca)的基因体：多余的染色体对于基因扩展的贡献(PLoS Genet 5:e1000618.

14.Schmoll M,Seibel C,Tisch D,Dorrer M,Kubicek CP(2010)子囊真菌的新类型胜肽费洛蒙先驱物Mol Microbiol 77:1483-1501.

15.Chen CL,Kuo HC,Tung SY,Hsu PW,Wang CL,et al.(2012)蓝光作为调节木霉菌(Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei))有性生殖的双面剑PLoS One 7:e44969.

16.Guangtao Z,Hartl L,Schuster A,Polak S,Schmoll M,et al.(2009)基因靶向于非同源性末端接合缺陷的木霉菌(Hypocrea jecorina)J Biotechnol 139: 146-151.

17.Steiger MG,Vitikainen M,Uskonen P,Brunner K,Adam G,et al.(2011)有利于同源整合及利用可重复使用的双向可选择性标记之木霉菌(Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei))转形系统Appl Environ Microbiol 77: 114-121.

18.Tisch D,Kubicek CP,Schmoll M(2011)光导蛋白类似蛋白PhLP1影响木霉菌(Trichoderma reesei)糖苷水解酶及光反应的调节BMC Genomics 12: 613.

19.Penttila M,Nevalainen H,Ratto M,Salminen E,Knowles J(1987)分解纤维素的丝状真菌木霉菌(Trichoderma reesei)可重复使用的转形系统Gene 61: 155-164.

20.Mantyla AL,Rossi KH,Vanhanen SA,Penttila ME,Suominen PL,et al.(1992) 野生型及突变型木霉菌(Trichoderma longibrachiatum(reesei))菌种的电泳核型分析Curr Genet 21:471-477.

21.Herrera-Estrella A,Goldman GH,van Montagu M,Geremia RA(1993)对于木霉属菌的解析染色体的电泳核型及基因分配Mol Microbiol 7:515-521.

22.Jung MK,Ovechkina Y,Prigozhina N,Oakley CE,Oakley BR(2000)使用贝塔-D-葡聚糖酶取代Novozym 234作为免疫荧光及原生质化的用途Fungal Genet Newsletter47:65-66.

23.Lieckfeldt E,Kullnig C,Samuels GJ,Kubicek CP(2000)来自南美土壤的木霉菌(Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei))的有性胜任、蔗糖及硝酸盐吸收的菌株Mycologia 92:374-380.

24.Hakkinen M,Arvas M,Oja M,Aro N,Penttila M,et al.(2012)在木质纤维基质存在下木霉菌CAZy基因的重新诠释及转录Microb Cell Fact 11:134.

25.Tang YC,Amon A(2013)基因复制数改变：成本利益分析Cell 152:394-405.

26.Gresham D,Desai MM,Tucker CM,Jenq HT,Pai DA,et al.(2008)在酵母菌对于受控制的营养限制环境的演化适应谱系及动态PLoS Genet 4: e1000303.

27.Ni M,Feretzaki M,Sun S,Wang X,Heitman J(2011)真菌的性别Annu RevGenet 45:405-430.

28.Sheltzer JM,Amon A(2011)非整倍体谬论：不正确的核型的成本及利益Trends Genet 27:446-453.

29.Chen G,Bradford WD,Seidel CW,Li R(2012)Hsp90压力可透过非整倍体诱导产生快速细胞适应Hsp90stress potentiates rapid cellular adaptation throughinduction of aneuploidy.Nature 482:246-250.

30.Chang SL,Lai HY,Tung SY,Leu JY(2013)动态大规模染色体重组在酵母菌族群激起快速适应PLoS Genet 9:e1003232.

31.Ghosh A,Ghosh BK,Trimino-Vazquez H,Eveleigh DE,Montenecourt BS(1984) 来自木霉菌(Trichoderma reesei)高纤维素分解突变型Rut-C30的纤维素酶分泌Arch Microbiol 140:126-133.

32.Mukherjee PK,Horwitz BA,Herrera-Estrella A,Schmoll M,Kenerley CM(2013)基因体世代的木霉属研究Annu Rev Phytopathol 51:105-129.

33.Torres EM,Dephoure N,Panneerselvam A,Tucker CM,Whittaker CA,et al.(2010)非整倍体奈授图变的鉴定Cell 143:71-83.

Claims (20)

1.一种用于制备木霉菌节段性非整倍体菌株之方法，包含下列步骤：

(a)辨识及挑选木霉菌第一菌株，其具交配能力，且其基因组中带有支架33及支架M；

(b)辨识及挑选木霉菌第二菌株，其具交配能力，可与步骤(a)之第一菌株交配，且其基因组中带有支架F及支架X；

(c)有性杂交步骤(a)之第一菌株与步骤(b)之第二菌株；及

(d)从步骤(c)中辨识及挑选节段性非整倍体(SAN)后代，其基因组中具有D复制片段，其中

支架33包含：

(ⅰ)支架33之5’端，33kb(称作L片段)，及

(ⅱ)支架33之3’端，171kb(称作33(3’)片段)；

支架M包含：

(ⅰ)D片段，包含：

支架28之3’端，长度约37kb(称作28(3’)片段)，

全长的支架27，长度约427kp，及

支架36之5’端，长度约52kb(称作36(5’)片段)，以及

(ⅱ)非D片段，包含：

支架36之3’端，长度约83kb(称作36(3’)片段)，以及

支架28之5’端，长度约370kb(称作28(5’)片段)；

支架F包含：

(ⅰ)D片段及

(ⅱ)33(3’)片段；及

支架X包含：

(ⅰ)L片段及

(ⅱ)非D片段。

2.如权利要求1之方法，其中该第一菌株具有MAT1-1基因座，及第二菌株具有MAT1-2基因座，或该第一菌株具有MAT1-2基因座，及第二菌株具有MAT1-1基因座。

3.如权利要求1之方法，其中步骤(a)，该第一菌株藉由聚合酶连锁反应(PCR)分析，以判断出其基因组中是否存在支架33及支架M来辨识。

4.如权利要求3之方法，其中该PCR分析系使用由引子C及引子B所组成之第一引子对，以判断支架33于第一菌株之基因组中存在与否，或使用由引子A及引子D所组成之第二引子对，以判断支架M于第一菌株之基因组中存在与否，其中所述之引子A由SEQ ID NO:1所组成，所述之引子B由SEQ ID NO:2所组成，所述之引子C由SEQ ID NO:3所组成，及所述之引子D由SEQ ID NO:4所组成。

5.如权利要求1之方法，其中步骤(a)，该第二菌株藉由聚合酶连锁反应(PCR)分析，以判断出其基因组中是否存在支架F及支架X来辨识。

6.如权利要求5之方法，其中该PCR分析系使用由引子A及引子B所组成之第三引子对，以确认支架F于第二菌株之基因组中存在与否，或使用由引子C及引子D所组成之第四引子对，以确认支架X于第二菌株之基因组中存在与否，其中所述之引子A由SEQ ID NO:1所组成，所述之引子B由SEQ ID NO:2所组成，所述之引子C由SEQ ID NO:3所组成，及所述之引子D由SEQ ID NO:4所组成。

7.如权利要求1之方法，其中于步骤(d)，该SAN后代藉由比较基因组杂交法(CGH)分析，或南方墨点分析，以判断D复制片段之有无，以辨识之。

8.如权利要求7之方法，其中该南方墨点分析系使用SEQ ID NO:9之探针进行。

9.如权利要求1之方法，其中该SAN后代具有一种或多种增强的基因表现，该基因编码醣类活性酵素(CAZyme)。

10.如权利要求9之方法，其中该编码CAZyme基因系选自由下列所组成之群组：位于支架27之内源-β-1,4-木聚醣酶基因、位于支架28之β-甘露糖苷酶基因、位于支架2之α-L-阿拉伯呋喃糖酶基因、位于支架5之GH71α-1,3-L-葡聚糖苷酶基因、及位于支架5之β-1,3-L-葡聚糖苷酶基因。

11.如权利要求1之方法，其中该SAN后代展现增强的木聚糖酶活性、或于木聚醣为主的培养基上之增加的生物原料产量。

12.如权利要求1之方法，其中该第一菌株或第二菌株进一步包含非同源性末端接合(NHEJ)基因缺失。

13.如权利要求12之方法，其中辨识并挑选所得之SAN后代，其系产自第一菌株及第二菌株之有性杂交，其基因组中具有D复制片段，且NHEJ基因是缺失的。

14.如权利要求12之方法，其中该NHEJ基因为tku70或tmus53。

15.如权利要求12之方法，其中该SAN后代可稳定节段性复制达2周或更久、3周或更久、4周或更久、5周或更久、6周或更久、或7周或更久。

16.一种用于制备稳定木霉菌节段性非整倍体菌株之方法，包含：

(a)将两种具有染色体杂合性之单倍体可交配之木霉菌菌株进行有性杂交，其中该两个菌株中至少一者包含一NHEJ基因缺失；及

(b)从步骤(a)中辨识及挑选出一所得之具有NHEJ基因缺失之节段性非整倍体(SAN)后代，

其中，相较于不具有NHEJ基因缺失之SAN后代，该具有NHEJ基因缺失之SAN後代能稳定节段性复制达较长时间，

其中所述之该两种可交配的单倍体菌株中之一者系带有支架33及支架M，以及另一者系带有支架F及支架X。

17.如权利要求16之方法，其中该NHEJ基因为tku70或tmus53。

18.如权利要求16之方法，其中从步骤(a)所得之SAN后代，经辨识及挑选，具有D复制片段及NHEJ基因之缺失。

19.一种由权利要求1至18所述之方法所得之稳定、木霉菌节段性非整倍体菌株。

20.一种稳定、木霉菌节段性非整倍体菌株，其之基因组中包含D复制片段及tku70或tmus53之缺失。

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