CN105861677A - Trim66蛋白在制备非小细胞肺癌预后评估试剂或试剂盒中的应用 - Google Patents

Trim66蛋白在制备非小细胞肺癌预后评估试剂或试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及TRIM66蛋白的一种新用途，即在制备非小细胞肺癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。其优点表现在：本发明发现TRIM66在非小细胞肺癌组织中的表达率为70.5％，高于癌旁组织的51.4％。本发明发现TRIM66与非小细胞肺癌肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期相关，且肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期和TRIM66是评估非小细胞肺癌患者预后的独立因素。本发明还发现干扰TRIM66表达可以抑制A549细胞增殖。

Description

TRIM66蛋白在制备非小细胞肺癌预后评估试剂或试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是TRIM66蛋白在制备非小细胞肺癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
肺癌是当今世界对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率近年来呈明显上升趋势，严重威胁着人类健康。在我国的许多省市和地区，肺癌的发病与死亡近十年来一直居恶性肿瘤之首位。虽然外科手术、化疗、放疗的疗效已逐步提高，但整体5年存活率仍较低。随着对肺癌的分子生物学发病机制的深入了解，学者们逐渐意识到肺癌的发生发展是多种基因参与、多环节、多阶段、多步骤的复杂过程。仅仅通过某个癌基因或抑癌基因来治疗肺癌难以获得满意效果，需要应用基因、免疫等生物辅助的综合治疗手段来改变肺癌治疗的现状。
肺癌的发生和发展并不遵循单一的途径，是一个多步骤、多阶段、多途径，涉及多基因改变的复杂过程，其间发生了一系列的分子事件，如间质上皮转化、肿瘤细胞的粘附特性、肿瘤内部的血管新生、肿瘤细胞的免疫逃逸、局部侵袭和远端转移等，肺癌的复发和转移是其最主要的死亡原因。在肺癌的发生和发展过程中存在某些重要基因的突变发生，并且肿瘤的生长依赖于持续地、不断增加的突变。已经发现Myc、Ras、p53、Rb、P16等抑癌基因的功能失活，以及Cyclin、Survivin、VEGF、PDGFR、MDM2、cdc2等的过度表达可以导致肿瘤细胞凋亡抑制和无限增殖。同时也逐渐发现了一些关键的核转录因子同时掌控着下游多个癌相关基因或凋亡相关基因的表达，形成了影响肿瘤发生、发展、扩散等生物学特性的相关基因启闭“总阀门”。由于肺癌发病隐匿，转移前常无明显的症状，在临床上，目前缺乏有效的肺癌早期诊断标志物，导致大多数患者被确诊时即处于癌症晚期，患者术后复发率高、预后差。
本领域迫切需要寻找能预测肺癌病情及预后的相关基因或蛋白，这方面的研究对临床治疗肺癌及预防肺癌复发具有重要意义。
近些年，随着具有大规模、高通量的基因组、转录组和蛋白质组分析技术平台的建立，生物信息学手段和方法的不断完善，从多因子和多层面动态分析肺癌的发病机制研究成为可能，尤其是高通量测序技术的发展为精准医疗应用到临床诊断和个性化治疗提供理论和技术上的支持。
TRIM基因家族包括70多个成员，绝大部分TRIM基因的调控机制未知。早期的研究表明部分TRIM蛋白成员具有抗病毒的功能。近年来，部分研究指出TRIM基因家族成员与肺癌的发生和发展进程相关，TRIM29基因在肺癌中通过激活ERK和JNK通路促进肺癌的侵袭转移，TRIM28通过调控E-cadherin和N-cadherin的表达影响肺癌的EMT进程，而TRIM44通过调控NF-KB信号通路影响肺癌的侵袭和转移进程。Chen Y等在骨肉瘤中研究发现TRIM66基因在骨肉瘤中高表达并和骨肉瘤的预后相关，TRIM66主要是通过调控TGF-β信号通路影响骨肉瘤的发生和发展进程。
目前，TRIM66基因与肺癌的关系未见报道，基于我们的大数据分析结果，本研究选定TRIM66基因作为我们的研究目标，运用免疫组化(IHC)、RNA干扰(knockdown)、qRT-PCR、western blot、CCK8细胞活性实验等，验证TRIM66在肺癌发生发展中的作用，为肺癌的早期诊断和治疗提供坚实的实验数据和潜在的药物靶点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供TRIM66蛋白的新用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
TRIM66基因或蛋白在制备非小细胞肺癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
TRIM66基因或蛋白在制备评估非小细胞肺癌淋巴结转移情况的试剂或试剂盒中的应用。
TRIM66基因或蛋白在制备评估非小细胞肺癌TNM分期的试剂或试剂盒中的应用。
一种评估非小细胞肺癌预后、评估非小细胞肺癌淋巴结转移情况、评估非小细胞肺癌TNM分期的试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒检测TRIM66基因或TRIM66蛋白，TRIM66的上游引物为SEQ ID NO.4，TRIM66的下游引物为SEQ ID NO.5。
一种治疗肺癌的药物，所述的药物可抑制TRIM66蛋白的表达。
所述的药物为克隆进入TRIM66-shRNA的慢病毒载体。
一种抑制A549细胞增殖的试剂，所述的试剂包含TRIM66-shRNA。
所述的TRIM66-shRNA的序列为SEQ ID NO.1。
所述的TRIM66-shRNA的序列为SEQ ID NO.2。
本发明优点在于：
1、本发明发现TRIM66在非小细胞肺癌组织中的表达率为70.5％，高于癌旁组织的51.4％。
2、本发明发现TRIM66与非小细胞肺癌肿瘤大小(P＝0.006)、浸润深度(P＝0.002)、淋巴结转移(P＝0.002)和TNM分期相关，且肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期和TRIM66是评估非小细胞肺癌患者预后的独立因素。
3、本发明发现干扰TRIM66表达可以抑制A549细胞增殖。
附图说明
附图1：TRIM66蛋白在癌旁组织和癌组织中的表达。A.TRIM66在鳞癌癌旁组织中阴性表达；B.TRIM66在鳞癌癌组织中阳性表达；C.TRIM66在腺癌癌旁组织中阴性表达；D.TRIM66在腺癌癌组织中阳性表达。
附图2：TRIM66阳性表达的非小细胞肺癌患者预后差。A.TCGA数据癌组织TRIM66mRNA表达量高于癌旁组织；B.GEO(GSE50081)数据的生存分析曲线；C.我院45对癌组织TRIM66mRNA表达量高于癌旁组织；D.我院146例患者的生存曲线。
附图3：干扰TRIM66表达后明显抑制A549细胞的增殖。A.TRIM66被成功敲降；B.qPCR分析干扰组和空载对照组TRIM66mRNA的表达量；C.CCK-8监测干扰组和空载对照组细胞增殖情况。
附图4：TRIM66高表达激活TUMORIGENESIS_UP，抑制APOPTOSIS通路。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
1.1病人、组织及细胞
收集2009～2010年我院病理科存档的146例非小细胞肺癌石蜡标本。所有患者临床资料及随访资料完整，术前均未接受放化疗，并获得知情同意书。病理诊断结果经两名以上病理医师确认。
手术标本切下五分钟内取癌组织与癌旁组织，放入液氮内迅速冷却，-80℃冰箱保存。
非小细胞肺癌A549细胞株购自上海中科院细胞所，采用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5％CO2孵箱中培养。
1.2免疫组化及结果判断
1.2.1组织芯片构建
首先根据H-E切片选取富含肿瘤组织的存档蜡块，根据H-E切片确定具有代表性的病变部位。然后应用组织芯片构建仪(Beecher Instruments,SilverSpring,MD)制备组织芯片。每个病例均有2个癌组织和2个癌旁组织。
1.2.2免疫组化
抗体来源：TRIM66(Sigma，Hpa027420，稀释比例：1：150)。S-P免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。免疫组化技术采用S-P法，PBS替代一抗作阴性对照。
1.2.3结果判断
TRIM66阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色，定位于细胞浆或核。采用二级计分法，阳性细胞计数：根据阳性细胞所占5个以上高倍镜视野比例计数分为四类：<10％：0分；10-25％：1分；25-50％：2分；>50％：3分。染色强度分类：无着色：0分；淡黄色：1分；黄或深黄色：2分；褐或棕褐色：3分。两者计分相加，0-2分为阴性，3-6分为阳性。
1.3 TCGA和GEO数据库挖掘
The Cancer Genome Atlas(TCGA)和Gene Expression Omnibus(GEO)是开放的基因信息数据库，蕴藏着难以想象的宝贵信息。我们挖掘分析了TCGA和GEO(编号为GSE50081)数据库中肺癌样本的TRIM66的表达量和相应的预后信息。
1.4 TRIM66-shRNA质粒转染A549细胞
两个shRNAs(TRIM66-Ri-1,CCGGGCTGTGGCTCTAGACACTAAACTCGAGTTTAGTGTCTAGAGCCACAGCTTTTG，SEQ ID NO.1；TRIM66-Ri-2,CCGGGCAAGATCTACGTGGAACGACTCGAGCGTTCCACGTAGATCTTGCTTTTTG，SEQ ID NO.2)和空载对照组shRNA(NC,CCGGGAGGCTTCTTATAAGTGTTTACTCGAGAAACACTATAAGAAGCCTCTTTTTG，SEQ ID NO.3)克隆进入慢病毒载体。TRIM66-shRNA表达载体购自上海吉凯生物有限公司，转染步骤按照LipofectAmine 2000说明书进行：生长良好的A549细胞在转染前24小时接种于六孔板中，使其在转染时达到85％～90％；无血清无抗生素DMEM分别稀释质粒和LipofectAmine 2000；室温放置5分钟后将两者混匀，放置20分钟；将混合物加入EC109细胞中，37℃孵育6小时，更换完全DMEM培养基继续培养；24小时消化传代，部分用于蛋白提取，部分用于细胞增殖。
1.5 qRT-PCR
收集上海交通大学附属第一人民医院非小细胞肺癌患者手术切除后标本，经病理证实为非小细胞肺癌的癌组织和对应的癌旁组织标本45对，TRIzol法提取45对癌组织、癌旁组织标本及TRIM66-Ri-1、TRIM66-Ri-2和空载对照组(NC)细胞的总RNA，逆转录得cDNA。
TRIM66上游引物:5’-ATGTCGAAGCCCCATAGTGAA-3’(SEQ ID NO.4)、
下游引物:5’-TGGGTGGTGAATCAATGTCCA-3’(SEQ ID NO.5)，
β-actin,上游引物:5’-GCACAGAGCCTCGCCTT-3’(SEQ ID NO.6)、
下游引物：5’-GTTGTCGACGACGAGCG-3’(SEQ ID NO.7)。
qRT-PCR应用Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司，日本)试剂盒，在ABI7500型荧光定量仪上进行，反应体系：Premix ExTaqTM(TaKaRa公司，日本)(×2)10μL，模板2μL,上下游引物各0.4μL,灭菌蒸馏水7.2μL。Real-time PCR反应条件：95℃预变性5min,95℃预变性30s，60℃退火30s，72℃30s，循环40次。
1.6 Western印迹杂交
A549细胞转染48小时后，PBS冲洗细胞，加入300ul蛋白裂解液，冰上裂解10min后，移入1.5ml移液管，4℃超速离心30min，吸取上清，以BCA法行蛋白定量。10.5％SDS-PAGE胶分离蛋白样品，250mA电转移2h至硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉封闭1h；TBST稀释PKM2一抗(1：1000)，4℃过夜；TBST洗膜3次，每次10min，TBST稀释羊抗兔二抗(1：5000)室温1h，洗膜3次，ECL显色。
1.7 CCK-8实验检测细胞的增殖活性
A549细胞转染24h后，胰酶消化计数，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，每组设6个平行孔，于37℃、5％CO2孵箱中培养。继续培养24、48、72h，每次各组随机选择3个孔，每孔加入10μL CCK-8溶液，培养2h后酶标仪测定波长450nm处各孔的吸光度值，绘制细胞生长曲线，实验重复3次，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘图。
1.8统计学分析
采用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，计数资料采用卡方检验，生存分析采用Kaplan-Meier、COX单因素和多因素回归分析。
2结果
2.1 TRIM66蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达
TRIM66定位于细胞浆或核，癌组织中呈弥漫染色，呈淡黄至棕黄、棕褐色(图1)，癌旁组织中TRIM66表达呈弱阳性或不着色。TRIM66在癌组织中的表达率为70.5％，高于癌旁组织的51.4％，差异有统计学意义。
表1 TRIM66蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况
2.2 TRIM66高表达提示预后不良
我们通过分析TCGA数据库发现TRIM66在非小细胞肺癌癌组织中的表达量显著高于癌旁组织(图2A)，进一步分析GEO(GSE50081)数据库发现TRIM66高表达的非小细胞肺癌患者总生存期显著短于TRIM66低表达的患者(图2B)。
我们对45对非小细胞肺癌患者的癌组织和癌旁组织性行qPCR检测，发现TRIM66在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织(图2C)。146例非小细胞肺癌患者根据免疫组化结果分为TRIM66阳性组和TRIM66阴性组，TRIM66阳性表达的患者总生存期显著低于TRIM66阴性表达的非小细胞肺癌患者(图2D)。
2.3 TRIM66与临床病理参数之间的关系
TRIM66的表达与性别、年龄和组织分化等临床参数关系之间统计学差异不显著，而与肿瘤大小(P＝0.006)、浸润深度(P＝0.002)、淋巴结转移(P＝0.002)和TNM分期相关(P＝0.01)。见表2。
COX单因素回归分析和COX多因素回归分析发现肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期和TRIM66是评估非小细胞肺癌患者预后的独立因素。见表3。
表2 TRIM66与非小细胞肺癌临床病理参数之间的关系
表3单因素和多因素COX回归分析
2.4干扰TRIM66表达可以抑制A549细胞增殖
TRIM66-shRNA干扰A549细胞后，利用Western blot和qRT-PCR分别检验干扰结果。两个shRNA均明显抑制A549细胞中TRIM66蛋白的表达(图3A)，其中干扰片段2的效率更高(图3B)。
CCK-8检测结果(图3C)显示，TRIM66-Ri-1组和TRIM66-Ri-2组A549细胞在24、48、72小时监测到的OD值明显低于空载对照组(NC)。由此表明，TRIM66-shRNA特异性干扰TRIM66的表达后，A549细胞增殖受到明显抑制。
3深入研究
我们参照Broad Institute研究团队开发的针对全基因组数据进行分析工具基因集富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis，GSEA)，对TCGA数据库中的肺癌样本做TRIM66基因富集分析，发现TRIM66在肺癌样本中高表达激活TUMORIGENESIS_UP通路，抑制REACTOME_APOPTOSIS通路，而这些通路均密切参与肺癌的发生和发展进程。见图4。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.TRIM66基因或蛋白在制备非小细胞肺癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
2.TRIM66基因或蛋白在制备评估非小细胞肺癌淋巴结转移情况的试剂或试剂盒中的应用。
3.TRIM66基因或蛋白在制备评估非小细胞肺癌TNM分期的试剂或试剂盒中的应用。
4.一种评估非小细胞肺癌预后、评估非小细胞肺癌淋巴结转移情况、评估非小细胞肺癌TNM分期的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒检测TRIM66基因或TRIM66蛋白，TRIM66的上游引物为SEQ ID NO.4，TRIM66的下游引物为SEQ ID NO.5。
5.一种治疗肺癌的药物，其特征在于，所述的药物可抑制TRIM66蛋白的表达。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述的药物为克隆进入TRIM66-shRNA的慢病毒载体。
7.一种抑制A549细胞增殖的试剂，其特征在于，所述的试剂包含TRIM66-shRNA。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述的TRIM66-shRNA的序列为SEQ ID NO.1。
9.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述的TRIM66-shRNA的序列为SEQ ID NO.2。
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