CN105833247A

CN105833247A - 一种多肽在制备kv2.1型钾通道工具试剂中的应用

Info

Publication number: CN105833247A
Application number: CN201610234418.8A
Authority: CN
Inventors: 邓梅春; 罗旋
Original assignee: Qin Cai Bio Tech Ltd Changsha
Current assignee: Qin Cai Bio Tech Ltd Changsha
Priority date: 2016-04-17
Filing date: 2016-04-17
Publication date: 2016-08-10

Abstract

本发明公开了一种生物活性多肽在制备电压门控钾通道工具试剂‑KV2.1型钾通道抑制剂中的应用方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钠肽‑IX（SPNP‑IX），试验验证该活性多肽对KV2.1型电压门控钾通道具有明显的抑制作用。在制备电压门控钾通道亚型工具试剂时，配制细胞外给药的浓度为10 µmol/L。SPNP‑IX的半数有效作用剂量IC₅₀为1.6 µmol/L。SPNP‑IX对KV2.1型钾通道的抑制呈现时间依从性，是一种较好的KV2.1型钾通道工具试剂。

Description

一种多肽在制备KV2.1型钾通道工具试剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX（简写为SPNP-IX）在制备电压门控钾通道工具试剂-KV2.1型钾通道抑制剂中的用途。

背景技术

电压门控钾通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钾通道在动作电位的产生和传播过程中的关键性作用，电压门控钾通道成为很多动植物毒素的作用靶标。钾离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。电压门控钾通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。迄今为止，从多种动物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋动物等）的毒液中鉴定到了很多作用于钾通道的活性成分。它们通过与钾通道的不同位置相结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延缓等。通过阐述这些特异性调制剂作用于钾通道的分子机制，除了在理论上可深入推测钾通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。

发明内容

本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX在制备电压门控钾通道工具试剂-KV2.1型钾通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX（简写为SPNP-IX），其氨基酸序列为：

NH₂-Glu Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys Pro

His Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-NH_2，

其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX作为单一有效活性组份用于制备KV2.1型钾通道抑制剂。

所述的蜘蛛抑钠肽-IX的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

该蜘蛛抑钠肽-IX作为单一有效活性组分用于制备KV2.1型钾通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成KV2.1型钾通道工具试剂。

蜘蛛抑钠肽-IX在制备KV2.1型钾通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为10 µmol/L。

蜘蛛抑钠肽-IX抑制KV2.1型钾通道的半数有效作用剂量IC₅₀为1.6 µmol/L。

蜘蛛抑钠肽-IX对KV2.1型钾通道的抑制呈现时间依从性，是一种较好的KV2.1型钾通道工具试剂。

附图说明

图1是10 µmol/L SPNP-IX对大鼠DRG神经元上KV2.1型钾通道的影响。

图2是SPNP-IX作用于大鼠DRG细胞KV2.1钾通道的浓度-效应关系曲线。

图3是SPNP-IX作用于大鼠DRG细胞KV2.1钾通道的时间-效应关系曲线。

图4是SPNP-IX对大鼠DRG细胞KV2.1钾通道电流-电压关系的影响。

具体实施方式

为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用爪蟾卵母细胞模型来说明蜘蛛抑钠肽-IX的KV2.1型钾通道抑制作用。

1、实验材料和方法

1.1质粒的线性化及回收

含Kv1.1基因的质粒pCI用限制性内切酶Sma I线性化；含Kv1.2基因的质粒pcDNA3用限制性内切酶Sph I线性化；含Kv1.3基因的质粒pCI-neo用限制性内切酶Not I线性化；含Kv2.1基因的质粒pCI用限制性内切酶Not I线性化。cDNA的回收操作如下：取Kv2.1质粒 20µL,10×Buffer 5µL,H₂O 22µl，限制性内切酶NotI 3µl,震荡混合后，37℃下放置5hr。酶切后的产物用0.8%的Agarose胶电泳，切胶后用离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。割下含DNA的Agarose胶放入1.5 mL离心管中，每100 mg胶加入300µl溶胶液，置65℃水浴10min,使胶完全溶化,混合液转入到已经套入收集管的吸附柱内,13000 rpm离心30s,倒掉废液,加入700µl漂洗液, 13000 rpm离心30s,倒掉废液,加入500µl漂洗液, 13000 rpm离心30s,倒掉废液,13000rpm空柱离心2min,尽量除去漂洗液。将吸附柱放入一干净离心管中,加入适量经65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液,室温放置2min，13000 rpm离心1min收集DNA溶液。

1.2 cDNA的体外转录和mRNA的纯化

Kv1.1、Kv1.3、Kv1.2和Kv2.1 cDNA的体外转录均采用Ambion公司的mMESSAGEmMACHINE T7 Transcription kit 试剂盒进行。取cDNA 20µl，10×Buffer 2µl，2×NTP/CAP 10µl，T7 RNA聚合酶2µl，上述溶液震荡混合后，37℃水浴2hr；加1µl DNAase，37℃加热5min。将产物转入新的1.5 mL离心管中，加入15µl 醋酸铵和115µl H2O终止反应。加入150µl 酚/氯仿，混匀，静置5min，12000rpm 低温离心5min，上清转移至新的离心管，然后加入等体积氯仿，混匀，12000rpm低温离心10min，吸上清至新离心管，加入350µl预冷的异丙醇，-20℃放置30min，12000rpm低温离心10min，移去上清，加入预冷的70%乙醇，1000rpm低温离心5min，去上清，风干，加入适量无RNA酶的ddH2O。取转录好的mRNA 1µl，用紫外分光光度计测量其浓度，检测结果为1.7～1.9µg/µl。将mRNA稀释到1.0 ng/nl,-70℃保存备用。

1.3卵母细胞标本的制备和培养

ND96溶液（mM）：NaCl 96、KCl 2、CaCl₂-2H₂O 1.8、MgCl₂-6H₂O 1、HEPES-NaOH 5。用NaOH调pH 至7.5。

OR₂溶液(mM): NaCl 82.5、KCl 2.5、CaCl₂-2H₂O 1、MgCl₂-6H₂O 1、 Na₂HPO₄-12H₂O1 、HEPES 5。用NaOH 调pH 至7.5。使用前加入青霉素（10万单位/L）。

卵母细胞的分离：雌性非洲爪蟾购自中国科学院遗传与发育生物学研究所。取成年雌性非洲爪蟾，放入碎冰内冷冻麻醉约30 min，腹部朝上置于冰上，用镊子和手术刀在其腹部划开一长约1.0～1.5 cm 的口子，再把镊子伸入腹腔夹出卵巢，剪取2-3叶放入无钙ND96溶液中。将取出的卵叶用系线镊初步分散成10－20个细胞一团。然后转入50 mL离心管中，加入溶有胶原酶的无钙ND96溶液，酶的终浓度为1 mg/mL。在25℃,60 rpm下酶解50min。取细胞观察，如果有80%以上的细胞已经去除微血管及滤泡膜，则停止酶解。酶解完毕，用无钙的ND96溶液多次洗涤细胞，洗去残留的胶原酶。然后，挑选个体比较大、动植物极分明的细胞转入OR₂溶液中培养。

1.4 电压钳实验

通过显微注射系统（WPI，German）将mRNA注入挑选好的卵母细胞，每次注射体积约为20-50 nl，从黑色的动物极一侧注入。之后，放入16℃低温振荡培养箱中培养2～4 天，每天更换一次新鲜的OR₂培养液。双电极杆电压钳记录在室温（18～22℃）下进行。电流和电压玻璃电极经一步拉制而成，灌注3 M KCl 后电阻为0.5-1.5 MΩ。将细胞放入细胞槽中，用OR₂溶液灌流。然后将两个玻璃电极分别插入细胞的动植物两极。将细胞膜钳制在-80 mV，给予去极化脉冲刺激。所用放大器为TURBO TEC-03X（NPI Electronic, Germany）。数据采集滤波为2kHz。参比电极用Ag/AgCl电极与浴槽相连。刺激脉冲控制和电流信号记录采用cellworks 数据采集系统（NPI 公司，Germany）。线性漏电流和电容电流不予删除。数据分析采用Sigmaplot9.0软件进行。所有毒素直接用溶液溶解并配制成目的浓度。实验过程中，为防止毒素粘在细胞槽壁上，可在OR₂溶液中加入少量BSA（Sigma，USA）。

2、实验结果与分析

2.1 SPNP-IX对KV2.1型电压门控钾通道的影响

与SPNP-IX有63%同源性的hanatoxin1是已知的Kv2.1通道毒素，因此我们也检测了SPNP-IX对表达在爪蟾卵母细胞上的延迟整流钾通道（Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3和Kv2.1）的作用。延迟整流钾通道Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3和Kv2.1电流以同一种去极化方式诱导：将细胞膜电位钳制在-90 mV，以200 ms的时程给予一测试电压0mV，每隔5 s重复一次。实验结果表明，10 μM的SPNP-IX对Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3没有明显的抑制作用，却能抑制93 ± 3.2 %的Kv2.1通道电流（如图1）。SPNP-IX对Kv2.1电流的抑制效应具有浓度依从性，其半有效抑制浓度（IC50）为1.6 μM（图2）。SPNP-IX 对Kv2.1电流的抑制具有时间依从性，当浓度增加为 10 μM时，可在约2min的时间内达到94%的抑制程度（图3）。10 μM的SPNP-IX抑制Kv2.1电流的结合和解离时间常数分别为26.6±1.3 s (n = 5)。并且10 μM的SPNP-IX对静息关闭状态的Kv2.1通道的抑制比例约为93%，表明SPNP-IX对处于静息关闭和激活状态的钾通道均有相似的亲和敏感性。

2.2 SPNP-IX对KV2.1型钾通道门控特征的影响

门控调制毒素与通道作用一个非常重要的特征是通过使通道的激活电位向去极化方向漂移从而调制通道门控的动力学。SPNP-IX对Kv2.1通道I-V曲线的影响见图4：当细胞膜电位钳制在-80 mV 时，Kv2.1通道的起始激活电压约为-40 mV，SPNP-IX能使Kv2.1通道的激活电位朝去极化方向漂移约20 mV，说明它是作为通道的门控调制剂在发挥作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 长沙沁才生物科技有限公司

<120> 蜘蛛抑钠肽-IX

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> PRT

<213> SPNP-IX

<400> 1

Glu Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys

1 5 10 15

Cys Pro His Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly

16 20 25 30

Trp Asp Gly Thr Phe

31 35

Claims

1.一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX在制备电压门控钾通道工具试剂-KV2.1型钾通道抑制剂中的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX（简写为SPNP-IX），其氨基酸序列为：

NH₂-Glu Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys Pro

His Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-NH_2，

2.根据权利要求1所述的一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX在制备电压门控钾通道工具试剂-KV2.1型钾通道抑制剂中的应用，其特征在于，所述的蜘蛛抑钠肽-IX的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

3.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-IX作为单一有效活性组分用于制备KV2.1型钾通道抑制剂。

4.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-IX制备成细胞外给药的KV2.1型钾通道工具试剂。

5.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-IX在制备KV2.1型钾通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为10 µmol/L。

6.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-IX的半数有效作用剂量IC₅₀为1.6µmol/L。

7.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，蜘蛛抑钠肽-IX的作用是时间依从的。