CN105803017B - 一种提高木质纤维原料酶水解糖化效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高木质纤维原料酶水解糖化效率的方法,属于酶工程技术领域。目的是为了提供一种工艺简单、成本低、可高效提高木质纤维原料酶水解糖化效率的方法。硫酸盐制浆废液经浮油回收和酸沉淀后,用碱调节溶液pH至11,离心分离除去下层泥沙等碱不溶物,上清液用2mol/L硫酸调节溶液pH至5,离心分离,弃去沉淀物,上清液继续用2mol/L硫酸调节溶液pH至2,离心分离,弃去上清液,沉淀物用pH为2的硫酸经洗涤,得硫酸盐木质素,将硫酸盐木质素加入醋酸‑醋酸钠缓冲液中搅拌均匀后作为助剂,加入到预处理后的酶解底物木质纤维原料中混合均匀,然后加入酶液进行酶水解糖化反应,反应结束后,离心收集上层含糖清液。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域,主要涉及一种提高木质纤维原料酶水解糖化效率的方法。
背景技术
化石能源的日渐枯竭严重制约着世界文明的发展与进步,寻找可替代的再生资源成为世界各国的研究重点。上世纪70年代以来,生物能源作为一种可再生的潜在能源得到各国研究者的青睐。同时,生物能源的应用还能减少由传统的化石能源使用过程中带来的温室气体CO2及少量含硫、含氮的有害气体,有效地缓解温室效应。作为第二代生物燃料,木质纤维原料具备产量大,成本低等特点使其具备更加明朗的发展前景。
利用木质纤维原料制备生物乙醇主要包括预处理、酶水解、发酵和蒸馏四个步骤。其中预处理和酶水解是决定生物乙醇生产成本和生产效率的关键步骤。
木质纤维原料主要化学成分是纤维素、半纤维素和木质素。在植物组织中,纤维素本身具有结晶结构,半纤维素与木质素以共价键形式结合,并紧紧地包围着纤维素,形成了一种坚固的天然屏障,使催化剂和一般微生物很难与纤维素接触并使其降解。通过预处理可以打破纤维素、半纤维素和木质素之间的连接,破坏纤维素的结晶结构,分离或脱除部分半纤维素和木质素,增加木质纤维原料的孔隙度,提高酶对纤维素的接触比表面积和可及性。
作为植物细胞壁的三大组成成分之一,木质素一直被认为是抑制植物纤维原料生物转化的主要障碍。在生物质通过酶水解转化成液体燃料过程中,木质素与酶的无效吸附以及木质素给酶与纤维素接触造成的通道阻碍被认为是影响木质纤维原料转化成液体燃料效率的主要原因。因为植物纤维原料结构的复杂性,研究木质素在生物转化过程中的行为以及木质素与酶的相互作用十分困难。研究者通过往反应底物中添加各种木质素,或减少反应底物中木质素含量以及对反应底物中的木质素进行改性来研究木质素对酶水解的影响。许多实验表明,降低反应底物中的木质素含量有利于提高底物中糖的酶水解转化率。因此,各种有利于脱除原料木质素的预处理方法被广泛采用,例如碱法预处理。
近年来,酶的高效利用和酶回收越来越受到人们的广泛关注,因为酶的高成本极大制约着木质纤维原料生产燃料乙醇的商业化进程。因此,能提高酶水解效率的助剂急需要被开发。但是,在酶水解过程中添加助剂无疑会增加额外费用,所以低成本、来源丰富、易获得、易制备、效率高的添加剂才更有应用前景。酶水解添加剂需要满足以下条件:能作用于酶的最高活性温度;不能对后续发酵产生不利影响;能有利于提高底物的酶水解效率;能有利于减少酶的使用量;能有利于缩短酶水解时间。研究较多的酶水解助剂有表面活性剂、牛血清蛋白、具有环氧乙烷结构的聚乙烯醇(PEG)、蒽醌等。
发明内容
针对现有技术中存在的不足,本发明从制浆的废液中提取硫酸盐木质素,该木质素具有较好的溶解性能和表面活性,将其作为木质纤维原料酶水解糖化的添加助剂使用,以此来提高木质纤维原料酶水解糖化的效率。
本发明所采用的技术方案是:一种提高木质纤维原料酶水解糖化效率的方法,包括以下步骤:
(1)取一定量的硫酸盐制浆废液,经浮油回收后进行酸沉淀得到初级硫酸盐木质素;
(2)取初级硫酸盐木质素加水溶解,用碱调节溶液pH值至11,离心分离除去下层泥沙等碱不溶物,上清液用2mol/L硫酸调节溶液pH值至5,离心分离,弃去沉淀物;
(3)上清液继续用2mol/L硫酸调节溶液pH值至2,离心分离,弃去上清液,沉淀物用pH值为2的硫酸经多次洗涤,所得沉淀物即为纯净的硫酸盐木质素,然后冷冻干燥处理;
(4)将一定量硫酸盐木质素加入醋酸-醋酸钠缓冲液中搅拌均匀后作为助剂,再加入到预处理后的酶解底物木质纤维原料中混合均匀;
(5)将酶液加入预反应的木质纤维原料/硫酸盐木质素醋酸-醋酸钠混合液中,进行酶水解糖化反应,并控制反应温度、PH值和反应时间。
(6)反应结束后,离心收集上层含糖清液。
本发明专利提供的方法工艺方法中,步骤(4)中所述硫酸盐木质素加入醋酸-醋酸钠缓冲液中,其中硫酸盐木质素的加入质量为预处理后的木质纤维原料绝干质量的1~30%,醋酸-醋酸钠缓冲液的pH为5.0。
本发明专利提供的方法工艺方法中,步骤(4)中所述的木质纤维原料包含有木材、木屑、秸秆、芦苇、稻壳、玉米芯、花生壳和甘蔗渣等一切木质纤维类生物质,预处理方法可以是酸性亚硫酸盐预处理,绿液预处理。
本发明专利提供的方法工艺方法中,步骤(4)中所述的预处理后的酶解底物木质纤维原料浓度范围为1~10wt%。
本发明专利提供的方法工艺方法中,步骤(5)中所述的酶液为纤维素酶、木聚糖酶和β-纤维二糖酶三者的复合酶,三种酶单位体积的酶活比为纤维素酶∶木聚糖酶∶β-纤维二糖酶=1FPU∶1.2FXU∶1CBU。其中,复合酶中β-纤维二糖酶为适当的过量,以防止酶水解过程中因纤维二糖的积累而降低纤维素水解为葡萄糖的效率。
本发明专利提供的方法工艺方法中,步骤(5)中所述复合酶水解温度为40~50℃,pH为4.0~5.0,水解时间为12~120h,搅拌转速150~200r/min。
本发明有益效果是:
1、本发明采用硫酸盐木质素作为助剂能有效提高酶解效率,在不改变酶用量和酶水解时间前提下,预处理后木质纤维原料总糖转化率能提高了20%~50%。
2、采用本发明方法能有效减少酶用量,酶用量为20FPU/g时的酶解总糖转化率比40FPU/g无添加剂时还要高出2%。
3、采用本发明方法能有效缩短酶水解时间,酶解反应24h后,酶水解总糖转化率能达到无任何添加剂酶解48h的效果。
4、本发明添加剂硫酸盐木质素对后续发酵不会产生任何不利影响。
5、本发明采用的硫酸盐木质素来源于制浆废液,将木质素经过适当改性处理即可得到。该木质素与磺化木质素不同,不含有磺酸基这种亲水基团。成本低,来源广,易获得,易制备。酶水解反应结束后,此添加剂还能在后续过程中高效回用,能有效降低技术运行成本。若基于原制浆厂现有设备继续建设,采用原有制浆设备进行生物乙醇制备的预处理阶段,对预处理黑液中木素简单加工后作为助剂高效用于后续酶水解工艺,必将会加快生物乙醇制备的商业化进程。
6、本发明采用制浆废液中硫酸盐木质素作为添加剂属于高附加值利用。可高效利用制浆废液资源,拓宽用途,提高其使用价值。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为硫酸盐木质素的添加对绿液预处理阔叶木酶解糖转化率的影响。
图2为硫酸盐木质素的添加对绿液预处理阔叶木酶解时间的影响。
图3为硫酸盐木质素的添加对绿液预处理阔叶木酶用量的影响。
图4为硫酸盐木质素的添加对酸性亚硫酸氢钠预处理阔叶木酶解糖转化率的影响。
图5为硫酸盐木质素的添加对亚硫酸钠-甲醛预处理阔叶木酶解糖转化率的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,技术工艺步骤,具体实施条件和材料,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明的木质纤维原料包含有木材、木屑、秸秆、芦苇、稻壳、玉米芯、花生壳和甘蔗渣等一切木质纤维类生物质。以下,以木材中阔叶木为木质纤维原料,对本发明具体实施进行说明。
实施例1
(1)取一定量的阔叶木处理为木片长约1.5cm,宽约2.5cm,厚约0.2cm,风干后平衡水分。
(2)对阔叶木进行绿液预处理。在自制的10×1L油浴锅中,每罐称取相当于绝干100g的风干木片,固液比为1∶4(g/mL)加入蒸煮液,用碱量为20%,硫化度为25%,木片与蒸煮液混合均匀后,在80℃下回转预浸30min后,以2℃/min的速率升温至160℃,保温60min后预处理完成。将蒸煮罐取出用冷水冷却至室温后,用热水冲洗预处理后木片,将木片中残留的化学药品和木质素洗去并离心脱水,在密封容器中平衡水分并分析得率。其余预处理木片用磨浆机(KRK,磨盘直径300mm,转速3000r/min)疏解成浆,经离心脱水、撕碎后置于密封塑料袋中平衡水分。
(3)酶水解用混合酶液由纤维素酶,木聚糖酶和β-纤维二糖酶等混合而成。配制三种酶单位体积的酶活比为纤维素酶∶木聚糖酶∶β-纤维二糖酶=1FPU∶1.2FXU∶1CBU。
(4)将盘磨后的预处理木片(已疏解成浆)至于50mL离心管中,硫酸盐木质素按一定比例加入醋酸-醋酸钠缓冲液,在每克绝干底物预处理木片中硫酸盐木质素的添加量分别为0,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.3g,底物浓度为2wt%,pH值为5.0,酶用量为分别为20FPU/g和40FPU/g。将离心管置于恒温振荡器DHZ-2102中,在180r/min,50℃条件下振荡处理48h。水解结束后在5000r/min下离心15min,得到上层酶水解糖液。
结果在没有硫酸盐木质素添加时,酶解葡聚糖、木聚糖及总糖的得率分别为27.8%、9.4%和37.2%。在酶解体系中,加入一定比例的硫酸盐木质素于醋酸-醋酸钠缓冲液中,酶解糖化效率随着硫酸盐木质素添加比例的增加而明显提高,当硫酸盐木质素添加量为0.1g/g时,酶解糖得率达到最高值,葡聚糖、木聚糖及总糖的得率分别为44.7%、11.4%和56.1%,表1硫酸盐木质素添加量对酶解糖得率的影响
表1
实施例2
(1)取一定量的阔叶木处理为木片长约1.5cm,宽约2.5cm,厚约0.2cm,风干后平衡水分。
(2)对阔叶木进行酸性亚硫酸氢钠预处理。在自制10×1L油浴锅中,每罐称取相当于绝干100g的风干木片,固液比为1∶5(g/mL)加入蒸煮液,亚硫酸氢钠用量(相对于绝干原料)为6%,木片与蒸煮液混合均匀后,在80℃下回转预浸30min后,以2℃/min的速率升温至170℃,保温30min后,预处理完成。将蒸煮罐取出用冷水冷却至室温后,用热水冲洗预处理后木片过夜,将木片中残留的化学药品和木质素洗去并离心脱水,在密封容器中平衡水分并分析得率。其余预处理木片用磨浆机(KRK,磨盘直径300mm,转速3000r/min)疏解成浆,经离心脱水、撕碎后置于密封塑料袋中平衡水分。
(3)酶水解用混合酶液由纤维素酶,木聚糖酶和β-纤维二糖酶等混合而成。配制三种酶单位体积的酶活比为纤维素酶∶木聚糖酶∶β-纤维二糖酶=1FPU∶1.2FXU∶1CBU。
(4)将盘磨后的预处理木片(已疏解成浆)至于50mL离心管中,硫酸盐木质素按一定比例加入醋酸-醋酸钠缓冲液,在每克绝干底物预处理木片中硫酸盐木质素的添加量分别为0,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.3g,底物浓度为2wt%,pH值为5.0,酶用量为分别为20FPU/g和40FPU/g。将离心管置于恒温振荡器DHZ-2102中,在180r/min,50℃条件下振荡处理48h。水解结束后在5000r/min下离心15min,得到上层酶水解糖液。
结果在没有硫酸盐木质素添加时,酶解葡聚糖、木聚糖及总糖的得率分别为32.9%、2.6%和35.6%。在酶解体系中,加入一定比例的硫酸盐木质素于醋酸-醋酸钠缓冲液中,酶解糖化效率随着硫酸盐木质素添加比例的增加而明显提高,当硫酸盐木质素添加量为0.1g/g时,酶解糖得率达到最高值,葡聚糖、木聚糖及总糖的得率分别为51.5%、2.8%和54.3%,表2硫酸盐木质素添加量对酶解糖得率的影响。
表2
实施例3
(1)取一定量的阔叶木处理为木片长约1.5cm,宽约2.5cm,厚约0.2cm,风干后平衡水分。
(2)对阔叶木进行亚硫酸钠-甲醛预处理。在自制10×1L油浴锅中,每罐称取相当于绝干100g的风干木片,固液比为1∶4(g/mL)加入蒸煮液,亚硫酸钠用量(相对于绝干原料)为12%,甲醛用量为2.9%,木片与蒸煮液混合均匀后,在80℃下回转预浸30min后,以2℃/min的速率升温至170℃,保温60min后,预处理完成。将蒸煮罐取出用冷水冷却至室温后,用热水冲洗预处理后木片过夜,将木片中残留的化学药品和木质素洗去并离心脱水,在密封容器中平衡水分并分析得率。其余预处理木片用磨浆机(KRK,磨盘直径300mm,转速3000r/min)疏解成浆,经离心脱水、撕碎后置于密封塑料袋中平衡水分备用。
(3)酶水解用混合酶液由纤维素酶,木聚糖酶和β-纤维二糖酶等混合而成。配制三种酶单位体积的酶活比为纤维素酶∶木聚糖酶∶β-纤维二糖酶=1FPU∶1.2FXU∶1CBU。
(4)将盘磨后的预处理木片(已疏解成浆)至于50mL离心管中,硫酸盐木质素按一定比例加入醋酸-醋酸钠缓冲液,在每克绝干底物预处理木片中硫酸盐木质素的添加量分别为0,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.3g,底物浓度为2wt%,pH值为5.0,酶用量为分别为20FPU/g和40FPU/g。将离心管置于恒温振荡器DHZ-2102中,在180r/min,50℃条件下振荡处理48h。水解结束后在5000r/min下离心15min,得到上层酶水解糖液。
结果在没有硫酸盐木质素添加时,酶解葡聚糖、木聚糖及总糖的得率分别为34.4%、10.5%和44.9%。在酶解体系中,加入一定比例的硫酸盐木质素于醋酸-醋酸钠缓冲液中,酶解糖化效率随着硫酸盐木质素添加比例的增加而明显提高,当硫酸盐木质素添加量为0.1g/g时,酶解糖得率达到最高值,葡聚糖、木聚糖及总糖的得率分别为40.2%、13.0%和53.2%,表3硫酸盐木质素添加量对酶解糖得率的影响。
表3
各位技术人员须知:虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述,但是本发明的发明思想并不仅限于此发明,任何运用本发明思想的改装,都将纳入本专利专利权保护范围内。
Claims (3)
1.一种提高木质纤维原料酶水解糖化效率的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)取一定量的硫酸盐制浆废液,经浮油回收后进行酸沉淀得到初级硫酸盐木质素;
(2)取初级硫酸盐木质素加水溶解,用碱调节溶液pH值至11,离心分离除去下层泥沙等碱不溶物,上清液用2mol/L硫酸调节溶液pH值至5,离心分离,弃去沉淀物;
(3)上清液继续用2mol/L硫酸调节溶液pH值至2,离心分离,弃去上清液,沉淀物用pH值为2的硫酸经多次洗涤,所得沉淀物即为纯净的硫酸盐木质素,然后冷冻干燥处理;
(4)将预处理后木质纤维原料绝干质量的1~30%的硫酸盐木质素加入pH为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中搅拌均匀后作为助剂,再加入到浓度为1~10wt%的预处理后酶解底物木质纤维原料中混合均匀得到预反应的木质纤维原料/硫酸盐木质素/醋酸-醋酸钠混合液;
(5)将纤维素酶∶木聚糖酶∶β-纤维二糖酶按酶活比例为1∶1.2∶1复合后得到复合酶,然后将复合酶加入预反应的木质纤维原料/硫酸盐木质素/醋酸-醋酸钠混合液中,进行酶水解糖化反应,并控制反应温度、PH值和反应时间;
(6)反应结束后,离心收集上层含糖清液。
2.根据权利要求1一种提高木质纤维原料酶水解糖化效率的方法,其特征在于步骤(4)中所述的木质纤维原料包含有木材、木屑、秸秆、芦苇、稻壳、玉米芯、花生壳和甘蔗渣,预处理方法为酸性亚硫酸盐预处理或绿液预处理。
3.根据权利要求1一种提高木质纤维原料酶水解糖化效率的方法,其特征在于步骤(5)中所述复合酶水解温度为40~50℃,pH为4.0~5.0,水解时间为12~120h,搅拌转速150~200r/min。
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