CN105802869B - 一种用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系及浸矿工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系及浸矿工艺，中温浸矿复合菌系Acidithiobacillus caldus 0Y，该复合菌系已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址位于武汉大学内，保藏日期为2011年1月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2010356。该复合菌系的菌种组成为Acidithiomicrobium ferrooxidans(81％)；Acidithiobacillus caldus(13％)；Ferroplasma sp(6％)。该菌系对黄铜矿具有较高的浸出效率，尤其对低品位硫化铜矿如黄铜矿在堆浸工艺的应用有较强的商业应用前景。

Description

一种用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系及浸矿工艺
技术领域
本发明涉及微生物浸矿技术领域，具体涉及用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系及其浸矿工艺。
背景技术
随着经济发展和社会的进步，铜工业在国民经济发展中的地位日益提高。黄铜矿是铜资源的主体，然而，研究表明常温生物对黄铜矿的生物浸出难以奏效。此外，虽然有矿业公司连续发布有关黄铜矿嗜热菌搅拌浸出的实验情况，但由于嗜热嗜酸菌对高矿浆浓度极度敏感，也很难高效解决黄铜矿浸出难题。
因此，筛选和培育高效、高适应性中温菌用于黄铜矿浸出不失为有益的尝试。我国地处寒、温、热三带，平原、山地、高原广布。广袤的地形决定了微生物资源的丰富性，是筛选高效浸矿菌的宝库。现有技术中利用中温微生物浸出黄铜矿的研究很少。本申请从采集的样品中富集培养能有效浸出黄铜矿的中温微生物混合菌。
发明内容
本发明的目的在于，提供一个中温浸矿菌复合系，该菌系对黄铜矿具有较高的浸出效率。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系，其名称为嗜酸喜温硫杆菌0Y(Acidithiobacillus caldus 0Y)，该复合菌系由嗜酸氧化亚铁硫杆菌Acidithiomicrobium ferrooxidans；嗜酸喜温硫杆菌Acidithiobacillus caldus；铁原体属Ferroplasma sp.组成，该复合菌系已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址位于武汉大学内，保藏日期为2011年1月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2010356。
如上所述的复合菌系的菌种组成为Acidithiomicrobium ferrooxidans(81％)；Acidithiobacillus caldus(13％)；Ferroplasma sp(6％)。
本发明还提供一种用于如上所述的复合菌系的培养基，其配方为：1重量份K2HPO4，2重量份(NH4)2CO3，0.5重量份NaHCO3，0.2重量份CaCl2，0.8重量份MgSO4，0.1重量份酵母粉，1000重量份蒸馏水；pH为1.6-1.7。
该复合菌系的培养方法在如上所述培养基中，45℃振荡培养。
本发明的另一个目的还在于，提供一种利用如上所述中温浸矿复合菌系的浸矿工艺，具体为：将如上所述菌系接种至含黄铜矿粉为1～10重量％的水溶液中，接种量为107～108cuf/ml，在38～48℃培养7～14天。
本发明的有益效果在于：本发明提供的中温菌系，其较高温菌具有更好的环境适应性，更易于培养，工作温度更低，操作更方便，尤其是对低品位硫化铜矿如黄铜矿在堆浸工艺的应用有极强的商业应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下所举实施例是为便于更好地理解本发明，但并不用来限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
实施例1：中温浸矿复合菌系0Y的获得
1.富集：
取200mL普通自来水，用H2SO4调节其pH为1.7，加入0.20g酵母粉，加入300g取自德兴铜矿废弃堆浸矿堆的矿石样品，45℃保温24小时，获得富集培养物。
2.培养：
按下述配方配制培养基A：K2HPO4 1g，(NH4)2CO3 2g，NaHCO3 0.5g，CaCl20.2g，MgSO40.8g，蒸馏水1L；调节pH为1.6-1.7。按下述配制方法配置培养基B：向100mL普通自来水中，加入10g黄铜矿矿粉(江西德兴铜矿)，黄铜矿矿粉的粒径为200目，用浓硫酸调节pH进行酸平衡，直至pH稳定在1.6-1.7。接种前取100mL培养基A与培养基B混合。接种时，先在混合培养基中加入0.1-0.15％(w/v)的酵母粉，然后加入步骤1中的富集培养物，接种量为总体积的20～30％；45℃140rpm振荡培养，培养7天。
3.驯化：
培养基A加入(0.1-0.15)％(w/v)的酵母粉))作为驯化培养基，加入5-10％(w/v)的黄铜矿粉(来源及其粒径同上)，在pH 1.6-1.7条件下接种10％(v/v)步骤2获得的培养物，在45℃进行细菌浸矿适应性驯化培养，获得菌浓度为107～109cfu/mL的稳定的浸矿复合菌系0Y。
实施例2：中温浸矿复合菌系0Y中细菌种群组成的分析
1、总DNA的提取
将实施例1中得到的复合菌系接种至培养基A中，接种量为体积百分比5％，40-50℃培养20小时。
取上述培养20小时后的培养液1mL放入1.5mL Eppendorf管中，12000rpm，4℃离心5分钟收集菌体，用1×TES洗涤菌体2-3次。将菌体重新悬浮于435μL TES中打散菌体，加入20mg/mL的溶菌酶125μL，10mg/mL的蛋白酶K 2.5μL，37℃水浴轻振保温4小时，加入50μL20％SDS，于37℃水浴轻振保温30分钟，加入5mol/L的NaClO4 125μL，用等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提3-4次至界面无蛋白膜出现。吸取上层水相置于冰浴中加入1/10体积的3mol/L的NaAc-EDTA-Na2，加入2倍体积冷无水乙醇，翻转混匀，冰浴5分钟。12000rpm离心20分钟沉淀DNA。加入体积百分比70％的乙醇脱盐，4℃过夜放置，7000rpm离心10分钟，吸出乙醇。风干，加二次蒸馏水溶解。电泳检测后调DNA浓度为25μg/mL。
2、PCR扩增16S rDNA部分序列
通用引物：细菌引物27F和1492R
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
古菌引物25F和1492R
25F：5’-TCY GGT TGA TCC YGC CRG-3’
1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应条件：
预变性：95℃5min；
循环：95℃1min，55℃2min，72℃1min，30个循环；
延伸：72℃5min。
经电泳检测，证明得到大约1000bp的PCR产物。
3、PCR产物纯化
采用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-up System产品(产品目录号：A9281)进行纯化。具体操作为：经凝胶电泳后将所需条带切下放入1.5mL离心管；称量胶条的重量，并以1μL/mg的量加入膜结合溶液，在50-65℃保温溶解；将溶解后的混合物倒入柱子室温放置1分钟后以16000转速离心1分钟；加入700μL洗膜溶液以同样转速离心1分钟后再加入500μL洗膜溶液离心5分钟；将柱子轻轻转移到干净的离心管中加入50μL无核酸酶水，离心1分钟后置4℃保存。
4、PCR产物与载体连接
连接载体选用Promega公司的pGEM T-easy载体(产品目录号：A1360)，连接体系如表1：
表1
混匀后4℃过夜放置。
其中，Control DNA为Promega公司的pGEM T-easy载体中提供。
5、转化
将步骤4的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(北京博大泰恒生物技术有限责任公司产品)。分别取50μL，100μL，200μL涂平板，于37℃温箱培养12-16小时。依据蓝白斑筛选的原理挑取白色菌落点种在平板上，每个平板点种50个菌落，每个菌落的位置标记号码1-50，37℃培养12小时。
6、阳性克隆的筛选
采用菌落PCR技术。用牙签挑取共60个不同菌落的菌体分别加入事先装有50μL无菌水的PCR管中，在PCR管上做好标记，该标记与所取菌落在平板上的标记号码一一对应。将PCR管于95℃加热5分钟，冷至室温后，15000rpm离心5分钟。取10μL上清为模板进行菌落PCR，引物为SP6和T7，SP6序列为5′-CATACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3′。T7序列为5′-TAA TAC GAC TCA CTATAG GG-3′。菌落PCR体系组成以及反应条件均与上述16S rDNA的扩增条件相同。取10μL PCR产物经凝胶检测确定阳性克隆。
7、阳性克隆测序
将阳性克隆菌落接种于LB培养基固体平板上，37℃过夜培养后送测序公司进行测序。将所得序列输入NCBI网站用Blast程序与Genebank中已有的序列进行比较。
8、中温浸矿复合菌系微生物种群结构组成：
经上述分析，结果表明：0Y菌系由喜温嗜酸硫杆菌Acidithiomicrobiumferrooxidans(81％)；嗜酸氧化亚铁硫杆菌cidithiobacillus caldus(13％)；铁氧化嗜酸古细菌Ferroplasma sp(6％)组成。
将复合菌系0Y命名为Acidithiobacillus caldus 0Y，该复合菌系已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址位于武汉大学内，保藏日期为2011年1月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2010356。
实施例3：中温浸矿复合菌系0Y和JQ-3Y对黄铜矿的浸出效果分析
JQ-3Y菌系为本实验室培养驯化的另一种黄铜矿中温浸矿复合菌系，由喜温嗜酸硫杆菌Acidithiomicrobium ferrooxidans(54％)；嗜酸氧化亚铁硫杆菌cidithiobacillus caldus(21％)；Acidithiomicrobium sp(10％)；铁氧化嗜酸古细菌Ferroplasma sp(15％)组成。
首先将低温保藏的复合菌系Acidithiobacillus caldus 0Y和JQ-3Y在装有200mL培养基的三角瓶中活化；该培养基按照下述配方配制而成：K2HPO4 1g，(NH4)2CO32g，NaHCO30.5g，CaCl2 0.2g，MgSO4 0.8g，酵母粉0.1g，蒸馏水1L。45℃下140rpm活化培养3天，活化后的菌种浓度达到107～108cfu/mL，离心后，将菌泥转接入200mL已经酸平衡(pH1.7-1.8)的、含有5％黄铜矿矿粉(江西德兴铜矿，粒径为200目)的普通自来水中，45℃培养一周后，取50mL浸出液，过滤后检测其中的铜和铁离子浓度计算铜和铁的浸出效率。结果表明，菌系Acidithiobacillus caldus 0Y对铜的浸出效率为37.62％，铁的浸出效率为29.43％。菌系JQ-3Y对铜的浸出效率为22.61％，铁的浸出效率为34.43％。

Claims (2)

1.一种用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系，其特征在于，该复合菌系由嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiomicrobium ferrooxidans)、嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)和铁原体属(Ferroplasma sp.)组成，其中，嗜酸氧化亚铁硫杆菌占81％，嗜酸喜温硫杆菌占13％，铁原体属占6％；该复合菌系已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址位于武汉大学内，保藏日期为2011年1月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2010356。
2.一种利用如权利要求1所述中温浸矿复合菌系的浸矿工艺，其特征在于，将权利要求1所述中温浸矿复合菌系，接种至含黄铜矿粉1～10重量％的水溶液中，接种量为107～108cuf/ml，在38～48℃培养7～14天。
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