CN105796502A - 一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药制剂领域，具体是一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒，其制备方法以及在治疗乳腺癌中的应用。本发明制备的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒利用白蛋白纳米粒缓释，靶向等性质可改善蓝萼甲素水溶性差，体内消除快，给药困难等不足，本发明的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在药物的增溶、缓释及靶向等方面均表现出非常好的应用前景。

Description

一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药制剂技术领域，具体地说，是一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒及其制备方法以及在乳腺癌治疗中的应用。
背景技术
蓝萼甲素(GlaucocalyxinA，GLA)是一种天然的贝壳杉烯型二萜化合物，具有抗菌、抗凝、抗氧化、免疫抑制、心血管保护等多种生物活性。近年来，越来越多的研究表明，蓝萼甲素具有抗乳腺癌、肝癌、子宫癌、肺癌等多种癌症的作用。
但是蓝萼甲素水溶性差，给药困难，且在体内代谢很快，如在肝微粒体中可代谢生成羟基或双羟基产物，在胆汁中可代谢成异构化产物，因而需长时间大剂量给药才能产生疗效。
人血清白蛋白是人体内成分，其无毒性且易被外周组织降解使其成为理想载体。研究显示，白蛋白纳米粒能够被动靶向肿瘤部位并有效延长半衰期。
乳腺癌细胞表面分泌富含蛋白质酸性半胱氨酸(sPARc)过度表达(>70％)，功能类似白蛋白受体，sPARc能专门吸引和黏附白蛋白，因此将抗肿瘤药物包裹于白蛋白中，能特异性地吸附含有药物的白蛋白并聚集在肿瘤细胞上，从而提高了局部药物浓度，可在循环系统中稳定存在并延长半衰期，增加肿瘤组织对其摄取，增强了治疗效果。
但是关于蓝萼甲素白蛋白纳米粒在药物的增溶、缓释及靶向等方面的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒及其制备方法以及在乳腺癌治疗中的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案包括：
制备一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
载蓝萼甲素白蛋白纳米粒体外抗乳腺癌及乳腺癌干细胞活性分析；
本发明采用无血清培养方法分选富集乳腺癌干细胞，并通过乳腺癌干细胞的特异性抗原标记物CD24-/CD44+进行鉴定。
首先，本发明的第一方面，提供一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒，包含蓝萼甲素药物，人血清白蛋白，以及有机相和水相介质。
所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的平均粒径小于200nm，并且是可无菌过滤的。所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒采用高压均质法制备得到。
所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒中蓝萼甲素药物为有机相的13％-70％(w/v)，优选的蓝萼甲素为有机相的40％(w/v)。
所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒中白蛋白为水相介质的1-3％(w/v)，优选的白蛋白为水相介质的3％(w/v)。
所述的有机相为水相介质的1％-3％(v/v)，优选2％(v/v)。
所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒中有机相为氯仿和乙醇，优选的有机相比例氯仿：乙醇为11:1；所述的水相介质为去离子水。
其次，本发明的第二方面，提供上述载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的制备方法，采用高压均质法，包括以下步骤：
A.有机相配制：将蓝萼甲素药物分散于有机相中；
B.水相配制：将白蛋白完全溶解于水相介质中；
C.然后在高剪切分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
D.将初乳进行高压均质，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液；
E.将步骤D得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液真空旋蒸除去有机相；
F.然后将步骤E得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液通过0.22μm碳酸脂膜，并进一步加热固化后得到所需的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒。
所述的步骤B中水相介质pH值为6.0-6.8，优选pH值为6.2。据报道，蓝萼甲素血浆蛋白结合率为74％-78％之间，不添加其他乳化剂采用人血清白蛋白单纯包载蓝萼甲素药物制得的纳米粒包封率较低，稳定性较差。要制备高包封率、高稳定性的蓝萼甲素白蛋白纳米粒需要前期大量筛选制备处方及工艺条件，本发明前期摸索大量条件后得出pH为载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的关键且必备条件，且适宜的pH条件范围较窄，在此范围外均不能得到较符合要求的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒。
所述的步骤C中高剪切的转数为5000-40000rpm，优选的转数为32000rpm。
所述的步骤D中高压均质的压力为6000-40000psi，优选的均质压力为32000psi。
所述的步骤D中高压均质的循环数为3-32次，优选的均质循环数为8次。
所述的步骤E中旋蒸温度为40-60℃，优选的旋蒸温度为40℃。
所述的步骤F中固化温度为80-120℃，优选的固化温度为100℃。所述的步骤F中固化时间为8-12min，优选的固化温度为10min。在已有NabTM技术基础上，本发明将制备的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒进行加热固化，固化后制得的蓝萼甲素白蛋白纳米粒大大提高了制剂稳定性，在非冻干条件下亦可保存较长时间。固化加热的温度和时间会直接影响载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的形态，固化不够不能形成稳定的纳米粒，固化过火则会使白蛋白变性，破坏白蛋白纳米粒。
最优选的，上述载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的制备方法，采用高压均质法，具体制备方法如下：
1)有机相配制：称取蓝萼甲素药物混合于有机相中；
2)水相配制；将去离子水调节pH至6.2，将白蛋白完全溶解于去离子水中；
3)高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
4)将初乳进行高压均质(32000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液；
5)将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；
6)将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液通过0.22μm碳酸脂膜后进一步加热固化(100℃，10min)得到所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒。
最后，本发明的第三方面，提供上述任一载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒用于制备非胃肠道给药的医药产品。所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒可以直接静脉注射。
所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒靶向乳腺癌细胞或乳腺癌干细胞。
本发明采用cck-8检测方法测定在不同给药剂型、给药时间和给药浓度处理情况下乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的细胞存活率，来评价载蓝萼甲素白蛋白纳米粒对乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的细胞毒性。经拟合曲线分析，比较不同处理情况下的IC50值来比较其毒性大小。
本发明制备的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒利用纳米粒缓释，靶向等性质可改善蓝萼甲素水溶性差，体内代谢快，给药困难等不足，本发明的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在药物的增溶、缓释及靶向等方面均表现出非常好的应用前景。
附图说明
图1A为本发明的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的粒径分布图，图1B为表面电位图；
图2为本发明载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的透射电镜图；
图3为本发明载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的释放行为图；
图4A，B，C为本发明蓝萼甲素白蛋白纳米粒对MCF-7细胞的24h，48h，72h的杀伤效果图，D为24h，48h，72h细胞IC50值差异统计图；
图5A，B，C为本发明蓝萼甲素白蛋白纳米粒对MCF-7-TS肿瘤球的24h，48h，72h的杀伤效果图，D为24h，48h，72h细胞IC50值差异统计图；
图6为本发明蓝萼甲素白蛋白纳米粒对MCF-7细胞的凋亡效果图；
图7为本发明蓝萼甲素白蛋白纳米粒对MCF-7-TS肿瘤球的凋亡效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不限制本发明。除特有说明外，所有的％均为重量体积浓度。
实施例1
有机相配制：将蓝萼甲素药物(13.33％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至4.0，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(8000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为84.77±2.050nm，Zeta电位为-17.73±3.772，包封率为22.69％，其稳定性<48h。
实施例2
有机相配制：将蓝萼甲素药物(26.66％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至4.0，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(16000psi，16次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为121.07±31.13nm，Zeta电位为-21.20±2.514，包封率为39.68％，其稳定性<48h。
实施例3
有机相配制：将蓝萼甲素药物(40％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至4.0，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(24000psi，24次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为191.77±19.25nm，Zeta电位为-20.1±0.860，包封率为53.23％，其稳定性<48h。
实施例4
有机相配制：将蓝萼甲素药物(53.33％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至4.0，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(32000psi，32次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为158.03±3.307nm，Zeta电位为-18.70±0.816，包封率为37.47％，其稳定性<48h。
实施例5
有机相配制：将蓝萼甲素药物(40％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至5.0，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(8000psi，16次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为95.03±3.256nm，Zeta电位为-21.37±0.694，包封率为31.43％，其稳定性<48h。
实施例6
有机相配制：将蓝萼甲素药物(53.33％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至5.0，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(16000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为92.99±1.030nm，Zeta电位为-17.97±0.007，包封率为54.50％，其稳定性<48h。
实施例7
有机相配制：将蓝萼甲素药物(13.33％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至5.0，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(24000psi，32次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为104.13±0.822nm，Zeta电位为-22.90±1.776，包封率为30.09％，其稳定性<48h。
实施例8
有机相配制：将蓝萼甲素药物(26.66％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至5.0，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(32000psi，24次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为98.99±0.672nm，Zeta电位为-15.13±0.492，包封率为49.90％，其稳定性<48h。
实施例9
有机相配制：将蓝萼甲素药物(53.33％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.2，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(8000psi，24次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为83.60±1.241nm，Zeta电位为-36.0698±3.772，包封率为68.80％，其稳定性>48h。
实施例10
有机相配制：将蓝萼甲素药物(40％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.2，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(16000psi，32次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为145.03±11.586nm，Zeta电位为-26.00±1.349，包封率为75.43％，其稳定性<48h。
实施例11
有机相配制：将蓝萼甲素药物(26.66％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.2，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(24000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为27.53±3.152nm，Zeta电位为-17.83±2.370，包封率为77.82％，其稳定性<48h。
实施例12
有机相配制：将蓝萼甲素药物(13.33％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.2，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(32000psi，16次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为130.03±1.519nm，Zeta电位为-18.20±1.846，包封率为80.13％，其稳定性>48h。
实施例13
有机相配制：将蓝萼甲素药物(26.66％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.8，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(8000psi，32次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为119.83±2.855nm，Zeta电位为-24.80±0.510，包封率为26.15％，其稳定性<48h。
实施例14
有机相配制：将蓝萼甲素药物(13.33％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.8，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(16000psi，24次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为56.30±0.216nm，Zeta电位为-18.33±2.963，包封率为28.06％，其稳定性<48h。
实施例15
有机相配制：将蓝萼甲素药物(53.33％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.8，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(24000psi，16次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为109.64±15.171nm，Zeta电位为-15.50±3.197，包封率为51.86％，其稳定性<48h。
实施例16
有机相配制：将蓝萼甲素药物(40％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.8，加入白蛋白(1％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(32000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为126.90±2.393nm，Zeta电位为-16.23±3.772，包封率为67.56％，其稳定性<48h。
实施例17
有机相配制：将蓝萼甲素药物(26.66％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.2，加入白蛋白(3％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(32000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤；
将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在100℃条件下固化10min。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为163.97±5.14nm，Zeta电位为-32.53±0.325，包封率为89.28％，其稳定性>48h。
实施例18
有机相配制：将蓝萼甲素药物(26.66％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.2，加入白蛋白(2％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(32000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤；
将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在100℃条件下固化10min。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为247.40±4.187nm，Zeta电位为-31.33±0.551，包封率为65.42％，其稳定性>48h。
实施例19
有机相配制：将蓝萼甲素药物(66.66％)分散于有机相中；
水相配制；将去离子水调节pH至6.2，加入白蛋白(3％)充分溶解；
在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；
将初乳进行高压均质(32000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；
将得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在40℃下真空旋蒸60min除去有机相；将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤；
将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在100℃条件下固化10min。
该纳米粒混悬液用马尔文粒度测定仪进行测定，其平均粒径为301.57±4.274nm，Zeta电位为-30.23±0.289，包封率为88.00％，其稳定性>48h。
实施例20载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的制备与表征
采用高压均质法，制备载蓝萼甲素白蛋白纳米粒。简要步骤如下有机相配制：将蓝萼甲素药物(26.66％)分散于有机相中；将白蛋白(3％)加入pH为6.2的去离子水中充分溶解；在高剪切(32000rpm，5min)分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；将初乳进行高压均质(32000psi，8次)，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒；在40℃下真空旋蒸60min除去有机相后通过0.22μm碳酸脂无菌滤膜过滤；继续在100℃条件下固化10min得到需要的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒。用去离子水将载蓝萼甲素白蛋白纳米粒按1:10稀释，取1ml置于样品池中，采用马尔文粒径仪检测载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的粒径分布和电位分布(图1A，B)；采用透射电镜观察载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的形态(图2)，其结果与马尔文粒径仪结果相符。
考察载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在PBS溶液(pH为5.0和7.4)中的释放行为(图3)。简要步骤如下，分别取1ml载蓝萼甲素白蛋白纳米粒置于截留分子量为3-5kDa的透析管中，加入25ml的释放介质，置于37℃、100rpm的摇床中。于规定时间点各取2ml释放介质，并补充2ml新鲜释放介质。经真空干燥后，用甲醇：水(1:1)重新溶解，进样分析。
采用高压均质法，我们成功制备载蓝萼甲素白蛋白纳米粒并对其进行表征，所得载蓝萼甲素白蛋白纳米粒分布均匀、粒径在150nm附近、Zeta电位在-30mV附近；载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在24h、48h和96h的累计释放量为47.37％、62.15％和71.92％，120h基本能够完全释放。且在120h内表现出一定程度的缓释效果。
实施例21载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的细胞毒性
采用cck-8检测方法考察在不同给药剂型、给药时间和给药浓度处理情况下乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的细胞存活率，来评价载蓝萼甲素白蛋白纳米粒对乳腺癌细胞(MCF-7)(北京大学医学院吕万良教授实验室惠赠，该细胞株可于中科院购买)及乳腺癌干细胞(MCF-7-TS)的细胞毒性。
步骤如下，MCF-7和MCF-7-TS消化为单细胞，计数3000/孔接种于96孔板，孵育12h，将培养基弃掉，加入含有不同浓度药物的新鲜培养基，分别孵育24h、48h和72h。弃掉含药培养基，PBS轻洗一次后，每孔加入含10％cck-8的新鲜培养基，继续孵育2-6h。用酶标仪检测450nm处OD值计算细胞存活率(细胞存活率(％)＝(实验组OD值-阴性对照组OD值)/(空白对照组OD值-阴性对照组OD值)×100％))。利用拟合曲线计算相同给药时间点时不同给药方式处理后的IC50值。上述IC50值的比较由t检验进行统计分析。
体外细胞毒性实验显示(图4，5)。如图4(A、B、C)和5(A、B、C)所示，蓝萼甲素和载蓝萼甲素白蛋白纳米粒对MCF-7细胞系和MCF-7-TS肿瘤球均有细胞毒性作用并具有时间依赖性，载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在24h、48h和72h对MCF-7细胞系作用的IC50值分别为4.89±1.21、2.53±0.41、2.46±0.11，蓝萼甲素的IC50值分别为15.60±0.71、7.60±1.27、6.83±0.43，载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在24h、48h和72h对MCF-7-TS作用的IC50值分别为3.26±0.21、2.75±0.45、2.74±0.25，蓝萼甲素的IC50值分别为9.38±2.22、6.28±1.10、5.69±0.75，在两种细胞系中载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的细胞毒性均强于蓝萼甲素作用且IC50均具有统计学差异(p<0.05)(图4D和5D)。
实施例22载蓝萼甲素白蛋白纳米粒诱导细胞凋亡
为了进一步研究载蓝萼甲素白蛋白纳米粒对细胞凋亡产生的影响，本课题采用FITC和PI标记的AnnexinV(FITC-AnnexinV)试剂盒标记凋亡细胞后，进行流式细胞仪分析。通过PI和FITC呈现的不同荧光标记，可以分辨出细胞的不同凋亡时期：PI+/FITC-为坏死细胞、PI+/FITC+为晚期凋亡细胞、PI-/FITC+为早期凋亡细胞。
具体步骤如下：
接种10*104个MCF-7和MCF-7-TS细胞于6孔板，孵育过夜后弃掉培养基，加入新鲜含药培养基继续孵育48h。实验设置为空白对照组、空白白蛋白纳米粒组、游离蓝萼甲素组和载蓝萼甲素白蛋白纳米粒组共4组，每组3个复孔。
收集培养基，将细胞用无EDTA胰酶消化后的单细胞悬液与前述收集的培养基混合，离心后用PBS小心清洗一次，加入300μlBuffer(1X)重悬，每个样品加入5μl的FITC充分混合后于4℃孵育15min，再加入5μ了的PI避光进入流式细胞仪检测。
图6为MCF-7细胞系凋亡图，图7为MCF-7-TS凋亡图。如图中所示，在MCF-7细胞系和MCF-7-TS中，未经任何药物处理的细胞总凋亡比例分别为5.16％和2.64％，空白白蛋白纳米粒处理后细胞凋亡比例分别为8.00％和3.76％，说明空白纳米粒不能起到诱导凋亡的作用，而给予蓝萼甲素和载蓝萼甲素白蛋白纳米粒处理后，MCF-7细胞系和MCF-7-TS的凋亡比例均显著增加，且对比空白对照组均具有统计学差异(P<0.05)，给予相同浓度和时间处理的情况下,载蓝萼甲素白蛋白纳米粒诱导MCF-7细胞系和MCF-7-TS凋亡效果明显优于蓝萼甲素，且具有统计学差异(P<0.05)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种载蓝萼甲素白蛋白纳米粒，其特征在于，包含蓝萼甲素药物，人血清白蛋白，以及有机相和水相介质；所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒中蓝萼甲素药物为有机相的13％-70％w/v，所述的白蛋白为水相的1％-3％w/v，所述有机相为水相的2％v/v。
2.根据权利要求1所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的平均粒径小于200nm。
3.根据权利要求1所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的有机相为氯仿和乙醇；所述的水相介质为去离子水。
4.一种如权利要求1所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，采用高压均质法，包括以下步骤：
A.有机相配制：将蓝萼甲素药物分散于有机相中；
B.水相配制：将白蛋白完全溶解于水相介质中，所述的水相介质pH值为6.0-6.8；
C.在高剪切分散的同时将有机相缓慢注入至水相中得到初乳；所述的高剪切速度为5000-40000rpm；
D.将初乳进行高压均质，得到均一分散的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液，所述的高压均质的压力为6000-40000psi；
E.将步骤D得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液真空旋蒸除去有机相；
F.将步骤E得到的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒混悬液通过0.22μm碳酸脂膜，并进一步加热固化后得到所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒。
5.根据权利要求4所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤D中高压均质次数为3-32次。
6.根据权利要求4所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤E中旋蒸温度为40-60℃。
7.根据权利要求4所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤F中固化温度为80-120℃。
8.根据权利要求4所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤F中固化时间为8-12min。
9.一种如权利要求1-3任一所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的载蓝萼甲素白蛋白纳米粒靶向乳腺癌细胞或乳腺癌干细胞。
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