CN105785055A - 一种细菌表面abo血型抗原的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细菌表面的ABO血型抗原的检测方法。所述检测方法基于细菌表面多糖的结构与人类ABO血型抗原相似而具有血型物质活性的特点，通过细菌固定化处理并利用人的ABO血型天然抗体与细菌表面多糖相互作用，以多功能酶标仪实现细菌表面ABO血型抗原的检测。利用本发明提供的细菌表面ABO血型抗原的检测方法，简单易操作，稳定性好，能够实现大批量检测，克服了之前的检测方法需靠肉眼观察凝集情况的弊端，结果更直观可靠，具有极大的应用前景。

Description

一种细菌表面ABO血型抗原的检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细菌表面的ABO血型抗原的检测方法。
技术背景
ABO血型系统包含A、B、O和AB型四种血型，其血型抗原的本质是糖蛋白和糖脂，血型是由糖链末端的组成和结构决定的。O型血人的血红细胞(RBC)表面表达H抗原(GlcNAc-β1,4-Gal-α1,2-Fuc)；B型RBC含B抗原，它的非还原端在H抗原的基础上多一个α–1,3半乳糖苷；而A型抗原较为复杂，主要分为A1和A2两种亚型。通常提到的A型抗原指的是A2型，它比H抗原多一个α–1,3-N-乙酰半乳糖胺(α-1,3-N-GalNAc)。
细菌无处不在，在人类生存的环境中，人体口腔、皮肤、肠道等部位均分布着各种各样的细菌。细菌表面多糖以共价或非共价的形式与细菌结合，介导细菌与宿主间的相互作用、保护细菌逃离宿主的免疫清除，有些还是细菌致病的关键毒力因子。由于与细菌表面连接方式的不同，细菌表面多糖可以分为三种类型：脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、荚膜多糖(capsularpolysaccharide,CPS)和胞外多糖(exo-polysaccharide,EPS)。脂多糖是革兰氏阴性菌外膜的重要组成成分，也叫内毒素，是一种热源和炎症刺激因子。几乎所有革兰氏阴性菌的LPS结构都相同，从内到外依次为类脂A(lipidA)、核心寡糖(coreoligosaccharide)和O-多糖(O-polysaccharide,O-PS)。O-PS也叫O抗原，是由多个寡糖重复单位重复排列构成的，每个重复单位一般由3-6个单糖组成。不同细菌的O-重复单位中有不同的单糖组成，单糖间形成的糖苷键连接位置和立体化学构型不同并且这些重复单位间的连接方式也不同，这些特性使得O-PS成为细胞结构中最多样的成分之一。大肠杆菌中不同的O-PS就达180多种，由于不同的抗原性，大肠杆菌也被分为不同的O-血清型，例如E.coliO86和O157。荚膜多糖是由多个重复单元构成的线性多聚体，常被乙酰基，其它酰基，磷酸基和硫酸基修饰，同样表现出复杂的多样性，例如，能引起肺炎、脑膜炎和血液感染的肺炎链球菌就有90多种不同结构的CPS。胞外多糖是细菌分泌到细胞外的多糖，有些细菌只在生长的对数期和稳定期分泌而有些细菌则在生长的全程均可分泌EPS。EPS通常形成黏液，不与细胞直接连接，一般有大于1000个的重复单位，分子量更大。
由于细菌表面种类繁多的糖结构，不可避免的某些细菌表面多糖会与人类ABO血型抗原相同或相似。E.coliO86的O-多糖(O-PS)重复单元中非还原端三糖Gal-α1,3-(L-Fuc-α1,2)-Gal与人血型B抗原组成和结构相同，当肠道功能失调的人摄入E.coliO86后，80％的O型或者A型个体中anti-B抗体明显提高；并且当鸡摄入E.coliO86后，其体内将会产生anti-B抗体。此外，血型凝集素也能在一定程度上抑制甚至杀死拥有血型物质活性的细菌。人体肠道菌群表面也存在多种多样的糖结构，人体内的ABO血型抗体是否对人体肠道内的菌群产生影响仍有待研究。
早期有实验室用间接免疫抑制实验检测了一些革兰氏阴性菌，发现有近一半的检测细菌中存在能与人类血型抗体发生免疫反应的抗原。但该检测方法耗时费力，需要依靠人的肉眼观察判定结果，且只能检测单一细菌的表面血型抗原。而检索发现，能大批量检测细菌表面ABO血型抗原的方法未见报道，而关于人体肠道菌群表面的ABO血型抗原检测方法更未见报道。基于此，亟待建立和开发新的可以准确批量检测细菌表面ABO血型抗原的方法。
发明内容
为解决大批量检测细菌表面ABO血型抗原问题，本发明提供了一种细菌表面ABO血型抗原的检测方法。
一种细菌表面ABO血型抗原的检测方法，所述检测方法基于细菌表面多糖的结构与人类ABO血型抗原相似而具有血型物质活性的特点，通过细菌固定化处理并利用人的ABO血型天然抗体与细菌表面多糖相互作用，以多功能酶标仪实现细菌表面ABO血型抗原的检测。
所述检测方法的步骤如下：
(1)肠道菌群的分离提取；
(2)菌体的固定；
(3)菌体表面ABO血型抗原活性的检测。
所述ABO血型天然抗体来源于鼠的IgM型抗血型A物质抗体或IgM型抗血型B物质抗体。
所述细菌指革兰氏阴性的所有同一种类的细菌或分离的肠道菌群。
所述细菌指革兰氏阳性的所有同一种类的细菌或分离的肠道菌群。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明公开的细菌表面ABO血型抗原的检测方法表现出良好的检测效果，具有非常重要的应用价值。以已知的细菌表面脂多糖含有人类B血型物质的大肠杆菌O86为检测对象，以大肠杆菌BL21为对照检验此方法的可行性，结果显示此细菌表面ABO血型抗原的检测方法能够准确的检测出细菌表面的ABO血型抗原。
(2)利用本发明提供的细菌表面ABO血型抗原的检测方法，简单易操作，稳定性好，能够实现大批量检测，克服了之前的检测方法需靠肉眼观察凝集情况的弊端，结果更直观可靠，具有极大的应用前景。
附图说明
图1为大肠杆菌表面ABO血型抗原活性的检测结果图。
具体实施方式
一种细菌表面ABO血型抗原的检测方法，所述检测方法基于细菌表面多糖的结构与人类ABO血型抗原相似而具有血型物质活性的特点，通过细菌固定化处理并利用人的ABO血型天然抗体与细菌表面多糖相互作用，以多功能酶标仪实现细菌表面ABO血型抗原的检测。
所述检测方法的具体步骤如下：
(1)肠道菌群的分离提取；
(2)菌体的固定；
(3)菌体表面ABO血型抗原活性的检测。
所述ABO血型天然抗体来源于鼠的IgM型抗血型A物质抗体或IgM型抗血型B物质抗体。
所述细菌指革兰氏阴性的所有同一种类的细菌或分离的肠道菌群。
所述细菌指革兰氏阳性的所有同一种类的细菌或分离的肠道菌群。
下面结合实施例对本发明做进一步描述，实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
PBS溶液为：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4，pH7.4。
LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。
具体操作步骤为：
1、肠道菌群的分离提取
(1)志愿者排净小便后将粪便排入干净的盛便器内，用一次性采样勺将新鲜样品转移入几个采样管中，立即置于冰上并尽快运至实验室，冻存于-80℃备用。
(2)从-80℃的冰箱中取出粪便样品，每个样品称取0.5g粪便，加入5mL的PBS溶液，涡旋震荡10min直到溶液中没有团块存在。
(3)将浑浊液以500rpm的转速离心5min。
(4)将离心后的上清液转移到另一干净的离心管中，10000rpm离心10min，弃去上清液。
(5)用20mLPBS将菌体重悬，10000rpm离心10min，弃去上清液。
(6)重复步骤(5)，直到离心后的上清变得无色透明。
(7)将从粪便样品中分离到的肠道菌群分成两份，一份加入20％甘油并保存在-80℃冰箱中，另一份用来检测。
2、菌体的固定
(1)将从粪便样品中分离的菌体分别用1mLPBS重悬后，加入4mL的Karnovsky溶液(5％的40％甲醛，8％的25％戊二醛，0.1M的PB)，充分混匀。在4℃下放置30min。
(2)在其中加入25mLPBS混匀，7000rpm离心7min。
(3)弃去上清后迅速用含有6％BSA的PBS溶液充分重悬，确保重悬液中无颗粒状物质。
(4)将重悬液转移至干净的1.5mL离心管中后放置3min，随后7000rpm离心7min。
(5)弃去上清后，用含有0.6％BSA的PBS溶液充分重悬，并确保重悬液中无颗粒状物质，7000rpm离心7min。
(6)重复步骤5一次，最后将菌体用1mLPBS重悬并保存在4℃下。
3、菌体表面ABO血型抗原活性的检测
(1)用PBS将每个待检测样品的菌体浓度稀释到OD600为0.372，取3mL菌液分装到3管中，每管1mL并分别标记为管A、管B和管C，7000rpm离心7min，弃掉上清。
(2)在管A中加入300μL经PBS5倍稀释的抗A抗体，在管B中加入300μL经PBS5倍稀释的抗B抗体，在管C中加入300μL的PBS作为对照，然后放入4℃下孵育1h，中间每隔20min取出震荡混匀，使抗体与菌体充分接触。
(3)取出所有样品，7000rpm离心7min，轻轻吸出上清，避免吸到菌体沉淀。
(4)用1.4mLPBS重悬菌体，7000rpm离心7min，轻轻吸出上清。
(5)重复步骤4，清洗菌体4次以洗掉细菌表面非特异性吸附的抗体，以防对后期检测的结果产生影响。
(6)在所有样品中都加入200μL经1：200稀释的FITC标记的兔抗鼠IgM二抗，充分混匀后常温避光放置1h，中间每隔20min取出震荡混匀，使抗体与菌体充分接触。
(7)按上述的步骤(3)、(4)和(5)处理样品，所有操作在避光条件下进行。
(8)将样品中的二抗洗净后，用400μLPBS重悬菌体并加入96孔板中，每个样品两个复孔，每个孔200μL，用PBS做对照。
(9)用多功能酶标仪检测所有经过处理的样品的OD600值，并在激发光波长488nm,发射波长525nm的条件下检测样品的荧光强度。
并根据公式计算每OD的样品通过结合抗体所产生的荧光强度，以此来反映样品结合抗体的多少从而说明菌体表面分布的血型抗原的多少。公式为：[荧光值(管A/管B样品)-荧光值(PBS)]/[OD600(管A/管B样品)-OD600(PBS)]。
4、大肠杆菌O86和BL21的表面ABO血型抗原活性的检测
将大肠杆菌O86和BL21分别用10mLLB培养基活化培养12h，10000rpm离心5min，1mLPBS重悬后，按照上述方法检测大肠杆菌O86和BL21表面的ABO血型抗原。
表1不同样品的荧光强度
结果如图1所示，大肠杆菌O86与不含血型抗体的PBS作用后，每OD的平均荧光值为476.9，与抗A抗体作用后，每OD的平均荧光值为534.8，与抗B抗体作用后，每OD的平均荧光值为2308.6。这是由于大肠杆菌O86表面具有与人类B血型抗原相同糖结构的脂多糖，能够与更多的抗B血型物质的抗体结合，而几乎不能与抗A血型物质的抗体结合。相反，大肠杆菌BL21由于表面没有与人类ABO血型抗原相同的糖结构，所以既不与抗A的抗体结合也不与抗B的抗体结合，它与不含血型抗体的PBS作用后，每OD的平均荧光值为457.3，与抗A抗体作用后，每OD的平均荧光值为572.8，与抗B抗体作用后，每OD的平均荧光值为559.8。
由此说明，本发明细菌表面ABO血型抗原的检测方法准确可靠，可以快速的完成高通量检测。

Claims (5)

1.一种细菌表面ABO血型抗原的检测方法，其特征在于：通过细菌固定化处理并利用人的ABO血型天然抗体与细菌表面多糖相互作用，以多功能酶标仪实现细菌表面ABO血型抗原的检测。
2.如权利要求1所述的细菌表面ABO血型抗原的检测方法，其特征在于：所述检测方法的步骤如下：
（1）肠道菌群的分离提取；
（2）菌体的固定；
（3）菌体表面ABO血型抗原活性的检测。
3.如权利要求1或2所述的细菌表面ABO血型抗原的检测方法，其特征在于：所述ABO血型天然抗体来源于鼠的IgM型抗血型A物质抗体或IgM型抗血型B物质抗体。
4.如权利要求1或2所述的细菌表面ABO血型抗原的检测方法，其特征在于：所述细菌指革兰氏阴性的所有同一种类的细菌或分离的肠道菌群。
5.如权利要求1或2所述的细菌表面ABO血型抗原的检测方法，其特征在于：所述细菌指革兰氏阳性的所有同一种类的细菌或分离的肠道菌群。
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