CN105769372A - 风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立方法、装置及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立方法包括以下步骤：步骤一，切断大鼠膝关节前交叉韧带造成关节失稳；步骤二，2周后，将步骤一处理的大鼠每日置于冰水中活动1h，连续4周，获得风寒湿麻痹型膝骨关节炎模型。本发明还公开了一种用于模型建立的装置及使用方法，本发明方法和装置操作简单，效果明确，可重复性强，将现代医学对骨关节炎发病机制与传统医学骨痹病因学说相结合，基于大鼠膝骨关节力学失稳为基础，添加寒凉刺激为诱加因素，从而建立力学失稳基础的风寒湿痹型膝骨关节炎模型。

Description

风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立方法、装置及使用方法

技术领域

本发明属于动物模型建立技术领域，涉及一种大鼠风寒湿痹型膝骨关节炎建立模型的方法,具体涉及一种具有力学失稳基础的风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立的方法、装置及其使用方法。

背景技术

膝骨关节炎(kneeosteoarthritis,KOA)是以关节软骨进行性退变为基本病变的一种慢性疾病，一般认为其原发病变在软骨并逐渐影响到滑膜、软骨下骨、关节囊等组织。其主要特征表现为软骨进行性退变，软骨下骨质硬化以及在关节边缘骨赘形成和继发性的滑膜炎。随着人口老龄化加重，KOA的发病率和患病人数正逐年增加。由于引起软骨退变的机制尚未完全明了，目前的治疗方法尚不能令人满意。本病属中医学“骨痹”“痹病”“鹤膝风”等范畴。多数医家认为本病为肝肾亏虚为本,复感受风寒湿邪致痹为标。中医药防治膝骨关节炎有着两千多年的历史，最早见于《黄帝内经》，其中《素问·百病始生》曰：“风雨寒热，不得虚，邪不能独伤人，卒然逢疾风暴雨而不病者，盖无虚，故邪不能独伤人，此(痹病)必因虚邪之风，与其身形，两虚相得，乃客其形。”随着中医理论的不断发展和对其药理研究的不断深入，中医药在治疗膝骨关节炎KOA方面取得了良好的临床疗效。中医药组方讲究整体观念及辩证论治，组方复杂，且传统中医理论论述骨痹病因与现代医学理论不尽相同，如何将传统中医理论及中药方剂的作用机理更为科学直观的呈现出来，标准化中医动物模型的复制成为推动中医药现代化的重要环节，因此我们运用现代医学技术手段，切断大鼠膝关节前交叉韧带造成力学失衡，结合传统中医病因学理论，术后2周后将模型组大鼠随机分成两组，一组正常饲养，另一组放入盛有4℃冰水中(冰水高度为6cm，以没过大鼠后肢为宜)1小时每天，连续观察4周，分别在2周、4周后进行各项指标检测。

现有的技术依然存在以下问题：1)现有技术所造成创伤大，不利于进行药物试验；原因：现有技术将大鼠膝关节中前后交叉韧带、内侧副韧带及半月板切除，术后创伤较大，导致的膝骨关节炎以属于膝骨关节炎中后期，药物效果很难有高效直观的表达。这种现象在临床中也有所体现，膝骨关节炎晚期膝关节置换是目前较为理想的治疗手段；2)现有技术未将传统中医病因理论考虑在内；原因：现代医学认为本病可因创伤后引起力学失稳，引起关节内炎症反应，进而导致骨关节炎的发生。而中医理论认为骨关节痹证的发生为风寒湿之邪，乘虚袭入骨节引起气血运行不畅，瘀痰阻滞经络，聚于骨节、肌肉、经脉发病。它与机体正气的盛衰及气候条件、生活环境有密切关系。因此现有技术未能体现中医临床治疗骨关节炎方药配伍时所依据的整体观念及辩证论治。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题，提供一种风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立的方法、装置及其使用方法。

本发明的第一个方面，提供一种风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立的方法，包括：

步骤一，切断大鼠膝关节前交叉韧带造成关节失稳；

步骤二，2周后，将步骤一处理的大鼠每日置于冰水中活动1h，连续4周，获得风寒湿痹型膝骨关节炎模型。

进一步地，所述步骤一中，所述切断大鼠膝关节前交叉韧带的步骤具体包括：

步骤1，禁食8h后麻醉，充分暴露膝关节后进行备皮操作，切皮时屈曲膝关节，使膝关节皮肤绷紧，沿膝关节内侧髌旁作2mm纵向切口，暴露白色髌韧带；

步骤2，分离髌韧带，沿髌韧带内侧向上找到髌骨及股四头内侧头，部分分离后，伸直膝关节，将膝关节向外侧推后屈曲膝关节，暴露股骨远端，部分切开关节囊，暴露前交叉韧带，直视下切断前交叉韧带，并进行抽屉试验验证；

步骤13，伸直膝关节，将髌骨复位，缝合关节腔，缝合皮肤。

进一步地，所述步骤二中，将步骤一处理2周后的大鼠，每天放入冰水中活动1h，冰水水温4℃，高度6cm没过大鼠双后肢，连续4周，观察指标。

进一步地，所述步骤二中的指标检测方法包括：关节软骨形态、软骨细胞甲苯胺蓝染色、软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色、RT-PCR检测软组织中Ⅱ型胶原及软骨细胞聚集蛋白聚糖基因表达。

本发明的第二个方面，提供一种用于风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立的装置，包括底座1、支脚2和第一台体3，所述第一台体3上开设有第二台体4，所述第二台体4上开设有升降块5，所述第二台体4底部设有分别用于控制第二台体4和升降块5上下移动的升降装置6，所述升降装置6设置于所述支脚2上，所述第一台体3上方设有纵向丝杆导轨7和横向导轨8，所述横向丝杆导轨8上设有移动滑块9，所述移动滑块9的底端安装有刀片10，使得所述刀片10位于所述第二台体4的上方位置。

进一步地，所述升降装置包括伺服电机和驱动杆，所述伺服电机与驱动杆连接，所述驱动杆分别连接所述第二台体4和升降块5，所述升降块5两个且相互平行设置，且所述第二台体4由所述升降装置升起后可水平自由旋转。优选地，所述升降装置为两个，分别与第二台体4和升降块5连接。

进一步地，所述第一台体3的上表面位于所述第二台体4的周边均布有多个固定柱12，且所述第一台体3上还设有冰桶13。

进一步地，所述纵向丝杆导轨7通过伺服电机驱动，所述横向导轨8通过把手11驱动。优选地，所述第二台体4和升降块5连接的升降装置、纵向丝杆导轨7均与控制装置连接，所述控制装置设置于第一台体3上。

本发明的第三个方面，提供一种所述风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立的装置的使用方法，包括：

步骤1，将麻醉后的大鼠固定在所述第二台体4周边的固定柱12上，使大鼠膝关节部位位于升降块5的上方；

步骤2，通过升降装置6升起第二台体4，进行备皮准备，充分暴漏大鼠膝骨关节部位；

步骤3，然后继续通过升降装置6升起第二台体4上的升降块5，使升降块5向上顶起大鼠鼠膝骨关节部位，使膝关节皮肤绷紧，通过旋转第二台体4和固定柱12，使膝关节向外侧推后屈曲膝关节，暴露股骨远端，调整纵向丝杆导轨7和横向导轨8的位置，通过刀片10切断大鼠膝关节前交叉韧带造成关节失稳；

步骤4，将关节失稳失稳的大鼠放进冰桶中进行观察。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本发明的大风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立的方法实验操作简单，效果明确，可重复性强，既克服了现代技术Hulth造模带来的创伤严重，又将传统中医病因学说考虑在内，依序此方法可建立标准化中医动物模型，进而建立病证结合动物模型为中医药理论及防治疾病机制研究提供更为科学有效的基础，将有望成为揭示中医证候内涵，推动中医现代化发展的重要途径；同时采用本发明的建立模型的装置结构简单、使用方便，能够有效提高模型建立的效率准确性，避免了人为过程中操作存在的误差。

附图说明

图1为本发明的一种大鼠风寒湿痹型膝骨关节炎建立模型的大鼠膝关节X线影像学观察图；

图2为本发明的一种大鼠风寒湿痹型膝骨关节炎建立模型的大鼠膝关节关节软骨大体形态观察图；

图3为本发明的一种大鼠风寒湿痹型膝骨关节炎建立模型的组织切片光镜观察图；

图4为本发明的一种大鼠风寒湿痹型膝骨关节炎建立模型的Ⅱ型胶原免疫组化染色光镜观察图；

图5为本发明的大鼠风寒湿痹型膝骨关节炎建立模型装置的整体结构示意图；

图6本发明的大鼠风寒湿痹型膝骨关节炎建立模型装置的俯视图图；

1-底座，2-支脚，3-第一台体，4-第二台体，5-升降块，6-升降装置，7-纵向丝杆导轨，8-横向丝杆导轨，9-滑块，10-刀片，11-把手，12-固定柱，13-冰桶。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

一、实施例

本实施例提供一种大鼠风寒湿痹型膝骨关节炎建立模型的方法，包括：步骤一，切断大鼠膝关节前交叉韧带造成关节失稳；步骤二，2周后，将步骤一处理的大鼠每日置于冰水中活动1h，连续4周，获得风寒湿痹型膝骨关节炎模型。步骤二中的指标检测方法包括：肉眼下观察关节软骨大体形态、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR检测检测关节软骨组织中聚集蛋白聚糖基和Ⅱ型胶原含量表达。具体地，切断大鼠膝关节前交叉韧带的步骤具体包括：

1，选取两组大鼠，每组各6只，禁食8h后麻醉，充分暴露膝关节后进行备皮操作，切皮时屈曲膝关节，使膝关节皮肤绷紧，沿膝关节内侧髌旁作2mm纵向切口，暴露白色髌韧带；

2，分离髌韧带，沿髌韧带内侧向上找到髌骨及股四头内侧头，部分分离后，伸直膝关节，将膝关节向外侧推后屈曲膝关节，暴露股骨远端，部分切开关节囊，暴露前交叉韧带，直视下切断前交叉韧带，并进行抽屉试验验证；

3，伸直膝关节，将髌骨复位，缝合关节腔，缝合皮肤。

4，将步骤一处理2周后的大鼠，每天放入冰水中活动1h，冰水水温4℃，高度6cm没过大鼠双后肢，连续4周，观察指标。

同时本实施例还提供了一种用于建立力学失稳基础的风寒湿痹型大鼠膝骨关节炎模型的装置，包括底座1、支脚2和第一台体3，第一台体3上开设有第二台体4，第二台体4上开设有升降块5，第二台体4底部设有分别用于控制第二台体4和升降块5上下移动的升降装置6，升降装置6设置于支脚2上，第一台体3上设有纵向丝杆导轨7和横向导轨8，横向丝杆导轨8上设有移动滑块，移动滑块9的底端安装有刀片10。

优选地，升降装置包括伺服电机和驱动杆，伺服电机与驱动杆连接，驱动杆分别连接第二台体4和升降块5，升降块5两个且相互平行设置，且第二台体4由升降装置升起后可水平自由旋转。

优选地，第一台体3的上表面位于第二台体4的周边均布有多个固定柱12，且第一台体3上还设有冰桶13。

优选地，纵向丝杆导轨7通过伺服电机驱动，横向导轨8通过把手11驱动。

本实施例还提供了一种模型装置的使用方法，包括：

1，将麻醉后的大鼠固定在第二台体4周边的固定柱12上，使大鼠膝关节部位位于升降块5的上方；

2，通过升降装置6升起第二台体4，进行备皮准备，充分暴漏大鼠膝骨关节部位；

3，然后继续通过升降装置6升起第二台体4上的升降块5，使升降块5向上顶起大鼠鼠膝骨关节部位，使膝关节皮肤绷紧，通过旋转第二台体4和固定柱12，使膝关节向外侧推后屈曲膝关节，暴露股骨远端，调整纵向丝杆导轨7和横向导轨8的位置，通过刀片10切断大鼠膝关节前交叉韧带造成关节失稳；

4，将两组关节失稳失稳的大鼠一组放进冰桶13，另一组放进不含有冰水的桶中进行观察。

二、具体实验检测如下：

分别对两组大鼠每天放入冰水中活动1h，冰水水温4℃，高度6cm没过大鼠双后肢，连续4周，进行肉眼下观察关节软骨大体形态、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR检测检测关节软骨组织中聚集蛋白聚糖基和Ⅱ型胶原含量表达。

关节软骨形态、软骨细胞甲苯胺蓝染色、软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色、RT-PCR检测软组织中Ⅱ型胶原及软骨细胞聚集蛋白聚糖基因表达等指标检测。

1)对两组大鼠膝关节进行X线影像学观察，如图1所示，其中，术后4周：图1a为正常组：图1b为单纯手术组；图1c为手术+冰水活动组；术后6周：图1d为正常组；图1e为单纯手术组；图1f为手术+冰水活动组。

2)大鼠膝关节关节软骨大体形态观察，如图2所示，其中：术后4周：图2a为正常组；图2b为单纯手术组；图2c为手术+冰水活动组；术后6周：图2d为正常组；图2e为单纯手术组；图2f为手术+冰水活动组。

3)组织切片光镜观察结果：

3.3.1甲苯胺蓝染色光镜观察结果，如图3所示，其中：术后4周：图3a为正常组；图3b为单纯手术组；图3c为手术+冰水活动组；术后6周图3d为正常组；图3e为单纯手术组；图3f为手术+冰水活动组。

3.3.2Ⅱ型胶原免疫组化染色光镜观察结果，如图4所示，其中：术后4周：图4a为正常组；图4b为单纯手术组；图4c为手术+冰水活动组；术后6周：图4d为正常组；图4e为单纯手术组；图4f为手术+冰水活动组。

三、技术效果：

通过大鼠膝关节X线影像学观察发现：

空白对照组：X线下可见大鼠膝关节形态正常，关节间隙明显可见，未见明显骨质增生，髌骨形态可，骨小梁排列整齐(见图1中图1a、图1d)。

单纯手术组：术后4周X线下可见大鼠膝关节关节形态正常，关节间隙可见，胫骨平台略见骨质增生，髌骨形态可，骨小梁排列有序；术后6周X线下可见大鼠膝关节形态正常，关节间隙狭窄，胫骨平台间骨折增生，关节周围见钙化点(见图1中图1b、图1e)；

手术+冰水活动组：术后4周X线下可见大鼠膝关节关节形态正常，关节间隙狭窄，胫骨平台见骨质增生，髌骨周缘有轻微钙化，骨小梁排列可；术后6周X线下可见大鼠膝关节可，关节间隙已被钙化增生物质填充，间隙不可见，胫骨平台间骨折增生，髌骨周缘增生明显，髌股关节间隙狭窄(见图1中图1c、图1f)。

通过大鼠膝关节关节软骨大体形态观察发现：

空白对照组：软骨外观光滑，色泽较亮，软骨透明度较高，边缘规整，表面无充血，未见明显软骨缺损；(见图2中图2a、图2d)

单纯手术组：术后4周，膝关节胫骨平台内侧软骨失去原有光泽，变暗淡，部分区域出现轻度充血；术后6周，膝关节周围滑膜增生严重，膝关节软骨表面色泽灰暗，不平整，质地变软,厚度变薄；(见图2中图2b、图2e)

手术+冰水活动组：术后4周，关节囊粘连，软骨面缺少光泽，关节内骨架出现小裂缝；到术后6周左右可以摸到明显的骨刺并韧带粘连，软骨结构破坏较严重(见图2中图2c、图2f)。

通过组织切片光镜观察结果发现：

空白对照组：软骨组织可大致分为四层，为表层、移行层、柱状层和钙化层。表层细胞为梭形，排列与关节软骨表面平行；移行层细胞呈圆形，细胞体积较表层略大，排列无规律；柱状层细胞较大，排列成柱状，与关节表面；垂直钙化层细胞体积最大，排列无规律，软骨基质内有钙质沉着(见图3中图3a、图3d,见图4中图4a、图4d)。

单纯手术组：术后4周，软骨层开始变薄，软骨细胞有部分出现簇聚，较大体积的软骨细胞有向软骨表面移行的趋向(见图3中图3b,见图4中图4b)。术后6周，软骨层继续变薄，软骨细胞开始成簇分布，细胞逐渐减少，排列较混乱(见图3中图3e,见图4中图4e)。

手术+冰水活动组：术后4周，软骨组织学表现为轻度软骨损伤，软骨基质染色不均匀。软骨细胞排列紊乱，潮线完整(见图3中图3c,见图4中图4c)。术后6周，软骨退变，表层凹凸不平，细胞簇集现象更加明显，个别出现软骨细胞增生，且有核碎、核溶现象，软骨表层出现较大缺损区，软骨细胞层分离，软骨下骨及骨小梁有断裂现象，钙化层难以分辨(见图3中图3f,见图4中图4f)。

四、技术效果分析：

通过以上实验结果我们可以得出，单纯手术切断大鼠膝关节前交叉韧带术后6周可获得轻度膝骨关节炎模型，而手术+冰水活动组同样可在术后2周连续冰水中活动刺激4周后，获得轻中度膝骨关节炎模型，本实验的设计将现代医学对骨关节炎发病机制与传统医学骨痹病因学说相结合，基于大鼠膝骨关节力学失稳为基础，添加寒凉刺激为诱加因素，从而建立力学失稳基础的风寒湿痹型膝骨关节炎模型方法。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立方法，其特征在于，包括：

步骤一，切断大鼠膝关节前交叉韧带造成关节失稳；

步骤二，2周后，将步骤一处理的大鼠每日置于冰水中活动1h，连续4周，获得风寒湿痹型膝骨关节炎模型。

2.根据权利要求1所述的模型建立方法，其特征在于，步骤一中，所述切断大鼠膝关节前交叉韧带的步骤具体包括：

步骤1，禁食8h后麻醉，充分暴露膝关节后进行备皮操作，切皮时屈曲膝关节，使膝关节皮肤绷紧，沿膝关节内侧髌旁作2mm纵向切口，暴露白色髌韧带；

步骤2，分离髌韧带，沿髌韧带内侧向上找到髌骨及股四头内侧头，部分分离后，伸直膝关节，将膝关节向外侧推后屈曲膝关节，暴露股骨远端，部分切开关节囊，暴露前交叉韧带，直视下切断前交叉韧带，并进行抽屉试验验证；

步骤13，伸直膝关节，将髌骨复位，缝合关节腔，缝合皮肤。

3.根据权利要求1所述的模型建立方法，其特征在于，所述步骤二中，将步骤一处理2周后的大鼠，每天放入冰水中活动1h，冰水水温4℃，高度6cm没过大鼠双后肢，连续4周，观察指标。

4.根据权利要求1所的模型建立方法，其特征在于，述步骤二中的指标检测方法包括：肉眼下观察关节软骨大体形态、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR检测检测关节软骨组织中聚集蛋白聚糖基和Ⅱ型胶原含量表达。

5.一种用于如权利要求1所述风寒湿痹型膝骨关节炎模型建立的装置，包括底座(1)、支脚(2)和第一台体(3)，其特征在于，所述第一台体(3)上开设有第二台体(4)，所述第二台体(4)上开设有升降块(5)，所述第二台体(4)底部设有分别用于控制第二台体(4)和升降块(5)上下移动的升降装置(6)，所述升降装置(6)设置于所述支脚(2)上，所述第一台体(3)上方设有纵向丝杆导轨(7)和横向导轨(8)，所述横向丝杆导轨(8)上设有移动滑块(9)，所述移动滑块(9)的底端安装有刀片(10)。

6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述升降装置包括伺服电机和驱动杆，所述伺服电机与驱动杆连接，所述驱动杆分别连接所述第二台体(4)和升降块(5)，所述升降块(5)两个且相互平行设置，且所述第二台体(4)由所述升降装置升起后可水平自由旋转。

7.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述第一台体(3)的上表面位于所述第二台体(4)的周边均布有多个固定柱(12)，且所述第一台体(3)上还设有冰桶(13)。

8.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述纵向丝杆导轨(7)通过伺服电机驱动，所述横向导轨(8)通过把手(11)驱动。

9.一种如权利要求5-8任一项所述装置的使用方法，其特征在于，包括：

步骤1，将麻醉后的大鼠固定在所述第二台体(4)周边的固定柱(12)上，使大鼠膝关节部位位于升降块(5)的上方；

步骤2，通过升降装置(6)升起第二台体(4)，进行备皮准备，充分暴漏大鼠膝骨关节部位；

步骤3，然后继续通过升降装置(6)升起第二台体(4)上的升降块(5)，使升降块(5)向上顶起大鼠鼠膝骨关节部位，使膝关节皮肤绷紧，通过旋转第二台体(4)和固定柱(12)，使膝关节向外侧推后屈曲膝关节，暴露股骨远端，调整纵向丝杆导轨(7)和横向导轨(8)的位置，通过刀片(10)切断大鼠膝关节前交叉韧带造成关节失稳；

步骤4，将关节失稳失稳的大鼠放进冰桶中进行观察。