CN105717187A - 一种用于幽门螺杆菌诊断的试剂和试剂盒及检测人体呼出的氨气的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于幽门螺杆菌诊断的试剂和试剂盒及检测人体呼出的氨气的方法；试剂包括邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐的组合物和缓冲剂，试剂盒包括试剂、电极组件、电解质及电化学传感器等；通过试剂盒可以实现氨气的捕收、固定及检测，通过检测人体呼气中氨气含量实现简单快速、安全准确地诊断幽门螺杆菌感染，相对现有试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，能够作为诊断由幽门螺杆菌感染引起的多种疾病的经济有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于幽门螺杆菌诊断的试剂和试剂盒及检测人体呼出的氨气的方法；具体涉及一种医用幽门螺杆菌诊断试剂盒，更具体地，涉及一种通过特定的试剂组合将呼出气氨气转化为电活性中间物并构建电化学传感器对人体幽门螺杆菌进行准确检测的试剂组合及方法。
背景技术
幽门螺杆菌(简称Hp)是引起消化性溃疡和慢性活动性胃炎的罪魁祸首，肠胃溃疡不经有效控制，时间长可导致肠胃癌；Hp检测是肠胃病患者一种必须的、常态性自我健康管理手段，它应该成为肠胃病患者病发用药和疗效评估时的重要、有效指导手段；
目前已有Hp检测方法(如13CUBT法)及已公开的专利(申请号为CN200910110128)提出的试剂盒等所需技术设备复杂、成本高、价格昂贵，不利于广泛推广使用。
因此，亟需开发一种无副作用、操作简单、条件温和并能准确检测幽门螺杆菌感染的方法。本发明旨在克服或者缓解前述部分问题。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的第一个目的是在于提供一种基于检测人体呼气中氨气含量实现简单快速、安全准确地诊断幽门螺杆菌感染的试剂。
本发明的另一个目的是在于提供一种用于快速、准确检测人体呼气中氨气含量来实现诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒。
本发明的第三个目的是在于提供了一种基于检测人体呼气中氨气含量的试剂盒，运用电化学方法，实现快速、灵敏、特异性检测幽门螺杆菌的方法。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种用于幽门螺杆菌诊断的试剂，该试剂包括OPA试剂和碱性缓冲剂；
所述的OPA试剂为邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐的组合物；
所述的邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物具有式1结构：
其中，
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、烷烃基、羟基、卤素、氨基、巯基或羧基。
本发明的方案中试剂主要包括OPA试剂和碱性缓冲剂，碱性缓冲剂主要提供OPA试剂中邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐的碱性反应环境。而邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐主要发生化学反应生成可以与氨气反应的硫缩醛中间物。
优选的方案，OPA试剂中邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐的摩尔比为3.5:1～4.5:1。
优选的方案，碱性缓冲剂选自硼酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
本发明还提供了一种诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，包括尿素胶囊和吹气用导管，还包括所述的用于检测幽门螺杆菌感染的试剂。
优选的方案，试剂盒还包括一个电极组件，所述的电极组件至少包含一个具有检测α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物的工作电极、一个对电极和一个参比电极。
较优选的方案，工作电极选自硼掺杂金刚石电极、玻碳电极或丝网印刷电极。丝网印刷电极包括丝网印刷石墨电极。
优选的方案，试剂盒还包含电解质。
优选的方案，试剂盒包括一个电化学传感器及一个装有所述传感器的容器，所述容器中装有OPA试剂和碱性缓冲剂；所述容器设有一个接收器，用于接收外部气体并引导外部气体进入所述容器。
较优选的方案，试剂盒包括一个用于显示测试结果的读取器。
本发明的试剂盒形状可以采用常见的正方形、长方形、圆形或他们的变体的一种或组合，材质选自纸质、木质、铁质或其带有涂覆层的实体。盒内具有用于固定试剂的容器、电极组件包装和以上提到的其他所有实体成分的泡沫等质软基板，试剂则分装于单个玻璃或塑料瓶/管内。
本发明还提供了一种基于试剂盒电化学检测人体呼出的氨气的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使OPA试剂中的邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐反应，形成硫缩醛中间物；
(b)接收外部含氨气体，含氨气体中的氨气与所述硫缩醛中间物反应，生成α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物；
(c)通过伏安法检测α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物含量。
本发明的检测人体呼出的氨气的方法主要基于试剂盒实现；检测过程首先是接收氨气，以测试者通过吹气用导管将氨气吹入试剂盒内设置的容器中，而容器内的OPA试剂在碱性缓冲溶液中反应生成可以与呼气中氨气进行选择性反应的电活性中间物α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物，通过对这些电活性中间物进行检测，即可精确计算出氨气含量，从而通过人体呼气中氨气含量来判断幽门螺杆菌感染程度。
优选的方案，包含根据检测结果计算氨气含量的步骤。
优选的方案，邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐在碱性缓冲剂中反应生成α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物。
本发明的试剂盒应用于检测因幽门螺杆菌感染而引发的多种疾病。
本发明的一种用于诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒：试剂盒包括普通尿素胶囊、吹气用导管、OPA试剂和碱性缓冲剂。OPA试剂包括邻苯二甲醛或其苯环上氢被烃基、羟基、卤素、氨基、巯基、羧基等任一种或几种基团的组合取代后的物质的任一种或组合,以及巯基乙酸和/或其盐。其中邻苯二甲醛(和/或邻苯二甲醛衍生物)与巯基乙酸(和/或其盐)的比例范围是3.5:1到4.5:1。碱性缓冲剂选自硼酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和磷酸盐缓冲液中的任一种；试剂盒还包括电解质，通常以氯化钾或氯化钠为基础电解质，其中可包含碱性缓冲剂(常为硼酸盐缓冲液)及内标物以确保体系稳定及用于对照确定目标生物标示物浓度。
本发明的电极组件由丝网印刷制得：
a、在一个基底上施加第一油墨；
b、干燥上述第一油墨即可形成一个工作电极；
通常以碳、金、铂、银及它们的氧化物或它们的纳米功能化的衍生物(例如覆有铂纳米颗粒的碳电极)，或它们的复合物(如硼掺杂的金刚石)，丝网印刷的石墨电极，或者是滴汞电极为工作电极材料。其中碳电极为许多实例所使用。这种碳电极选自玻碳电极、金刚石电极、石墨电极或者热解碳电极，相比石墨电极较常用，但使用丝网印刷石墨电极更多。
c、在所述基底上施加第二油墨；
d、干燥上述第二油墨即可形成参比电极；
参比电极具有稳定体系的电极电势且不受待检测物质影响的特点。通常以铅/硫酸铅电极、金属茂络合物参比电极、铜/硫酸铜(II)电极为参比电极。
e、一个对电极；
通常以碳、铂或者是金电极为对电极，该体系中优选碳电极。
f、形成电连接。
本发明的基于试剂盒通过电化学检测呼出气中氨气的方法，包括以下步骤：
a、使OPA试剂反应，以邻苯二甲醛和巯基乙酸钠盐为例进行说明，两者反应生成形成硫缩醛中间物，反应过程如下；
b、使上述中间物与呼出气中的氨气作用，在碱性缓冲剂体系常为硼酸盐缓冲剂中形成生成α-巯基乙酸吲哚盐，反应过程如下；
c、施加一个电压；
d、检测产生的电流信号，反应过程如反应式3；
其中α-巯基乙酸吲哚盐作为人体呼出气氨气的替代物可直接进行检测，另外，所使用的OPA试剂被熟知能可靠得进行反应，从而确保了呼出的所有氨气被全部捕获并间接进行检测。反应式3显示了α-巯基乙酸吲哚盐的电化学反应过程。
本发明的技术方案相对现有技术的效果：
(1)本发明的用于幽门螺杆菌诊断的试剂能实现氨气的有效快速转换成可以直接通过电化学法检测的α-巯基乙酸吲哚盐等，以实现简单快速、安全准确地诊断幽门螺杆菌感染。
(2)本发明的诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒可有效捕收人体呼气中的氨气，且能实现氨气的固定及检测，简单快速、检测准确，通过人体呼气中氨气含量来准确诊断幽门螺杆菌感染。
(3)本发明的诊断幽门螺杆菌感染是通过检测人体呼气中氨气含量的试剂盒实现，检测方法快速、灵敏、具有特异性。
附图说明
【图1】表示100ppm氨气标气(填充气体氮气)的线性扫描伏安测试图；
【图2】表示人体呼吸样外标法测试图；
测试的条件均为：以pH为11.24的硼酸缓冲溶液为气体吸收液，OPA试剂沉积在3mm的丝网印刷的石墨电极表面，扫描速度50mVs-1。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是对本发明权利要求的保护范围的限制。
实施例1
线性扫描伏安法测试100ppm氨气标气(填充气体氮气)
具体操作如下：先将OPA试剂混合反应2min后沉积在3mm的丝网印刷的石墨电极表面，置于pH为11.24的硼酸缓冲溶液中，再向体系中鼓入100ppm氨气标气(填充气体氮气)，作用一段时间后，用Autolab101电化学工作站的线性扫描伏安法测试，设其扫描速度为50mVs-1。
测试的电流信号如图1，有明显氧化峰出现。
实施例2
采用本发明试剂盒，外标法测试人体呼吸样本
1、具体操作如下：
1)受试者应空腹或提前两个小时进食。
2)拿到试剂盒后，温开水服下一粒普通尿素胶囊，等待20-30min.
3)取出试剂盒中两种OPA试剂，混合作用2min后将其沉积在3mm的丝网印刷的石墨电极表面，置于pH为11.24的硼酸缓冲溶液中。
4)受试者通过导管向体系中吹气。作用一段时间后，用Autolab101电化学工作站的线性扫描伏安法测试，设其扫描速度为50mVs-1。
5)于上述测试体系中，测试浓度范围在0.4～8.6ppm的氨标准液。
测试的电流信号如图2，结果表明该人体呼出气中氨的浓度在检测的线性范围内。且电流信号线性区域可达6.02ppm。
综上结果表明，本试剂盒所选剂及其制备方法是通过实际测试的优选组合，能够简单、准确、灵敏地诊断因幽门螺杆菌感染引起的多种疾病。
Claims (12)
1.一种用于幽门螺杆菌诊断的试剂，其特征在于：包括OPA试剂和碱性缓冲剂；
所述的OPA试剂为邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐的组合物；
所述的邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物具有式1结构：
其中，
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、烷烃基、羟基、卤素、氨基、巯基或羧基。
2.根据权利要求1所述的用于幽门螺杆菌诊断的试剂，其特征在于：OPA试剂中邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐的摩尔比为3.5:1～4.5:1。
3.根据权利要求1所述的用于幽门螺杆菌诊断的试剂，其特征在于：所述的碱性缓冲剂选自硼酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
4.一种诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，包括尿素胶囊和吹气用导管，其特征在于：还包括权利要求1～3任一项所述的用于检测幽门螺杆菌感染的试剂。
5.根据权利要求4所述的诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，其特征在于：还包括一个电极组件，所述的电极组件至少包含一个具有检测α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物的工作电极、一个对电极和一个参比电极。
6.根据权利要求5所述的诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，其特征在于：所述的工作电极选自硼掺杂金刚石电极、玻碳电极或丝网印刷电极。
7.根据权利要求4所述的诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，其特征在于：还包含电解质。
8.根据权利要求4所述的诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，其特征在于：包括一个电化学传感器及一个装有所述传感器的容器，所述容器中装有OPA试剂和碱性缓冲剂；所述容器设有一个接收器，用于接收外部气体并引导外部气体进入所述容器。
9.根据权利要求4所述的诊断幽门螺杆菌感染的试剂盒，其特征在于：包括一个用于显示测试结果的读取器。
10.基于权利要求5～9任一项所述的试剂盒电化学检测人体呼出的氨气的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(a)使OPA试剂中的邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐反应，形成硫缩醛中间物；
(b)接收外部含氨气体，含氨气体中的氨气与所述硫缩醛中间物反应，生成α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物；
(c)通过伏安法检测α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物含量。
11.根据权利要求10所述的试剂盒电化学检测人体呼出的氨气的方法，其特征在于：包含根据检测结果计算氨气含量的步骤。
12.根据权利要求10所述的试剂盒电化学检测人体呼出的氨气的方法，其特征在于：邻苯二甲醛和/或邻苯二甲醛衍生物与巯基乙酸和/或巯基乙酸盐在碱性缓冲剂中反应生成α-巯基乙酸吲哚盐和/或α-巯基乙酸吲哚盐衍生物。
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