CN105683367A - 用于增殖病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及水产养殖业领域、养殖鱼和在养殖鱼中疾病的发生。更具体地，本公开提供了用于通过在有核红细胞中体外增殖来制备大量诸如鱼呼肠孤病毒(PRV)的正呼肠孤病毒的方法。本文还提供了用于制备包含正呼肠孤病毒的疫苗组合物的方法。

Description

用于增殖病毒的方法

技术领域

本公开涉及水产养殖业、养鱼业领域和出现在养殖鱼密集群中的感染性疾病。具体地，其涉及增殖在鲑科(Salmonidae)中导致疾病的病毒的方法。

背景技术

水产养殖业是世界上发展最快的食品生产部分，且养鱼业(鱼养殖)将是满足对于动物蛋白的增长要求的主要贡献者。然而，集约生产，包括饲养密集鱼群，导致出现了几种新的传染性疾病。

于1999年首次检出的心脏和骨骼肌炎症(HSMI，heartandskeletalmuscleinflammation)是养殖的大西洋鲑(SalmosalarL.)中越来越重要的疾病。鲑鱼是鲑科，条辐鱼(ray-finnedfish)族，其是目前鲑目分类中唯一存活的科。这些也可以称为鲑科鱼。鲑科包括鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、红点鲑鱼(斑鲑，chars)、淡水白鲑(freshwaterwhitefishes)和河鳟(graylings)。(1)中讨论了HSMI。

HSMI往往发生在将鱼转移至海水之后的5-9个月，且由心外膜炎、心内膜炎和心肌炎、心肌坏死、红骨骼肌的肌炎和坏死表征。累积死亡率可以达到20％，但是发病率更高，因为受影响海域中的大多数鱼表现出心脏中的组织病变。在大西洋鲑中的其他疾病中也可以看到心脏的病理变化，包括胰腺疾病(PD)和心肌病综合症(CMS)。(2)

近年来发现HSMI与新型呼肠孤病毒(reovirus)、鱼正呼肠孤病毒(PRV，piscineorthoreovirus)有关。使用高通量测序识别了病毒基因组，公开了PRV基因组。呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒(Reoviridae)科且公知其感染胃肠系统和呼吸道。鱼呼肠孤病毒属于刺突呼肠孤病毒(Spinareovirinae)亚科中现今分类的属(3)。

鱼正呼肠孤病毒(PRV)具有断开的双链RNA基因组，属于呼肠孤病毒科且是与正呼肠孤病毒属相关的唯一已知的鱼病毒。其他已知的鱼呼肠孤病毒分组在水生呼肠孤病毒(Aquareovirus)属中，但是系统进化分析指示PRV属于普通正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒属的同根分支。PRV具有10个基因组片段，正呼肠孤病毒也是，但是同源蛋白质之间的总体氨基酸一致性非常低，特别是对于表面暴露的蛋白质和非结构蛋白质尤其如此。然而，蛋白质功能中心的几个氨基酸基序对正呼肠孤病毒和PRV是保守的。与大多数的正呼肠孤病毒不同，但与哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)类似，PRV是非融合的(fusogenic)(4，5)。PRV普遍分布于养殖的和野生的大西洋鲑中，且心脏中高负荷的病毒是与HSMI发作一致的发现。在挪威、加拿大和智利已经发现了养殖的大西洋鲑中PRV的普遍存在，且在挪威的野生大西洋鲑和斑鳟(browntrout)(SalmotruttaL.)、和加拿大的野生大麻哈鱼(Chumsalmon)(Oncorhynchusketa)、虹鳟鱼(O.mykiss)和割喉鳟(O.clarkii)中也检测到了该病毒。PRV感染导致疾病的机制在很大程度上仍然是未知的。(6，7)。

Finstad等人(8)通过免疫组织化学(针对PRV表面蛋白σ1的抗体)示出PRV存在于心肌细胞和血细胞中。血细胞中的存在看起来在心肌细胞中的病毒检测之前。

因此鱼正呼肠孤病毒(PRV)是心脏和骨骼肌炎症(HSMI)的病原体。HSMI通过浸润单核CD8阳性细胞由心外膜炎、心内膜炎和心肌炎以及红骨骼肌中的心肌炎表征(9)。

PRV编码外层纤维蛋白(outer-fiberprotein)(σ1/σC)的同源蛋白，其存在于正呼肠孤病毒属中的大部分成员中。在MRV中，σ1蛋白起病毒血凝素和细胞粘附蛋白(cellattachmentprotein)的作用，且用于这种结合的重要的氨基酸残基在PRVσ1蛋白中是部分保守的(4)。

通常使用的鱼细胞系中的PRV培养目前为止还没有成功。通过RT-qPCR测得PRV的负荷与原初和实验感染的鲑鱼两者中的疾病发展相关。

主要在鱼在海水中的生长阶段期间观察到HSMI，受影响海域发病率接近于100％，而累积死亡率在可忽略值至20％变化。受影响的鱼中典型的大体病理变化(grosspathologicchanges)包括循环障碍的迹象，包括苍白心脏、腹水、肝黄、脾肿和血管周围脂肪的瘀点(2)。目前基于心脏和红骨骼肌中的组织病理发现诊断HSMI。通过RT-qPCR测得心脏中的病毒负荷和通过免疫组织化学示出的心肌细胞中存在的病毒蛋白两者都与组织心脏病变的发展相关，并指示PRV在心脏组织中复制(8，9)。尽管心脏病变是HSMI诊断中的主要焦点，但是已经在脾脏和前肾(headkidney)中检测到PRV，其病毒负荷高于心脏的病毒负荷，且已经将源自患病鱼的心脏、肝脏、肾脏/脾脏和血浆的接种物成功用于再现疾病(1)。

在鲑鱼的PRV挑战实验中，存在相对长的温育(培养)期，即从注射6挑战周(wpc)直到观察到心肌炎的首次迹象，以及在共居鱼(同居鱼，cohabitantfish)中出现病理变化之前的另外4周。看起来炎症变化起始于心室外部部分，从心外膜延伸并具体沿着小血管结构到达致密层(9)。此外，在这些早期阶段观察到轻度心内膜炎。与内部海绵层相反，心室的外部致密部分高度血管化。有趣地，在来自实验PRV挑战的鱼的心脏剖面上使用免疫组织化学，检测到心脏病变之前病毒存在于血细胞中的明显图像。检测的PRV阳性细胞包括红细胞和白细胞样细胞两者，但是可利用的物质不适用于进一步表征这些细胞。(8)

之前针对来自四次单独的HSMI发作的现场物质(fieldmaterial)的研究通过电子显微术(EM)在红细胞中一致检测到病毒样颗粒(VLP)，且在前肾中的巨噬细胞中也描述了类似的VLP(10)。已经在鲑鱼的许多物种的红细胞中检测到类似形态的VLP，且在没有特定的病因通知的情况下将这些发现统称为红细胞包涵体综合征(EIBS，Erythrocyticinclusionsbodysyndrome)(11)。没有进一步表征EIBS相关的VLP包涵体，且没有证明它们是否表示一种或几种病毒物种。因此，没有验证PRV病毒血症的存在。

WO2011041790提供了鱼呼肠孤病毒诊断组合物，然而呈现了用于重新得到病毒的可替代来源且其中没有示出该组合物的接种疫苗效应的证据。

因此，已经证明了PRV增殖非常困难，且这对于针对病毒的疫苗发展以及对于生产病毒抗原是强大的限制。此外，还寻找了用于病毒传染性的测试系统，其之后将对诊断、消毒等测试具有较大价值。

因此，对于识别出一种增殖和得到PRV以及其他正呼肠孤病毒的能够克服或缓解本领域认识到的问题的方式，存在需要。本领域进一步需要识别重新得到能够生产例如灭活形式病毒的疫苗产品的更大量的正呼肠孤病毒，诸如PRV的方式，所述灭活形式的病毒可以用于治疗和/或预防疾病，诸如鲑科，诸如鲑鱼中的疾病。

发明内容

通过提供用于使用诸如有核鱼红细胞(nucleatedpiscineerythrocyte)的有核红细胞(即，具有细胞核的红细胞)增殖和分离正呼肠孤病毒的体外方法(离体方法，exvivomethod)，本公开已经克服或至少缓解了现有技术中的问题。该方法包括在有核红细胞中体外增殖正呼肠孤病毒以及此后分离增殖的正呼肠孤病毒。正呼肠孤病毒具体是感染鱼的正呼肠孤病毒。正呼肠孤病毒具体还是属于占据有核鱼红细胞的生态位(小生境，ecologicalniche)的复制谱系(replicatinglineage)的正呼肠孤病毒，即在有核鱼红细胞体内感染和复制的正呼肠孤病毒。有核鱼红细胞可以是例如来自鲑科，诸如鲑鱼、鳟鱼、虹鳟鱼、红点鲑鱼、淡水白鲑和河鳟，具体是鲑鱼的红细胞。示例性的正呼肠孤病毒是鱼呼肠孤病毒(PRV)。另一种示例性的呼肠孤病毒是黑鱼呼肠孤病毒(舌头鱼呼肠孤病毒，snakeheadreovirus)(SKRV或T9231)(25)。

用于增殖和分离正呼肠孤病毒的所述体外方法可以包括以下步骤：a)共培养基本不含正呼肠孤病毒的有核鱼红细胞(诸如鲑科红细胞，例如来自鲑鱼的红细胞)与被正呼肠孤病毒感染的有核鱼红细胞(诸如鲑科红细胞，例如，来自鲑鱼的红细胞)和/或包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质以得到混合培养物；b)温育步骤a)中得到的混合培养物，c)从步骤b)的所述混合培养物中除去被正呼肠孤病毒感染的红细胞，d)可选地重复步骤a)至c)的操作，和e)从步骤c)的红细胞中分离正呼肠孤病毒。如本文别处所提到的，正呼肠孤病毒可以是感染鱼的正呼肠孤病毒，诸如PRV。正呼肠孤病毒还可以是在有核红细胞，诸如有核鱼红细胞，诸如鲑科红细胞，诸如鲑鱼的红细胞中复制的任何正呼肠孤病毒。

在这种方法中，步骤b)的温育可以进行约4天以上，诸如约4-45天，例如约14天以上。进一步地，可以将步骤a)至d)的操作重复至少2次，诸如约2-10次，但不限于此。

本文所提到的鲑科可以是鲑鱼、鳟鱼、虹鳟鱼、红点鲑鱼、淡水白鲑和河鳟，具体是鲑鱼。

本文还公开了制备包含正呼肠孤病毒的疫苗组合物的体外方法，所述方法包括在诸如有核鱼红细胞的有核红细胞中体外增殖正呼肠孤病毒，以及此后分离增殖的正呼肠孤病毒，随后灭活分离的正呼肠孤病毒，以及此后制备包含所述灭活的正呼肠孤病毒的疫苗组合物。本文件还涉及通过本文所公开的用于增殖和分离正呼肠孤病毒的方法制备的疫苗组合物。

制备包含正呼肠孤病毒的疫苗组合物的这种体外方法可以包括以下步骤：a)共培养基本不含正呼肠孤病毒的有核红细胞(诸如有核鱼红细胞，诸如鲑科红细胞，诸如来自鲑鱼的红细胞)与被正呼肠孤病毒感染的有核红细胞(诸如有核鱼红细胞，诸如鲑科红细胞，诸如来自鲑鱼的红细胞)和/或包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质以得到混合培养物；b)温育步骤a)中得到的混合培养物，c)从步骤b)的所述混合培养物中除去被正呼肠孤病毒感染的红细胞，d)可选地重复步骤a)至c)的操作，和e)从步骤c)的红细胞中分离正呼肠孤病毒，随后灭活步骤e)中得到的正呼肠孤病毒，以及此后制备包含所述灭活的正呼肠孤病毒的组合物。如本文别处所提到的，正呼肠孤病毒可以是感染鱼的正呼肠孤病毒，诸如PRV。正呼肠孤病毒还可以是在有核红细胞，诸如有核鱼红细胞，诸如鲑科红细胞，诸如鲑鱼的红细胞中复制的正呼肠孤病毒。当正呼肠孤病毒是鱼呼肠孤病毒(PRV)时，疫苗组合物可以用于治疗和/或预防心脏和骨骼肌炎症(HSMI)。

本文进一步提供了用于诊断鲑科鱼中心脏和骨骼肌炎症(HSMI)或PRV病毒存在的体外方法，所述方法包括：

a)从生物血样(生物血液样品)中分离红细胞，b)检测由步骤a)得到的所述红细胞中鱼呼肠孤病毒(PRV)的存在。可以通过RT-qPCR进行这种检测。检测红细胞中鱼呼肠孤病毒的存在是心脏和骨骼肌炎症(HSMI)(或其可能发展)的指示。

本文件还公开了有核红细胞用于增殖正呼肠孤病毒的体外用途。所述正呼肠孤病毒可以是感染鱼的正呼肠孤病毒。所述正呼肠孤病毒还可以是在有核红细胞中复制的正呼肠孤病毒，诸如PRV。正呼肠孤病毒可以是鱼呼肠孤病毒(PRV)。有核红细胞可以是有核鱼红细胞，诸如鲑科红细胞，诸如鲑鱼红细胞或来自鳟鱼、红点鲑鱼、淡水白鲑或河鳟的红细胞。

附图说明

图1.在挑战实验1中通过RT-qPCR检测PRV。(A)与心脏和骨骼肌(SM)相比，血液中的平均Ct值和SD。(B)与脾脏和前肾(HK)相比，血液中的平均Ct值和SD。(c)与从相同鱼取样的每种组织(心脏、骨骼肌、脾脏、前肾)相比，在血液中检测的PRVCt值的配对分析。将结果给出为每个时间点的平均Ct值差值。使用配对T测试分析数据。^*＜0.05；^**＜0.01；＜0.001^***；0.0001^****。

图2.(A)由血液、RBC和脾脏中的平均Ct值和SD给出挑战实验2中通过RT-qPCR的PRV检测。在右侧单独示出了来自血浆的PCR结果，因为来自不含血浆的细胞的RNA输入不能直接与分析的其他样品物质比较。(B)与来自相同鱼的脾脏比较的在血液中检测的PRVCt值的配对分析，给出为每个时间点的平均Ct值差值。使用配对T测试分析数据。^*＜0.05；^**＜0.01；＜0.001^***。

图3.在7Wpc的心脏心室内的组织病理变化，包括心外膜炎(箭头(arrowhead))和致密层(compactumlayer)(箭状标记(arrow))的炎症，与HSMI诊断一致。

图4.通过流式细胞术对挑战2的分离RBC中的PRV蛋白的检测。(A)示出了用于细胞内染色的筛选策略(gatingstrategy)的密度曲线。FS，前向散射(forwardscatter)；SS，侧向散射(sidescatter)。(B)代表背景荧光的针对细胞内染色的0wpc的阴性对照。(C)来自在5、7和8wpc的细胞内染色的流式细胞术结果。针对每个样品计数50000个细胞。由于技术性困难，将单独的F75排除在外。(D)侧向散射(SS)和来自在0、5、7和8wpc的荧光强度(PRVσ1)的曲线图。在7和8wpc指示PRV阴性(^*)、低阳性(^**)和高阳性(^***)群。

图5.在红细胞中荧光标记PRVσ1蛋白。用碘化丙啶(propidiumiodide)染色细胞核。(A)通过免疫荧光(IF)显微术检测阳性RBC。标记的细胞在伸长的成熟RBC(箭状标记)至类似于不成熟红细胞(箭头)的更球形细胞的形态上变化。(B)阴性细胞(a)和在细胞质中包含少量较小包涵体(b)的不同染色模式、散射的颗粒染色(c)和大细胞质包涵体(d)的IF显微术。(C)示出细胞核周围区域的病毒包涵体(a，b，c)和更散射染色模式(d)的共聚焦显微图像。(D)通过阶段对比(phasecontrast)(a，d)，通过IF显微术(b，e)检测和通过图像叠加(c,f)共定位的细胞质包涵体。

图6.透射电子显微图像。A)具有病毒包涵体(箭状标记)的红细胞。B)包含呼肠孤病毒样颗粒的包涵体。C)具有完整的膜样结构的包涵体。D)具有部分完整的膜样结构或不存在膜样结构的包涵体(箭头)。E)具有病毒颗粒和层状结构的混合物的包涵体(箭头)。

图7.通过流式细胞术表面检测挑战2的分离RBC中的PRV蛋白。(A)示出表面染色的筛选策略的密度曲线图。FS，前向散射；SS，侧向散射。(B)代表背景荧光针对表面染色的0wpc的阴性对照。(C)来自5、7和8wpc的表面染色的流式细胞术结果。针对每个样品计数50000个细胞。由于技术性困难，将单独的F75排除在外。

图8示出引入来自被PRV感染的鱼的病毒感染的红细胞6天和13天后初始红细胞(erythrocytes)中病毒计数(RT-qPCR绝对定量)的平均增加。

图9通过体外感染PRV产生的由qPCR的病毒负荷。(A)在开始体外感染之前，筛选来自于体内感染的鱼i1和i2以及幼鱼(原初的鱼、未感染鱼，fish)n1的分离RBC的PRVσ1蛋白。在i1和i2中指出了PRV低阳性(+)和高阳性(++)群。针对每个样品计数50000个细胞。(B)在针对所有样品(n＝6)给出的体外感染实验期间，通过qPCR检测平均PRV计数(和SD)。(C)此外，计数平均PRV(和SD)并通过分离被i1溶解物(n＝3)和i2溶解物(n＝3)感染的原初RBC示出。使用威氏配对符号秩次检验(Wilcoxonmatchedpairssignedranktest)分析数据。^*p＜0.05。

图10.体外感染实验期间RBC的免疫荧光显微术。荧光标记实验期间体外感染的RBC中的红细胞中的PRVσ1蛋白。用碘化丙啶染色细胞核。在1dpi(A)或6dpi没有观察到阳性细胞。在12dpi(B)和19dpi(C)，作为在阶段对比中还可见的细胞质包涵体在几个单个细胞中观察到大量的PRVσ1蛋白。注意到圆形细胞和PRV阳性细胞的细胞核。

图11.针对体外PRV感染的抗病毒反应。针对抗病毒基因表达，在感染之前，以及在引入PRV之后1、6、12和19天，通过RT-qPCR，分析被来自两种不同PRV感染的鱼i1-i2的红细胞裂解物感染的三条幼鱼n1-n3的RBC。基于伸长因子(EF)1α参考基因的表达，归一化水平。将六个培养物中的每个相对于1dpi的平均倍数诱导示出为IFNα(A)，Mx(B)和RIG-I(C)。使用威氏配对符号秩次检验分析数据。^*p＜0.05。

图12.表征RBC和从体内PRV感染的RBC中分离的包涵体。用抗双链RNA(dsRNA)、抗-PRV-σ1染色从体内感染的鱼i1和i2分离的培养的RBC，并通过共聚焦显微术研究。用碘化丙啶染色细胞核。(A)和(B)示出在培养物中1天后发现的典型PRVσ1蛋白和dsRNA阳性细胞；(C)强染色的细胞12dpi，以及(D)和(E)培养物中19天后发现的典型细胞。图片示出了以63x放大的共聚焦显微术的组合信号，比例尺＝10μm。

图13.氯化频哪氰醇(pinacyanolchloride)染色PRV感染的RBC。氯化频哪氰醇染色被PRV体内感染的RBC，所述PRV是从受感染的鱼i2中分离的并保持在培养物中。观察到多种大小和数目的细胞质包涵体(A，B)。氯化频哪氰醇染色被PRV体外感染的RBC(C-E)。感染之前没有在RBC中观察到包涵体(C)。感染后12天，观察到细胞质包涵体(D)。感染后19天，检测到血影细胞(ghostcell)(E)。

具体实施方式

缩写

HSMI：心脏和骨骼肌炎症

IF：免疫荧光

PRV：鱼正呼肠孤病毒

RBC：血红细胞

RT-qPCR：逆转录定量聚合酶链式反应

MGBNFQ：小沟结合非荧光淬灭剂(MinorGrooveBindingNon-FluorescenceQuencher)

TAMRA：四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)

FAM：6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)

定义

本文涉及的体外意味着在生物体外发生的事件。体外可以指例如在自然条件改变最小的情况下在生物体外的人造环境中的组织中或组织上进行的实验或测量。在本文的上下文中，术语体外(exvivo)可以与术语体外(invitro)互换使用。

鲑科是分类在鲑目中的条辐鱼家族。这些也可以称为鲑科鱼(salmonid)。鲑科包括鲑鱼、鳟鱼、红点鲑鱼、淡水白鲑和河鳟。

本文涉及的细胞培养可以解释为细胞在控制条件下，通常在它们的自然环境外生长的过程。在实验部分举例说明了用于这种细胞培养的条件。

本文涉及的共培养是指在相同的细胞培养环境中紧密接近地(incloseproximity)培养不同细胞群。然而，本文所使用的共培养还指使细胞群与包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质紧密接近地培养。在本文公开的方法中，共培养因此包括混合基本不含正呼肠孤病毒的红细胞与包含用于增殖研究的正呼肠孤病毒的物质混合，诸如被正呼肠孤病毒感染的细胞或包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质，诸如包含正呼肠孤病毒的细胞上清液、分离的病毒等(因此本文得到的混合物称为混合培养物，参见步骤a))。此后，温育基本上不含正呼肠孤病毒的红细胞与包含用于本文公开的方法中的增殖研究的正呼肠孤病毒的物质(参见步骤b))。本文涉及的共培养因此包括以下两者：培养基本不含正呼肠孤病毒的红细胞与被正呼肠孤病毒感染的细胞和/或培养基本不含正呼肠孤病毒的红细胞与包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质(诸如包含病毒的细胞上清液、分离的病毒等)。

基本上不含正呼肠孤病毒的红细胞是指可以包含少量的正呼肠孤病毒的红细胞，该少量可以是通过本领域使用的方法不可检测的。它们也可以完全不含该病毒。

“有核红细胞”等是指具有允许病毒复制的细胞核的红细胞。除哺乳动物红细胞之外的脊椎动物红细胞通常包含细胞核，且因此适用于根据本文件的用途。例如，有核鱼红细胞，诸如来自鲑科的红细胞，诸如鲑鱼红细胞或来自鳟鱼、虹鳟鱼、红点鲑鱼、淡水白鲑和河鳟的红细胞，适用于根据本文件的不同方面的用途。

“包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质”可以是例如适用于得到来自血液、器官、细胞的正呼肠孤病毒的其他组织的物质和诸如鲑科鱼的鱼的分泌物。此外，由被正呼肠孤病毒感染的裂解细胞(诸如红细胞)得到的上清液可以用作正呼肠孤病毒源。可以通过溶胞作用获得这种上清液，诸如通过冷冻和解冻细胞或超声处理细胞，随后离心(诸如约700-900xg，诸如约800xg)生长介质和/或诸如缓冲液的其他溶液中的细胞裂解物，以除去细胞和/或细胞碎片来提供基本上不含细胞的包含正呼肠孤病毒的上清液。包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质还可以是这种正呼肠孤病毒，诸如分离的正呼肠孤病毒。

在本文中，鱼正呼肠孤病毒还可以称为鱼呼肠孤病毒或PRV，因此所述术语可以在本文中互换使用。

进一步在本文中，术语“增殖正呼肠孤病毒”等意在指病毒的复制，即它们的成倍增加，本文示出其发生在具有细胞核的红细胞中，生成病毒的多个拷贝，具体发生在鱼红细胞，诸如鲑科红细胞，诸如鲑鱼红细胞中。

本文所提到的疫苗或疫苗组合物意在指在给予疫苗的受试者中产生免疫预防的组合物。疫苗组合物诱导对特定抗原的免疫应答和因此的长效免疫性。在本文的上下文中，抗原主要意指灭活形式的正呼肠孤病毒或其部分或片段，其仍然能够在受试者中产生免疫应答。

“一致性”在本文的上下文中是指两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对的相同位置具有相同残基的程度，其以百分比表示。局部算法程序(localalgorithmprogram)可以用于确定序列一致性。局部算法程序(诸如SmithWaterman)比较一个序列中的子序列与第二序列中的子序列，并找到子序列的组合和这些子序列的排列，其产生最高的总体相似度得分。如果允许，罚分内部间隙。局部算法良好适用于比较共有单个结构域或仅结合位点的两种多域蛋白(多结构域蛋白，multidomainprotein)。

确定一致性和相似度的方法被编入可公开利用的程序。确定两个序列之间的一致性和相似度的优选的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux,Jetal(1994))BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.etal(1990))。BLASTX程序是由NCBI和其他来源(BLASTManual,Altschul,S.F.etal.(1990))可公开利用的。每个序列分析程序具有默认得分矩阵和默认间隙罚分。通常，分子生物学家将期望使用通过使用的软件程序建立的默认设置。例如，与涉及序列具有例如80％“一致性”的核酸序列在本文的上下文中是指涉及序列中核酸碱基的总共20％被取代、删除和/或增加的序列。

正呼肠孤病毒是呼肠孤病毒科的成员。正呼肠孤病毒具有双链RNA基因组，因此属于第III类病毒(groupIIIviruses)，其感染脊椎动物。与正呼肠孤病毒最相关的是水生呼肠孤病毒属(12，13)。

本文中，首次示出了血细胞和血红细胞(红细胞，erythrocyte)群是体内鱼呼肠孤病毒(PRV)的主要来源，并示出血红细胞(红细胞，erythrocyte)是用于在鱼之间传递病毒的有效物质。此外，流式细胞术示出，免疫荧光染色和电子显微术证明PRV感染高达50％的血红细胞(RBC)群并形成表示复制的工厂样结构(factory-likestructures)。使用电子显微术，本文示出这些包涵体包含呼肠孤病毒样颗粒。因此，总结PRV在感染心肌细胞之前在大西洋鲑红细胞中复制。这些发现提供了关于HSMI发病机理的新信息，并且示出PRV是病毒红细胞包涵体的重要因素。因为之前不知道PRV病毒在哪里复制，所以这是出人意料的发现。此外，其第一次证实了呼肠孤病毒在有核红细胞中复制。

PalaciosG.等人(3)和MarkussenT.等人(4)已经进一步表征了鱼呼肠孤病毒(PRV)。

本文所示的发现使构建用于由本文所示的体外有核红细胞增殖和分离诸如PRV的正呼肠孤病毒的体外方法成为可能，因为出人意料地发现正呼肠孤病毒鱼呼肠孤病毒(PRV)能够在这种环境下复制，生成用于进一步分离、表征和使用的大量病毒。本领域中一直没有使用从鲑科的生物样品，即从包含以本文所公开的方式在培养基中体外生长的红细胞的血样分离的红细胞，从而允许生产大量病毒的技术。这是因为没有预期这种体外模式是合适的。通常发现鱼病毒和哺乳动物病毒通过表面结合与红细胞相关，但是没有证实感染鲑科的病毒在红细胞中复制。此外，没能预期红细胞中增殖体外产生大量病毒。

因此，出人意料地示出本方法以提供得到大量正呼肠孤病毒，诸如鱼呼肠孤病毒的方式，然后所述呼肠孤病毒在灭活后可以进一步用于适用于接种鲑科抵抗HSMI(心脏和骨骼肌炎症)的疫苗产品。

因此，出人意料地示出红细胞是用于PRV复制的主要靶细胞。进一步地，例如，就系统的敏感性而言，可以使用这些发现来生成用于产生大量鱼呼肠孤病毒的体外模型是不明显的。此外，例如在哺乳动物RBC缺少细胞核且没有提供用于病毒复制的任何方式的意义上，没有使用体外红细胞进行这种措施的动机。

基于红细胞和白细胞样细胞以及共有氨基酸基序与MRV血凝细胞粘附蛋白中的PRV的早期检测，提出在PRV感染中存在细胞相关的病毒血症(其对于发病机理是重要的)的假设。在两个之后的PRV挑战实验中，评估了在感染的不同阶段血液、血浆和红细胞中的病毒负荷(virusload)。通过流式细胞术、免疫荧光、共聚焦显微术和电子显微术证实，发现在一些个体鱼中的大于50％的红细胞群中细胞内存在高负荷的PRV。因此，出人意料地示出红细胞是PRV复制的主要靶细胞，因为之前示出PRV存在于几种组织中但仍以少量存在，所以这是没有预期到的。进一步地，可以使用这些发现来生成用于产生大量正呼肠孤病毒的体外模型是不明显的。此外，例如在哺乳动物血液缺少细胞核且没有提供用于复制的任何方式的意义上，没有使用体外红细胞进行这种措施(measure)的动机。

之前由细胞系增殖PRV的尝试没有成功。

这种新认识的病毒增殖系统对表征正呼肠孤病毒、病毒感染机制和发展调节病毒扩散的方法为目的的研究也极为重要。培养病毒的系统还将允许发展重组病毒并提供正呼肠孤病毒，诸如可能在全世界出现的PRV变体的毒性上的潜在差别的表征。用于增殖和/或检测正呼肠孤病毒的本方法对增殖和/或检测其他鱼正呼肠孤病毒或鱼呼肠孤病毒可能具有重大影响。

因此，通过本文所公开的方法，可以产生灭活的病毒疫苗，即，包含灭活的诸如鱼呼肠孤病毒的正呼肠孤病毒的疫苗组合物，所述疫苗组合物可以用于接种鱼，诸如鲑科，诸如鲑鱼，来抵抗正呼肠孤病毒，诸如鱼呼肠孤病毒相关的疾病。这种疾病是例如心脏和骨骼肌炎症(HSMI)。

基于本文给出的出人意料的发现，本文件公开了用于增殖和分离正呼肠孤病毒的体外方法，所述方法包括在诸如有核鱼红细胞的有核红细胞中体外增殖正呼肠孤病毒，随后分离正呼肠孤病毒。

根据本文件的不同方面的正呼肠孤病毒是可以在有核红细胞中复制的任何正呼肠孤病毒(即使正呼肠孤病毒还能够在除有核红细胞之外的其他细胞类型中复制)。在有核红细胞中复制可以是或可以不是这种正呼肠孤病毒的体内自然感染周期的步骤。根据本文可以增殖的正呼肠孤病毒的实例包括感染鱼，诸如鲑科的鱼，诸如鲑鱼、鳟鱼、红点鲑鱼、淡水白鲑和河鳟的正呼肠孤病毒。正呼肠孤病毒的实例包括鱼呼肠孤病毒(PRV)。另一种示例性的正呼肠孤病毒是黑鱼呼肠孤病毒(SKRV或T9231)(25)。

可以用于本文件的不同方面的红细胞是任何有核红细胞，即，具有允许病毒复制的细胞核的任何红细胞。如本文别处解释的，除了哺乳动物红细胞之外，脊椎动物红细胞通常包含细胞核，因此适用于根据本文件的用途。例如，有核鱼红细胞，诸如来自鲑科的红细胞，诸如鲑鱼红细胞或来自鳟鱼、红点鲑鱼、淡水白鲑和河鳟的红细胞适用于根据本文件的不同方面的用途。然而，细尾螈(Batrachoseps)属的蝾螈、暗光鱼(Maurolicus)属的鱼和紧密相关物种以及哺乳动物的红细胞缺少细胞核，而因此不能用于本文件的不同方面。

用于增殖和分离根据本文件的正呼肠孤病毒的方法可以包括以下步骤：

a)共培养基本不含正呼肠孤病毒的诸如有核鱼红细胞的有核红细胞与被正呼肠孤病毒感染的诸如有核鱼红细胞的有核红细胞和/或包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质，以得到混合培养物；

b)温育步骤a)得到的混合培养物，

c)从步骤b)的混合培养物除去被正呼肠孤病毒感染的红细胞，

d)可选地重复步骤a)至c)的操作，和

e)从步骤c)的红细胞中分离正呼肠孤病毒。

具体地，提供了用于增殖和分离鱼呼肠孤病毒(PRV)的体外方法，其中，所述方法包括以下步骤：a)共培养基本不含鱼呼肠孤病毒的鲑科红细胞与被鱼呼肠孤病毒感染的鲑科红细胞和/或包含鱼呼肠孤病毒源的任何其他物质，以得到混合培养物；b)温育步骤a)中得到的混合培养物，c)从步骤b)的所述混合培养物中除去被鱼呼肠孤病毒感染的红细胞，d)可选地重复步骤a)至c)的操作，和e)从步骤c)的红细胞中分离鱼呼肠孤病毒。

可以通过诸如实验部分描述的标准操作从鲑科血样中分离红细胞。

例如，可以通过RT-qPCR(脾脏)由确定未被例如PRV的正呼肠孤病毒感染的合适源(诸如成年大西洋鲑(诸如大约2kg))分离有核红细胞进行操作。此后可以洗涤、计数红细胞并将其溶解在合适的介质，诸如补充有胎牛血清(10％)和合适的诸如庆大霉素(例如，ca50μg/ml)的抗生素的LeibovitzL15介质中至约5mill/ml。此后可以将细胞以约5mill细胞/孔涂覆在24孔板中，并在无CO₂恒温箱中在约12-15℃下保持缓慢搅拌，例如200rpm搅拌。然后添加(约0.1mill细胞/孔)被诸如PRV(参见挑战实验#2，共居者，6WPC)的正呼肠孤病毒感染的新鲜分离的红细胞(例如，来自三条单独的鱼)，此后根据本文别处所描述的将细胞温育一段合适的时间，例如最多约13天(在约12-15℃下)。每个时间点在无菌Eppendorff管中可以收获约250μl细胞，此后离心(例如，750xg，5min)。此后丢弃介质，且可以从红细胞颗粒中分离RNA。上述是操作的一个实例，但本公开并不旨在限于此。

如所提到的，可以重复上述方法，使得在将体外培养方法进行适当量的时间(诸如本文举例说明的)之后，得到合适量的正呼肠孤病毒，诸如鱼呼肠孤病毒。

本文所公开的方法中的步骤b)的温育可以进行约14天，但不限于此。例如可以进行约4天以上，诸如约4-45天，诸如约4-30天，诸如5-30天，诸如14-30天，诸如约5、6、7、8、10、11、12、13或14天。可以在约5-30℃下，诸如5-20℃、10-18℃、12-18℃或12-15℃下，诸如约10、11、12、13、14或15℃下进行温育。可以使用适用于维持红细胞的任何介质，诸如补充有胎牛血清(诸如约2-10％，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10％)的LeibovitzL15介质。也可以将诸如庆大霉素的合适抗生素(例如，ca50g/ml)添加至介质中。此外，可以重复步骤a)至d)的操作至少2次，诸如约2-10次。如所提到的，可以重复操作以生成对所述病毒的进一步用途充足的量的正呼肠孤病毒。应当注意的是可以通过例如使用RT-qPCT测量细胞培养物中的病毒含量来监控操作，从而判定是否继续进行培养或目前是否可以由其得到足够的病毒。

在步骤c)中，从温育介质中除去被正呼肠孤病毒感染的红细胞。这可以通过例如离心(诸如梯度离心)或过滤红细胞进行，以从温育介质中分离它们。

例如可以从步骤c)中除去的红细胞中分离RNA来进行步骤e)的分离。对于这种RNA分离，可以使用用于RNA分离的任何标准技术，诸如Quiagen的

用于与基本不含正呼肠孤病毒的红细胞共培养的正呼肠孤病毒源可以是用正呼肠孤病毒感染的细胞制备的接种物的形式。可以通过溶解被正呼肠孤病毒感染的细胞，以及收集不含包含正呼肠孤病毒的它们的无细胞上清液制备接种物。可以通过将正呼肠孤病毒感染的血液收集在肝素化管中，例如在约2000g下在诸如约4℃的低温下离心约10min，以及除去血浆制备包含正呼肠孤病毒的接种物的这种制备物。然后在溶解细胞之前，可以在诸如PBS的合适的缓冲液中稀释血液诸如约5-20倍，例如约10倍。可以通过适用于溶解细胞的任何方法溶解细胞。可以通过例如冷冻/解冻循环，即通过交替冷冻和解冻样品诸如三次，实现细胞溶解。用于冷冻的温度可以在例如-10至-85℃之间，诸如约-80℃。完成冷冻/解冻循环之后，可以在4℃下以诸如约2000g离心样品5min，得到上清液。上清液随后被收集并可用作接种物。也可以通过超声处理被正呼肠孤病毒感染的细胞制备包含正呼肠孤病毒的接种物。优选地在冰上进行这种超声处理。超声处理可以包括例如超声处理与中间休息交替诸如10s的重复脉冲。脉冲数可以是例如10。脉冲之间的休息时间可以是例如约30s。完成超声处理之后，可以在4℃下以诸如约2000g离心样品5min，得到上清液。此后收集上清液并将其用作接种物。使用的接种物的量理当取决于用于期望的感染的病毒的量，但是可以使用根据以上的冷冻/解冻或超声处理方法制备的例如10-500μl量的接种物，诸如约100μl。

在本上下文中，所述鲑科可以是鲑鱼或虹鳟鱼或鳟鱼、红点鲑鱼、淡水白鲑和河鳟。

本文件还涉及制备疫苗组合物的体外方法，所述方法包括在有核红细胞中体外增殖正呼肠孤病毒，随后分离正呼肠孤病毒，以及此后制备包含所述灭活的正呼肠孤病毒的疫苗组合物。这种方法中正呼肠孤病毒和有核红细胞的实例如本文别处所公开的。

制备疫苗组合物的这种体外方法可以包括以下步骤：

a)共培养基本不含正呼肠孤病毒的诸如有核鱼红细胞的有核红细胞与被正呼肠孤病毒感染的诸如有核鱼红细胞的有核红细胞和/或包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质，以得到混合培养物；

b)温育步骤a)中得到的混合培养物，

c)从步骤b)中的所述混合培养物除去被正呼肠孤病毒感染的红细胞，

d)可选地重复步骤a)至c)的操作，和

e)从步骤c)的红细胞中分离正呼肠孤病毒，

f)灭活步骤e)中得到的正呼肠孤病毒以及此后制备包含所述灭活的正呼肠孤病毒的组合物。

灭活和制备所述组合物的步骤可以在体内和/或其他条件下进行。

制备PRV疫苗组合物的这种体外方法可以包括例如以下步骤：a)共培养基本不含鱼呼肠孤病毒的鲑科红细胞与被鱼呼肠孤病毒感染的鲑科红细胞和/或包含鱼呼肠孤病毒源的任何其他物质，以得到混合培养物；b)温育步骤a)中得到的混合培养物，c)从步骤b)的所述混合培养物中除去被鱼呼肠孤病毒感染的红细胞，d)可选地重复步骤a)至c)的操作，和e)从步骤c)的红细胞中分离鱼呼肠孤病毒，随后灭活步骤e)中得到的鱼呼肠孤病毒以及此后制备包含所述灭活的鱼呼肠孤病毒的组合物。

可以以本领域已知的任何合适的方式进行正呼肠孤病毒的灭活，诸如通过使用溶剂或去垢剂(detergent)灭活、热灭活或通过将病毒暴露于酸性pH灭活。根据本文别处所公开的进行用于制备疫苗组合物的这种方法中的步骤a)-e)。

因此，可以根据本领域已知的手段制备包含灭活形式的诸如鱼呼肠孤病毒的正呼肠孤病毒的疫苗组合物，且可以将合适的赋形剂添加至所述组合物中。

本文还提供了以下方法，其中，包含通过本文所公开的体外方法得到的灭活的鱼呼肠孤病毒的所述疫苗组合物用于治疗和/或预防心脏和骨骼肌炎症(HSMI)。另外，疫苗组合物可以包含一种或多种其他正呼肠孤病毒或其他抗原试剂(antigenicagent)。还提供了通过本文所公开的体外方法得到的灭活的鱼呼肠孤病毒的疫苗组合物在制造用于治疗和/或预防心脏和骨骼肌炎症的药物中的用途。

本文还提供了用于诊断鲑科鱼中的心脏和骨骼肌炎症(HSMI)或存在的PRV病毒的体外方法，所述方法包括：a)从所述鲑科鱼的生物血样中分离鲑科红细胞，b)检测步骤a)得到的所述鲑科红细胞中存在的鱼呼肠孤病毒(PRV)。在这种方法中，可以根据本文所公开的或别处举例说明的分离鲑科红细胞。例如可以通过RT-qPCR进行这种检测。表2中所公开的引物和/或探针可以用于这种检测。

在本文提供的体外方法中，鲑科可以是鲑鱼。检测红细胞中存在的鱼呼肠孤病毒是鲑科鱼中心脏和骨骼肌炎症(HSMI)的指示或其可能发展的指示。

本文还涉及有核红细胞用于增殖正呼肠孤病毒的用途。用于这种用途的合适的有核红细胞和正呼肠孤病毒如本文别处所公开的。用途的实例是被鱼呼肠孤病毒感染的鲑科红细胞对增殖鱼呼肠孤病毒的用途。

本公开通过实验部分进一步示出，但不旨在限于此。

实验部分

实施例1

材料和方法

实验鱼和饲养条件

进行两个随后的PRV挑战实验(VESOVikan,Norway)。使用未接种的适应海水的大西洋鲑进行两个试验。将鱼保持在供应有25‰盐度的过滤海水、12℃±1℃和12:12h光/暗方案的罐中。在挑战之前，使鱼适应新环境2周，在处理和通过打击头部杀死之前，根据标准操作喂养并通过浸浴(2-5min)在Metacain(用1gNaHCO₃缓冲的1g/10l水)(NorskMedisinaldepot；Oslo,Norway)中将其麻醉。

挑战实验#1。在第一个实验中，使用初始平均重量为50g的50条倒注者(脱皮者、脱鳞者，shedders)和50条共居者。接种物由来自HSMI现场发作的鱼的组织匀浆(心脏、脾脏和前肾)组成且包含通过RT-qPCR确定的高负荷的PRV。确认接种物不含其它通常已知的鲑鱼病原体。麻醉倒注者，通过腹膜内(i.p.)注射给予0.1mL接种物，其由缩短外左侧上颔骨标志，并将其放入包含50条首次用于实验的鱼(共居者)的罐中。每第二周(每隔一周)取样共居组中的六条鱼，开始于6周挑战后(wpc)终止于14wpc。此外，在4wpc取样3条鱼用于测试PRV的传播。在开始实验之前，收集来自6条鱼的对照样品。在每次取样时，将来自尾静脉(臀脉，caudalvein)的周围血液收集在肝素化真空采血管(vacutainer)中，并将来自心脏、骨骼肌、脾脏和前肾的组织取样在RNAlater(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中并用于RT-qPCR分析。将来自相同器官的平行样品收获在10％磷酸盐缓冲液福尔马林中，将其包埋在石蜡中并用于组织分析。

在9wpc，取样来自共居组的15条鱼的血液，合并并离心。在除去血浆之后，将血液颗粒(bloodpellet)以1:4稀释在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中并在-80℃下储存。将合并的样品用作挑战实验#2中的接种物。

挑战实验#2。在第二挑战实验中，使用初始平均重量为80g的60条倒注者和60条共居者。解冻实验#1中制备的血液颗粒，1:3稀释在PBS中并用作挑战物质(MarieL：用于PRV的Ct-verdi)。根据挑战#1进行倒注者的接种和标记。从2wpc直到8wpc每周取样共居组的六条鱼。在开始实验之前，取样来自六条鱼的对照样品。如挑战#1所描述的取样血液、心脏和脾脏组织。以1000xg离心5min之后，从肝素化血液以及收集的血浆部分中提取用于RT-qPCR的样品。剩余的血样用于分离血红细胞(RBC)，随后通过RT-qPCR、流式细胞术、共聚焦显微术和透射电子显微术(TEM)分析。

RNA分离。通过使用5mm钢珠和TissueLyserII(Qiagen)在QIAzol(Lysis试剂(Qiagen,Hilden,Germany))中均质化从储存在RNAlater中的组织分离总RNA。添加氯仿并离心之后，收集水相并在根据制造商所描述的用RNeasy迷你离心柱继续之前将其与一体积的70％乙醇混合。使用10μl血液和1x10⁷RBC输入量，将相同方法分别用于分离肝素化血样和分离的RBC的总RNA。对于血浆样品，使用TrizolLS(InvitrogenLifeTechnologies)和RNeasy迷你试剂盒的组合。简单来说，在添加氯仿之前混合50μl血浆并用TrizolLS温育，通过离心分离相，以及随后根据制造商推荐的使用RNeasy迷你试剂盒。在50μl不含RNase的水中洗脱从50μl血浆分离的RNA。使用NanoDropND-1000分光光度计(NanoDropTechnologies)定量RNA。

RT-qPCR。将QiagenOneStep试剂盒(Qiagen)用于RT-qPCR。在95℃下变性来自组织样品的总的5μlRNA(20ng/μl)或来自血浆样品的总的5μlRNA(相当于5μl血浆)5分钟。使用以下条件进行RT-qPCR：400nM引物，300nM探针，400nMdNTP，1.26mMMgCl₂，1:100RNaseOut(Invitrogen)和1XROX参考染料，采用以下循环参数：在Mx3005P(Stratagene)中，50℃下30min，94℃下15min，94℃/15s、54℃/30s和72℃/15s40个循环。一式两份运行样品，并且如果两个平行具有Ct<35，将样品定义为阳性。用于靶向PRV基因片段S1的引物和探针的序列是：S1FwdTGCGTCCTGCGTATGGCACC(SEQIDNO:1)；S1RevGGCTGGCATGCCCGAATAGCA(SEQIDNO:2)；S1探针(FAM)-ATCACAACGCCTACCT-MGBNFQ(即，FAM-SEQIDNO:3-MGBNFQ)。

组织病理学。用苏木精-曙红(HE)染色固定在甲醛中并包埋在石蜡中的收集自挑战#1和2的心脏材料切片，并通过光学显微镜评估组织病理变化。

分离血红细胞(RBC)。通过使用之前描述的Percoll梯度以最小改变从挑战#2中收集的肝素化血液中分离RBC(14)。简而言之，1:10将血液稀释在蒸馏的PBS(dPBS)中并使用1.07g/mL(49％)和1.05g/mL(34％)制备间断的(不连续的)Percoll梯度。将稀释的血液分层在梯度上并在4℃下以2000xg离心20min。从梯度底部收集RBC；然而，变化量的红细胞存在于34％-49％界面中。为了收集剩余的红细胞，将界面重新分层(relayer)至新鲜的34％-49％梯度并在4℃下以500xg离心10min。收集梯度底部的RBC，与第一梯度的红细胞合并，并在PBS中洗涤两次。使用Countess(Invitrogen)计数细胞并将其重新悬浮于PBS中至5x10⁶个细胞/mL的最终浓度。DiffQuick染色的血涂片确认可以将分离的细胞识别为红细胞。

流式细胞术。为了检测PRV阳性细胞，使用针对推断的PRV外壳蛋白σ1(抗σ1，#K275)(18)的多克隆抗体染色来自0、4、5、6、7和8wpc的分离RBC，运行平行样品用于表面和细胞内标记。简要地，将0.5x106个细胞/孔涂覆在96孔板上并用染色缓冲液(PBS+1％BSA+0.05％叠氮化物)洗涤。用一抗抗-σ1#K275(1:10000)表面染色细胞30min，并使用所有洗涤液和稀释液中的染色缓冲液用FITC结合的二抗抗-兔IgG(分子探针)(2mg/ml，1:800稀释)表面染色细胞30min。在细胞内染色细胞之前，通过在冰上在Cytofix/Cytoperm(BectonDickinson)中温育15min，以及以上所描述的相同的一次和二次温育，但是使用稀释液中的Perm/洗涤(BD)和洗涤步骤固定和渗透细胞。所有温育在冰上进行，并将对应的零血清(抗σ1Zero#K275)用作阴性对照血清。在Gallios流式细胞仪(BeckmanCoulter)上读取细胞，计数为50000细胞/样品，并使用Kaluza软件(BD)分析数据。由于背景染色的微小变化，单独筛选(gated)流程图来区别阴性峰和阳性峰。

免疫荧光显微术和共聚焦显微术。制备细胞内染色的RBC的选定样品用于免疫荧光和共聚焦显微术。用碘化丙啶染色细胞核并使用Fluoroshield(Sigma-Aldrich)将细胞安放至载玻片和盖玻片。通过激光扫描共焦显微镜(ZeissAxiovert200M荧光倒置显微镜，安装有LSM510激光共聚焦单元和488nm氩激光器、546nm和633nm氦/氖激光器Z)中的Plan-Apochromat63/1.4油物镜捕获不饱和图像。此外，用以上所描述的碘化丙啶染色选定样品并将细胞悬浮液转移至Countess隔室玻片(腔室玻片，chamberslide)(Invitrogen)。使用倒置荧光显微镜(Olympus1X81)以20x和40x放大倍数拍摄图片。

透射电子显微术(TEM)。在4℃下将来自受感染鱼的分离RBC固定在PBS与1.25％戊二醛和2％多聚甲醛中过夜，在PBS中洗涤两次以及二甲胂酸盐缓冲液(cacodylatebuffer)(0.1M，pH6.8)中洗涤三次。在4℃下用1％OsO₄后固定细胞1h并用二甲胂酸盐缓冲液洗涤多次。然后通过乙醇系列(70、90、96和100％)将细胞脱水，并将其嵌入在LR-白树脂中。在超薄切片机(LEICAEMUC6)上切割薄片。用4％乙酸双氧铀水溶液(aqueousuranylacetate)和1％KMNO₄染色切片10min，然后在新鲜蒸馏水中深入洗涤。在FEIMORGAGNI268中检查切片，并使用VELETA照相机记录照片。

统计分析。用GraphPadPrism6.0(GraphPadSoftwareinc.,USA)进行所有统计分析。

结果

感染期间血液中的高PRV负荷。由挑战#1得到的RT-qPCR结果显示肝素化的全血样品中的高病毒负荷。首先在6wpc的血液中检测鱼呼肠孤病毒，且病毒量峰值在8wpc，平均Ct值为18.6(±0.7)。直到研究结束，高病毒负荷一直存在于血液中(图1A)。使用未配对的t测试将血液的平均Ct值与心脏和骨骼肌比较，心脏和骨骼肌是HSMI(3)期间组织病理学变化的主要器官。在心脏中(p<0.05)早期(6和8wpc)和晚期(14wpc)阶段以及在骨骼肌(p<0.05)的所有时间点发现显著较少量的病毒(图1A)。当比较血液与脾脏和前肾(已知感染期间包含最多病毒的器官(19))时，水平大致是相同的(图1B)。然而，在后期阶段(14wpc)，脾脏中存在显著较高的病毒负荷(p<0.01)。与HSMI诊断一致的心脏和骨骼肌中的组织病理变化首先在10wpc中，六条鱼中的三条在10wpc下观察到。

为了进一步评估血液和组织PRV水平之间的统计学差异，使用配对的t-测试分析每个时间点每条个体鱼中的相对Ct值。结果示出所有时间点处心脏和骨骼肌样品两者中病毒的相对量显著低于相同个体中的血液中的相对量(p<0.05)(图1C)。感染期间与血液相比，脾脏和前肾中的相对PRV负荷增加。在6wpc，与血液相比，脾脏和前肾中存在显著较低的PRV负荷(p<0,01)，而在后期阶段(10-14wpc)，脾脏中的病毒负荷显著较高(p<0.05)，并且对于前肾看到相同趋势(仅在10wpc显著较高，p<0.05)。来自挑战#1的所有Ct值列于补充数据表S1中。

血细胞颗粒(血细胞团、血细胞沉淀，bloodcellpellet)是高度有效的挑战物质。将来自挑战#1制得的血细胞颗粒用作挑战#2的接种物，并且再次检测到血液中的高病毒负荷(图2A)。首先在4wpc在六条鱼的三条中检测PRV；即，挑战#1之前两周，以及在5wpc，通过RT-qPCR的所有样品鱼是PRV阳性的。与挑战#1相比，血液中的最大病毒负荷早出现两周，并在6wpc平稳(plateaued)，其中，平均Ct值为16.5(±0.7)；其显著高于挑战1中相同时间点的病毒负荷(未配对t-测试，p<0.001)。

将血液中的病毒量与脾脏比较，且在挑战#1中观察到，在感染的早期阶段(5-7wpc)血液中的PRV负荷显著高于脾脏的PRV负荷(p值<0.01)(图2B)。与HSMI诊断一致的心脏和骨骼肌中的组织病理变化首先在7wpc的六条鱼中的四条中(图3)和在8wpc的所有样品鱼中观察到。

RBC中的高PRV负荷。通过RT-qPCR在4wpc首先在挑战#2的RBC中检测到PRV，并且其在约6至7wpc(分别是18.5±2.9和17.5±2.9)平稳，因此遵循与血液中观察到的相同模式(图2A)。这些结果指示RBC是PRV感染期间的重要病毒储存库。血浆也包含了显著量的病毒，部分解释了与RBC相比全血中病毒的稍高水平。来自挑战#2的所有Ct值列于补充数据表S2中。

通过流式细胞术检测大群体的PRV阳性RBC。使用针对推断的PRV衣壳蛋白σ1的多克隆抗体染色挑战#2的分离RBC，并进行表面和细胞内染色两者。根据它们的大小和粒度筛选细胞以仅包括完整细胞(图4A)。将0wpc的样品用作阴性对照，指示在PRV阴性样品中检测的背景荧光信号(图4B)。通过细胞内和表面染色两者的荧光信号中的峰看出，在六条个体中的两条(F55，F56)中在5wpc首先观察到PRV阳性红细胞群。细胞内检测大部分的病毒蛋白并可以观察到大的、明显的PRV阳性RBC群(达到F56中43％阳性细胞)(图4C)。如RBC的RT-qPCR所示，阳性个体还包含与组其余(个体)相比明显更高的病毒负荷(表1)。在相同个体的较低数量的RBC表面上也检测到PRV。在补充图S1中示出了来自挑战#1的表面染色。

在7wpc，在五条个体鱼的四条中观察到PRV阳性红细胞并且大群体的RBC(25％直至51％)是阳性的(图4C)。大部分的病毒存在于细胞内。与5wpc样品相反，在7wpc的阳性细胞可以划分为两个单独的群体，示出对PRVσ1的低阳性和高阳性染色。低阳性群体在强度上与在5wpc下检测的单个PRV群相当，指示包含高PRV水平的细胞随时间的发展(图4C)。在8wpc，通过在所有六条个体中细胞内染色检测到大群体的PRV阳性RBC，与在7wpc观察到的结果类似。

来自流式细胞术分析的结果与RT-qPCR结果相关，因为在5、7和8wpc的流式分析中，Ct值低于20的个体鱼一致检测为阳性(图4C，表1)。通过在7wpc的F74举例说明，Ct值高于20的样品看起来低于流式细胞术分析的灵敏阈值(图4C)。在4wpc，所有RBC样品具有仅在流式细胞术中产生背景信号的高于20的Ct值，而在8wpc所有样品具有低于20的Ct值且通过流式细胞术是阳性的(图4C)。

在整个研究中，存在具有高荧光强度的PRV阳性细胞具有在流式细胞术中增加的侧向散射的趋势(图4D)。在每条鱼中单独筛选阴性群和高PRV阳性群，并使用威氏检验比较它们的平均侧向散射。在7wpc和8wpc的高PRV阳性群与阴性群相比(p<0.05)具有显著较高的侧向散射，指示高度PRV阳性的红细胞更呈粒状(moregranular)。

在RBC中检测病毒细胞质包涵体(cytoplasmicinclusions)。为了研究PRV的亚细胞定位，制备针对PRVσ1细胞内染色的选定RBC样品，用于免疫荧光和共聚焦显微术。通过细胞质中颗粒染色(granularstaining)识别免疫荧光显微术中的PRV阳性红细胞(图5A)。作为从几个大的包涵体至多个较小的包涵体在大小和数目上改变的包涵体，或整个细胞质中更加扩散的粒状染色，观察到阳性染色(图5B)。阳性红细胞的形态从具有椭圆形状和长细胞核的一般成熟红细胞改变至类似于不成熟的红细胞(多染细胞(polychromatocyte))的更圆的细胞。通过共聚焦显微术确认PRV阳性染色来源于细胞质，且主要在细胞核周围区域检测到病毒包涵体，但是还发现病毒包涵体在细胞质中散射(图5C)。通过相差显微术(phasecontrastmicroscopy)还观察到在一些RBC中的细胞质包涵体，并且这些包涵体与PRV的免疫荧光染色共定位(图5D)。

在TEM中观察到呼肠孤病毒样颗粒。来自受感染鱼的RBC的TEM分析显示包涵体包含细胞质中的呼肠孤病毒样颗粒(图6A)。该病毒颗粒具有由72nm的较低电子密集的外壳围绕的直径为30nm的电子密集内核。病毒颗粒缺少外膜(envelope)，并具有六边形轮廓(图6B)。这些特征与呼肠孤病毒科的成员一致。

包涵体的大小从100nm至1000nm变化。许多包涵体包裹在包含许多病毒颗粒的膜样结构中，而在其他中，膜部分破裂或与因更散射的病毒颗粒不存在(图6C，6D)。一些包涵体包含具有或不具有存在的病毒颗粒的层状结构(图6E)。这些区别可以代表病毒复制循环的不同阶段。

讨论

在这个研究中，发现RBC是PRV的主要靶细胞。分别通过RT-qPCR、流式细胞术和EM发现，RBC中的高病毒滴度(titer)以及包含呼肠孤病毒样颗粒的病毒工厂都是PRV在大西洋鲑红细胞中复制的结论的观察结果支持。

在挑战#1中，我们发现在整个研究期间，血液包含显著高于心脏和骨骼肌的病毒负荷。在早期阶段，与分析的所有器官，包括脾脏和前肾相比，血液中存在显著更多的病毒。来自挑战#2的RT-qPCR结果显示血液中大部分的病毒存在于红细胞部分。这由流式细胞术的结果证实，其中，在个体鱼中观察到超过50％PRV阳性RBC，并且其中，检测到大部分的病毒在细胞内。在VESOVikan,Namsos,Norway中进行挑战。

使用免疫荧光和共聚焦显微术检测到PRV浓缩为局部化至受感染RBC的细胞质的大的球状结构。流式细胞术分析示出与受感染个体中的PRV阴性群相比，高度PRV阳性的RBC具有显著较高的平均侧向散射，因此更呈粒状。正呼肠孤病毒感染的细胞与称为病毒工厂的细胞质中的致密相包涵体(phasedenseinclusions)相关。病毒工厂包含大量的病毒蛋白、dsRNA(31)和部分或全部组装的颗粒，并认为其是其中病毒RNA复制和包装以及子代颗粒组装发生的位置。在该研究中观察到的包涵体极其相似于针对正呼肠孤病毒描述的那些，更具体是相似于在MRV类型3原型菌株Dearing(T3D)、受感染细胞中看到的球形病毒工厂，与类型1原型菌株Lang(T1L)的微管相关的丝状工厂(factory)相反(15)。MRV形成病毒工厂的能力有助于病毒的成功复制。

通过TEM发现该研究中观察到的病毒包涵体包含大量的呼肠孤病毒样颗粒。病毒粒子缺少外膜，具有30nm的密集(致密)核和六边形轮廓的72nm的外壳。这些特征与呼肠孤病毒科的成员一致(16)。包涵体的大小在100nm至1000nm改变并往往位于细胞核周围区域。由于一些填充有呼肠孤病毒样颗粒，但是其他包含病毒颗粒和具有层状结构的更均匀物质的混合物，包涵体的含量不同。这些梯状结构的性质不能确定。已经示出MRV包涵体包含微管和中间丝状体(中间丝，intermediatefilament)两者。还描述了中间丝波形蛋白(vimentin)重新布置在呼肠孤病毒感染的CV-1细胞中，两者都围绕并合并至病毒包涵体中。检测到的大部分包涵体被膜样结构封装，在其他中膜似乎破裂或不存在。哺乳动物正呼肠孤病毒包涵体与膜或其他细胞器不相关。在该研究中观察到的膜样结构是否由脂质或蛋白组成没有确定。

系统发育分析指示PRV属于正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒属的同根分支(3)。然而，近年来的研究总结PRV与正呼肠孤病毒属更相关，并且其编码与哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)σ1细胞粘附蛋白同源的蛋白(4，12)。病毒和红细胞之间的相互作用是被包括呼肠孤病毒科的不同病毒科的成员共享的特征性特征。MRV通过σ1蛋白粘合红细胞，其是通过唾液酸结合基序介导的结合(17)。该基序在PRVσ1中部分保守(4)。按照MRV和PRV之间的系统发育关系，有趣地注意到病毒和红细胞的相互作用是保守的。PRV可以用作理解呼肠孤病毒科中的系统发育关系的有趣模型，因为其目前是唯一已知与正呼肠孤病毒属相关的鱼病毒。

哺乳动物红细胞致力于运输氧并且它们在进入循环之前经历脱核(enucleation)并缺少细胞器；有益于它们的载氧能力而且使它们耐病毒感染的一种进化特点()。冷水鱼与大西洋鲑一样需要较少的氧和新陈代谢，因此不太依赖于高的氧运输。低氧需求的极端实例是缺少红细胞的南极的无血红蛋白银鱼(antarctichemoglobinlessicefish)(Channichthyidae)(18)。大多数的非哺乳动物红细胞，包括鱼的那些，是有核的并且包含细胞器，并因此可能可以用作病毒复制的宿主(19)。在该研究中，示出个体鱼具有通过流式细胞术看出的超过50％PRV感染的RBC。流式细胞术的灵敏度仅能够检测RT-qPCR的Ct值低于20的个体中受感染的RBC，因此PRV感染细胞的发病率可能显著更高。考虑到RBC是血液中最丰富的细胞，受感染鱼中的总病毒负荷将是显著的。

研究已经示出鱼的体外红血细胞群是不同年龄的细胞的混合物()。在通过免疫荧光显微术检测的阳性红细胞群中，存在细胞形态的改变，一些识别为成熟红细胞而其他类似于不成熟的红细胞。与趋于具有更圆的细胞和细胞核形状的不成熟红细胞(多染细胞)相反，成熟血红细胞由椭圆形状和拉长的紧密细胞核表征(20。由于RNA和细胞器的量随细胞年龄增加而减少，所以红细胞成熟阶段在细胞含量上不同。年轻的(较不成熟的)红细胞包含较高总浓度的RNA，并且老化细胞显示包括核糖体和线粒体的细胞器缺失(21)。这可以表明更具细胞活性的青年(不成熟)红细胞可以更好地支持病毒复制。尽管人类成熟红细胞不能支持生产性的病毒感染，但是已经在成熟红细胞中检测到了科罗拉多蜱热病毒(CTFV，Coloradotickfevervirus)，环状病毒属的呼肠孤病毒。认为这是感染的有核不成熟细胞的结果而不是CTFV在成熟红细胞中的直接进入和复制的结果，因为已经示出CTFV在受感染的小鼠的成红细胞(有核红细胞，erythroblast)和网状细胞以及人类造血祖细胞中复制。在养殖的大西洋鲑中，由于高动物密度或升高的温度、春天和夏天，养殖因素如减少的氧供应，刺激红细胞生成并且因此将预计增加幼稚细胞(不成熟细胞)的相对比例。红细胞性质的差别对PRV复制和感染结果具有重要意义。在该研究中观察到的球形RBC也可以是应力诱发的红细胞膨胀的结果，并且不必然表示不成熟的红细胞。未来研究将探究PRV在造血细胞中的复制可能性。此外，血液中其他可能的靶细胞的问题有待回答。

存在许多鲑鱼红细胞中病毒包涵体的报道，所述病毒包涵体集中命名为红细胞包涵体综合征(EIBS)(11)。没有将具体的病毒指定为这些发现的病原体。

在与大西洋鲑、虹鳟鱼(O.mykiss)、大鳞大麻哈鱼(Chinooksalmon)(O.tshawythscha)和银鲑(cohosalmon)(O.kisutch)类似的大西洋和太平洋海岸线两者中的鲑鱼物种中观察到了假设为病毒起源的红细胞包涵体。在该研究中描述的PRV颗粒和包涵体与早期报告的描述为EIBS的几种病毒包涵体具有惊人的相似性(11，22，23)。这些观察都描述了包含与该研究中所报告的相同大小的裸病毒的膜结合病毒包涵体，并在健康和患病鱼中都观察到，后者具有包括贫血和败血病的临床迹象。此处所描述的层状结构存在于许多这些报告中。发现表示PRV组成术语EIBS的一部分，并且在具体验证时应当称为红细胞PRV包涵体。

已经进行了几个研究以显示PRV感染对养殖的大西洋鲑的健康的意义。已经示出PRV是HSMI的病原学原因，因为心脏病毒负荷与疾病发展相关且已经在心肌细胞中检测到与疾病进程一致的PRV抗原(8，9)。然而，本研究示出红细胞中的复制是没有被HSMI诊断覆盖的PRV感染的重要特征。尽管HSMI由PRV引起，但是应当将疾病认为是PRV感染的可能结果。无论是否存在心脏病变，PRV在红细胞中的复制对于鱼的健康可能具有更广泛影响。

目前基于心脏和骨骼肌中的组织病理变化诊断HSMI。鉴于感染期间血液和红细胞中的高病毒滴度，有趣的是注意到这些组织的高度血管化部分通常最受影响。在心脏中，最初在外部致密层和心外膜中观察到心肌病变，这与内部海绵层相反，其包含从冠状动脉分支的许多血管。早期的组织病理病变从心外膜延伸并特别是沿着小的血管结构延伸到致密层。这可以暂时归因于在感染期间近距离暴露于血液中的病毒。在骨骼肌中，病变位于红骨骼肌(redskeletalmuscle)。与HSMI期间看起来未受影响的白骨骼肌(whiteskeletalmuscle)相比，该肌肉层也是高度血管化的(55)。

与心脏和骨骼肌相反，脾脏和前肾中的病变没有包括在HSMI的诊断标准中，然而，后者器官包含更多的病毒(24)；在该研究中确认的发现。可以将这些高病毒滴度中的一部分指定为残留的PRV感染的RBC。此外，两个器官在病毒感染的清除中都是免疫重要的，因此影响PCR读取。不应当排除PRV可以在前肾或脾脏中的非RBC细胞中复制。还有趣的是注意到大西洋鲑的造血组织主要位于前肾和脾脏中。

发现PRV普遍分布在挪威、加拿大和智利的健康的养殖大西洋鲑中，以及发现在挪威的野生大西洋鲑和斑鳟(SalmotruttaL.)以及加拿大的野生大麻哈鱼(Chumsalmon)(Oncorhynchusketa)、虹鳟鱼(O.mykiss)和割喉鱼(O.clarkii)中发病率低。健康的养殖和野生鱼中PRV的广泛出现可能反映了在不诱发HSMI发作中看到的心脏和骨骼肌病变的水平上在红细胞中的复制。实地观察表示PRV存在于HSMI发作停止很久以后的养殖的大西洋鲑群中。红细胞的持续感染可以解释这些发现，因为认为鱼的红细胞循环6个月长(21)。重要的是注意到PRV存在于循环红细胞中将影响通过qPCR筛选包括心脏、骨骼肌、前肾和脾脏的任何器官检测到的病毒量。包含PRV阳性细胞的残余血液将影响得到的qPCR结果，即使是当残余细胞没被感染时。

总之，PRV在红细胞中的复制提供了关于HSMI发病机理的新信息，并将PRV定义为病毒红细胞包涵体的重要因素。

表1.来自挑战#2的RBC的PRVCt值。

表S1.0、4、6、8、10、12和14周挑战后(Wpc)取样的来自挑战实验1的血液、心脏、骨骼肌(SM)、脾脏和前肾(HK)中的鱼正呼肠孤病毒(PRV)Ct值。不同组织的平均Ct值和标准差(平均值(±SD))示出在右侧列中。包括取样的鱼的唯一标识(实例F101-F106)。Na，不可得；Ct，循环阈值。

表S2

表S2.在0和3-8周挑战后(Wpc)取样的来自挑战实验2的血液、RBC、脾脏和血浆的鱼正呼肠孤病毒(PRV)Ct值。不同物质的平均Ct值和标准差(平均(±SD))示出在右侧列中。包括取样的鱼的唯一标识(实例F01-F06)。

实施例2

红细胞的体外培养

从通过RT-qPCR(脾脏)确认没有被PRV感染的成年大西洋鲑(大约2kg，NIVA，Solbergstrand，Norway)中分离红细胞。洗涤细胞，计数并将其以5mill/ml溶解在补充有胎牛血清(10％)和庆大霉素(50g/ml)的LeibovitzL15介质中。将细胞以5mill细胞/孔涂覆在24孔板上并将其保持在15℃下无CO₂培养箱中缓慢搅拌。第二天，添加从这些被PRV感染的三条单独的鱼(挑战实验#2，共居者，6WPC)新鲜分离的红细胞(0.1mill细胞/孔)，并将细胞温育长达13天(15℃)。在每个时间点收获250μl细胞于灭菌eppendorff管中并离心(750xG，5min)。丢弃介质，并从红细胞颗粒中分离RNA。

结果

进行预实验(pilotexperiment)以查看PRV是否可以在体外培养的红细胞中增殖，且得到的结果示出两周内120倍的增加。培养物中的RBC生存能力在测试的2周是优异的。图8示出引入病毒6天和13天后的病毒计数(RT-qPCR绝对量)的平均增加。

实施例3

材料和方法

体内PRV感染的鱼的血液。用挪威Vikan的VESOVikan水产研究设施使用十条未接种疫苗的初始重量为100g的适应海水的大西洋鲑进行PRV挑战实验。通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)确认研究设施中来自幼群(population)的鱼不含PRV、ISAV、鲑科鱼甲病毒(SAV，salmonidalphavirus)、鱼心肌炎病毒(PMCV，piscinemyocarditisvirus)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV，infectiouspancreaticnecrosisvirus)。目前，病毒性出血坏死病毒(VHSV，viralhaemorrhagicnecrosisvirus)不存在于Norwegian鱼养殖中，且没有将其筛选。挑战前使鱼适应环境2周并将其保持在12℃下供应有过滤的和UV辐射的盐度为32-33‰海水以及24h光/0h暗方案的罐中。取样之前，通过浸浴(2-5min)在氯化苯佐卡因(benzocainechloride)(0.5g/10L水)(ApotekproduksjonAS；Oslo，挪威)中麻醉鱼，并在使用氯化苯佐卡因(1g/5L水)取样5min之后将鱼安乐死。挪威动物研究机构已经批准了所述挑战实验。

将通过RT-qPCR测量包含高负荷PRV(Ct值19.9)的在之前的挑战实验中制备的血液颗粒(参见实施例1)用作挑战物质。已经确认所述物质不含ISAV、IPNV、SAV和PMCV。解冻血液颗粒，将其1:1稀释在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中，并使用0.1mL接种物/鱼腹膜内(i.p.)注射给予。5挑战周后(wpc)取样两条鱼i1和i2，从尾静脉收集周围血液至肝素化真空采血管。

来自幼鱼的血液。在挪威的Solbergstrand海洋研究站取样重量为226-374g的五条幼小的适应海水的大西洋鲑n1-n3。一年前使用包含没有佐剂的细菌蛋白的疫苗通过i.p.注射已经接种了鱼，且使用12h光/12h暗的方案将其保持在海水罐中。取样之前，通过浸浴(2-5min)在氯化苯佐卡因(0.5g/10L水)中麻醉鱼，并在取样之后通过打击头部将鱼致死。从所有三条幼鱼(n1-n3)取样周围血液至肝素化真空采血管中。

分离RBC。从幼鱼(n1-n3)收集的肝素化血液中分离RBC，并使用之前描述的Percoll梯度(实施例1)体内感染鱼(i1，i2)。简要地，将血液1:10稀释在蒸馏的PBS(dPBS)中，分层在间断的34％-49％的Percoll梯度(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)，在梯度底部收集RBC之前在4℃下离心2000xg20min。将包含残留的红细胞的34％-49％界面重新分层在新鲜的梯度上，并在4℃下离心500xg10min。收集该梯度底部的RBC，与来自第一梯度的红细胞合并，并在PBS中洗涤两次。使用Countess(Invitrogen，Eugene，Oregon，USA)计数细胞，并将其重新悬浮在补充有胎牛血清(10％)和庆大霉素(50μg/ml)的Leibovitz'sL15(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)介质中。

PRV体外感染实验。通过RT-PCR(以下描述)确认从体内感染的鱼i1和i2分离的RBC是PRV阳性的。在-80℃下将1x10⁷细胞/mL的i1和i2RBC的批次冷冻-解冻一次，并在4℃下离心800g5min。收集上清液并将其用作PRV传代中的接种物。

通过RT-PCR(以下描述)确认来自幼鱼n1、n2和n3的RBC是PRV阴性的，并其用作PRV传代中的幼鱼受体RBC。在12孔板中，每孔添加2mL的L15介质中的RBC(1x10⁷细胞/mL)。在12℃下通过缓慢搅拌温育板过夜。第二天，将来自体内PRV感染的鱼i1或i2的100μLRBC接种物添加至孔中，并在12℃下通过缓慢搅拌温育直到取样。在1、6、12和19dpi收获板(每次取样一个板)。将一毫升(即，1x10⁷RBC)转移至无菌eppendorf管中并750g离心5min，以及将上清液置入单独的管中。从红细胞颗粒分离总的RNA用于qPCR分析。将剩余的1x10⁷RBC用于流式细胞术分析、免疫荧光和血涂片的制备。以下描述了所有分析。

第二传代。将与第一传代一样处理的板物质用作第二传代中的接种物。在第22dpi天，将感染孔中的两个选作接种物：被i1感染的幼鱼n2(n2-i1)和被i2感染的幼鱼n2(n2-i2)。在-80℃下将1x10⁷细胞/mL的批次冷冻-解冻一次，并在4℃下800g离心5min，以及将上清液的10倍稀释液用作接种物。将来自幼鱼n4和n5的RBC用作第二传代中的受体，并用100μl的n2-i1和n2-i2制备物的10°、10^-1和10^-2稀释液温育。在1dpi和15dpi，取样板用于RT-qPCR分析。

RNA分离。如之前所描述的从1x10⁷RBC中分离总的RNA(实施例1)。简要地，按照制造商的说明，将RBC均质化在QIAzol溶解试剂(Qiagen，Hilden，Germany)中，添加氯仿，分离相，并使用RNeasyMini旋转柱(Qiagen)从水相中提取RNA。使用NanoDropND-1000分光光度计(ThermoFisherScientific，Wilmington，DE，USA)定量RNA。

qPCR。使用每样品200ng的总RNA进行逆转录，并将来自12个代表性样品的混合输入用于制备七点浓度标准曲线。在cDNA合成之前，在95℃下变性RNA5min，这是使用除去完整基因组DNA的Quantitect逆转录试剂盒(Qiagen)进行的。在对应于10ng的RNA输入(投入)的cDNA上一式两份运行定量PGR(qPCR)。使用Quantifast探针qPCRMasterMix(Qiagen)和400nM特异引物以及靶向编码PRVσ3基因的S1片段的200nM探针进行PRV分析。在Mx3005P设备(Stratagene，LaJolla，CA，USA)中运行扩增40个循环，94℃/15s，54℃/30s，72℃/30s。在相同的板上运行由σ3基因的体内转录体(10⁷至10个转录体)制成的cDNA的绝对量标准曲线，并用于计算靶病毒RNA分子的数量。使用的引物和探针列于表2中。

对于抗病毒应答基因表达分析，将以上给出的主混合物(mastermix)和引物/探针浓度用于靶向鲑鱼(A.salmon)IFNα、Mx和RIG-I。运行测定40个循环，94℃/15s、60℃/30s。使用500nM引物和相同循环条件的MaximaSYBRGreen/ROXqPCRMasterMix(Fisherscientific)测定伸长因子1α(EF1α)的水平。使用的引物和探针列于表2中。通过熔点分析确认SYBRGreen测定的特异性。在每个板上运行浓度标准曲线并将其用于计算相对差。将EF1αmRNA的水平用于归一化。

表2.实施例2中使用的引物。淬灭剂和探针报告染料用斜体。

数据分析。将来自体外感染实验的1dpi的PRVq-PCR结果与在6、12和19dpi的配对样品比较。针对IFNα、Mx和RIG-I进行类似比较，将未感染的幼鱼的qPCR结果指定为1并计算在1、6、12和19dpi的倍数增加。使用威氏配对符号秩次检验(Wilcoxonmatchedpairssignedranktest)由样品大小分析差值(n＝6)。

流式细胞术。除从被PRV体内感染的(i1，i2)分离的RBC和幼鱼受体RBC(n1-n3)之外，筛选体外感染实验(1、6、12和19dpi)期间取样的RBC的PRV用于通过流式细胞术分析。如之前所描述的(实施例1)使用兔子产生的多克隆抗体针对推断的PRV外壳蛋白σl(抗-σl，#K275)细胞内染色RBC。简要地，以1.0x10⁶细胞/孔的密度将RBC涂覆在96孔板上，在染色缓冲液(PBS+1％BSA+0.05％叠氮化物)中洗涤，固定并通过在Cytofix/Cytoperm(BectonDickinson，SanDiego，CA，USA)中温育渗透以及使用一抗抗-σl(1:10000)和二抗AlexaFluor488结合的抗-兔IgG(MolecularProbes，Eugene，Oregon，USA)(2mg/ml1:800稀释的)染色。将对应的零血清(抗-σl零#K275)[8]用作阴性对照血清。在Gallios流式细胞仪(BeckmanCoulter，Miami，FL，USA)上读取细胞，计数为50000细胞/样品。使用Kaluza软件(BectonDickinson)分析数据。

免疫荧光显微术。还通过免疫荧光显微术检查用于流式细胞术的PRV染色的RBC。在将它们转移至Countess隔室玻片(chamberslide)(Invitrogen)之前，用碘化丙啶(0.5μg/mL，MolecularProbes)染色细胞核。通过倒置荧光显微镜(Olympus1X81)以20x和40x放大倍数拍摄照片。

监控培养物中体内感染的RBC。与以上所描述的体外感染实验分开，将来自已经被PRV感染的体内感染鱼i1和i2的剩余RBC保持在培养物中19天，以研究细胞形态和PRV感染的RBC的包涵体，使用幼鱼RBCn1-n3作为对照。在培养1、12和19天取样这些并根据以下描述进行研究。

共聚焦显微术。制备保持在培养物中的体内感染的i1和i2的RBC涂片，并在固定在冰冷的甲醇中之前干燥细胞。在PBS中再水合切片并在用针对dsRNA(J2；1:200)(Scicons，Hungary)的单克隆抗体和兔子抗σ1(1:500)顺序染色之前用5％脱脂奶在PBS中封闭(block)，中间洗涤。第二抗体：由MolecularProbes(Invitrogen)得到山羊抗-小鼠AlexaFluor488和山羊抗-兔子AlexaFluor647(1:1000)。用碘化丙啶(0.5ng/ml)复染细胞核，且盖玻片安装有Fluoroshield(Sigma-Aldrich)。通过Zeiss激光扫描共焦显微镜(ZeissAxiovert200M荧光倒置显微镜，安装有LSM510激光共聚焦单元、488nm氩激光器、546nm和633nm氦/氖激光器(CarlZeiss,Jena,Germany))中的Plan-Apochromat63/1.4油物镜顺序扫描以捕获不饱和图像。

氯化频哪氰醇染色。如之前所描述的以最小修改用氯化频哪氰醇染色来自体外感染实验和体内感染的i1和i2两者的RBC涂片(23)。简要地，将细胞固定在无水甲醇(absolutemethanol)中5min，并用过滤的氯化频哪氰醇溶液(溶解在36.7ml95％乙醇和13.25ml蒸馏水中的0.25g氯化频哪氰醇)染色1分钟。然后刚好在显微镜(OlympusIX-81，以60x放大倍数)检测之前的干燥和封固fluoroshield(Sigma-Aldrich)之前，在自来水中全面漂洗切片。用彩色照相机捕获图像并在AdobePhotoshopElements中将后者转换为灰度级以更好对比包涵体。

结果

幼鱼RBC和感染的RBC。在体外感染实验的准备中，通过qPCR和流式细胞术筛选体内(i1，i2)感染PRV的RBC和受体幼鱼RBC(n1-n3)。通过qPCR测得i1和i2每10ngcDNA都包含病毒靶序列的大约12000个拷贝。通过qPCR确认所有的幼鱼红细胞(n1-n3)是PRV阴性的。当通过流式细胞术分析体内感染的i1RBC时，检测到46％感染PRV，这是作为单个的低PRV阳性群观察到的(图9A)。在体内感染的i2中，49％的RBC是PRV阳性的，然而，通过流式细胞术观察到低PRV阳性群和较小的高阳性群两者(图9A)。在开始体外研究之前，通过流式细胞术确认所有幼鱼红细胞(n1-n3)是PRV阴性的(图9A)。

RBC的体外感染。将由PRV感染的i1和i2制备的红细胞裂解物传代至幼鱼初级红细胞(n1-n3)。在体外培养19天期间，通过q-PCR测得所有六个培养物中观察到PRV负荷增加。与1dpi(p<0.05)相比，在12和19dpi的平均病毒负荷显著较高(图9B)。与i1溶解物相比，当用i2红细胞裂解物感染时，三个体外感染的幼鱼RBC群(n1-n3)产生更多的病毒(图9C)。

通过免疫荧光的体外实验的PRV阳性细胞。在体外感染实验期间，针对PRV染色RBC样品，并通过流式细胞术和通过免疫荧光(IF)显微术目测两者进行分析。在1和6dpi，通过IF显微术或通过流式细胞术没有观察到阳性细胞(图10A)。在12dpi，通过IF显微术在所有六个样品中观察到单个PRV阳性RBC(图10B)。作为细胞质中粒状包涵体观察染色。在19dpi，在所有样品中观察到几个单个的PRV阳性红细胞。再次，作为细胞质包涵体检测染色，然而，更经常是作为一个突出的大包涵体检测染色(图10C)。包涵体在12和19dpi两者的相差(phasecontrast)中可见，并与PRV的免疫荧光染色共定位(图10B，10C)。PRV阳性的RBC趋于具有圆形的细胞形状和细胞核。尽管在12和19dpi的所有样品中检测到几个PRV阳性的RBC，但是通过流式细胞术不能观察到阳性群。

RBC引发先天免疫应答。为了确定PRV感染的RBC是否引发对PRV感染的抗病毒应答，沿着体外感染实验的过程分析IFNα、粘病毒抗性基因(Mx)和视磺酸可诱导的基因(RIG)-I的基因表达水平。在感染一天和六天后，早期抗病毒应答基因IFNα上调并在12dpi下降(图11A)。在PRV感染六天后，IFN调节基因Mx的水平显著增加(平均增加15倍)，随后在12和19dpi稍微下降(图11B)。对于通过IFN依赖性机制相应于细胞质dsRNA而调节的dsRNA解旋酶RIG-I，在6dpi观察到显著的8倍增加，且在实验期间表达保持升高(图11C)。单个幼鱼RBC群(n1-n3)示出一定程度上不同的应答水平和时间，但是示出相同的一般趋势(没有示出数据)。

使用体内感染的RBC表征PRV包涵体和RBC形态。与以上所描述的PRV体外感染实验分开，将体内感染的i1和i2的剩余RBC保持在培养物中并用于观察研究19天，以描述细胞形态和PRV感染的RBC的包涵体。将来自幼鱼n1-n3的RBC用作对照。来自幼鱼的RBC是具有一般成熟RBC的类似形状和大小的均匀群体。来自i1和i2的RBC部分是异源的，且RBC的细胞核和细胞形态都改变。此外，在感染的培养物中观察到一些较小的圆形细胞。

i1和i2RBC的染色涂片示出包涵体包含σ1蛋白和dsRNA。当1天后观察培养物时，检测到细胞质中的dsRNA和σ1少量点染色(punctualstaining)的RBC(图12A)以及σ1和dsRNA更明显染色的RBC(图12B)。后者细胞看起来比椭圆形RBC更小。在一些特征性的椭圆形RBC中，仅检测到dsRNA染色。这可以指示与抗σ1比较，抗dsRNA抗体对检测病毒感染更敏感。一般而言，i2的PRV阳性RBC比在i1中观察到的那些具有更强的和更频繁的染色。对照(n1-n3)对dsRNA和σ1染色两者是阴性的。

培养12天后，与PRV阴性RBC相比，对dsRNA和σ1染色强阳性的RBC看起来对微弱的PI染色变弱(图12C)，指示降低的存活性。与阴性细胞相比，PRV感染的RBC的细胞和细胞核形状一般更圆。与第1天观察的少量点染色相比，第12天观察的包涵体更大。包涵体的数量增加且观察到对σ1阳性的一些大包涵体。在第19天，观察到比早期时间点更频繁的dsRNA信号，且与第1天相比σ1包涵体更大(图12D)。此外，作为小点染色观察到多个看起来健康的椭圆形RBC对dsRNA和σ1是阳性的(图12E)。一般而言，当使用Alexa647作为荧光染料检测σ1时，尽管使用635nm的通带滤器(bandpassfilter)，具有强PI信号的细胞在细胞核中给出一些非特异性信号。dsRNA和σ1信号有时共定位，但是看起来还是单独染色。

EIBS染色技术。之前已经在来自诊断为EIBS的鱼中的RBC中观察到了通过氯化频哪氰醇染色为染色阳性的包涵体。从小的和大的细胞质包涵体观察到(图13B，Bi和Bii)，经常在本研究中体内感染的i1和i2两者中检测到类似的染色。在来自幼鱼的RBC中没有观察到这些包涵体(图13A)。在培养物中12天之后，观察到细胞质包涵体数目减少(图13C)，且19天之后，包涵体看起来是单独的大的或小的包涵体(图13D，和插图)但还是聚集为群(图13D，插图)。

在体外感染实验中，使用被来自体内感染的RBC的细胞上清液感染的幼鱼RBC，在12dpi可以观察到接近细胞核的细胞质包涵体(图13E和插图)，并且在19dpi，观察到包涵体和大细胞“影”(图13F)。

讨论

在该研究中，证实由体内感染的鱼的RBC得到的PRV可以传代至幼小大西洋鲑鱼红细胞的培养物，并在体外复制。这提供了来自感染鱼的分离RBC包含传染性PRV颗粒，以及来自溶解RBC的上清液可以用于增殖PRV的证据。示出红细胞PRV包涵体包含PRV蛋白和dsRNA两者，并通过氯化频哪氰醇是染色阳性的。感染的RBC中生成了先天的抗病毒免疫应答。

缺少支持PRV复制的细胞系已经限制了PRV发病机理的研究。本研究已经证实了使用来自体内PRV感染的RBC和初级幼鱼红细胞的溶解物的体外感染模型，其可用于在感染后12天产生病毒负荷的显著增加。在该模型中，观察到提取自两种不同的感染鱼i1和i2的RBC之间的差别，被i2红细胞裂解物感染的幼鱼RBC中得到的病毒负荷相比于i1较高。通过流式细胞术，示出尽管在两个细胞群i1和i2中检测为PRV阳性的总细胞数目类似(分别是46％和49％)，i2RBC除低阳性群之外包含高PRV阳性细胞群。在体内实验性试验(实施例1)期间，在PRV感染的RBC中描述了低和高PRV阳性群两者，且存在的高阳性群与感染的峰值阶段相关。这可以指示高阳性群包含更多传染性病毒颗粒。

使用针对PRV蛋白σ1的多克隆抗体，在体外感染实验中通过IF染色在几个单个细胞中检测PRV。然而，通过流式细胞术检测到没有样品是阳性的(没有示出数据)。在之前进行的体内实验性试验中，证实通过qPCR测得包含高PRV负荷的血液可以用于PRV感染细胞的流式细胞术计数(实施例1)。然而，当样品qPCRCt值高于20时，用于流式细胞术的抗σ1抗体的敏感性太低而不能检测PRV阳性RBC群。有理由相信在该研究中得到的病毒负荷不符合用于该方法的检测的阈值。推断PRV阳性细胞的总数目或每细胞病毒的量太低而不能作为流式细胞术中明显的阳性群观察到。

存在的dsRNA和PRVσ1蛋白在该研究中的相同细胞中检测到，并定位至PRV包涵体。对于正呼肠孤病毒如MRV，病毒复制过程也集中在细胞质包涵体，称为病毒工厂(15)。已经示出正呼肠孤病毒的病毒工厂包含大量的病毒蛋白和dsRNA两者。在PRV感染的RBC中检测到的球形包涵体与在MRV3型原型菌株Dearing(T3D)感染的细胞(实施例1)观察到的病毒工厂相似。因此，PRV包涵体的含量和形态都与正呼肠孤病毒的病毒工厂类似。

所有鲑科鱼红细胞在循环中是有核的且保留核糖体和多个细胞器，因此能够进行转录和蛋白合成。然而，在成熟化和老化期间，在细胞质细胞器缺失和增加的血红蛋白含量之间存在反相关，这是通过降低的有氧代谢率实现的。在稳态条件下，总RNA含量和蛋白合成在年轻红细胞中都较高。不知道这些变化是否改变它们对PRV感染的敏感度。在体外感染实验期间仅在几个细胞中检测到大量的PRV蛋白可以指示RBC的灵敏度改变。通常，对特定病毒灵敏的连续细胞系用于病毒增殖。然而，这些细胞群是均匀的且新细胞由提供新的许可细胞(受纳细胞、允许细胞，permissivecells)的有丝分裂连续产生。相反，从鱼分离的初级红细胞不可分割且异源程度更高。因此，当使用体外培养的初级红细胞时，可以预期产生较少的病毒。使用初级RBC的益处将是它密切模仿体内状况，并非常适用于外源感染机制的研究。

在体外感染实验中，PRV感染的细胞与未感染红细胞相比趋于具有更圆的细胞和细胞核形状。这也在保持在培养物中时的i1和i2的体内感染RBC中观察到。大西洋鲑鱼的成熟红细胞具有椭圆形状和位于中心的具有致密染色质的卵形细胞核。

不成熟红细胞，所谓的多染细胞(polychromatocyte)和网织红细胞，具有更加卵形的细胞形状、卵形至圆形的具有较少致密染色质网络的细胞核，指示更高的转录活性(20)。在我们的实验中是否观察到感染和未感染细胞之间的形态差异取决于感染之前的不同细胞成熟度，或不知道是否它代表感染诱发的形态变化。与体内感染的i1和i2相比，幼鱼群(n1-n3)描述为具有更均匀形态的RBC。此外，微弱染色的dsRNA和σ1出现在具有椭圆形状的RBC中，但是更强染色的细胞趋于具有更圆的形态。这也许表明PRV感染本身诱发细胞和细胞核形状的变化。

不知道PRV是怎样从细胞传输至细胞的。认为后代颗粒的正呼肠孤病毒释放跟随细胞死亡和质膜的破坏，且感染通常导致由于凋亡或非凋亡细胞死亡的细胞溶解。已经示出多个细胞培养物和体内靶组织，包括心脏中的病毒诱发的细胞凋亡。然而，也在细胞培养物中证实了非溶解的持续感染。

PRV与红细胞包涵体综合征(EIBS)相关。EIBS是报告的多种鲑科鱼红细胞中的病毒包涵体的总称，且在大西洋和太平洋海岸的淡水和海水阶段的不同鲑科物种中进行了描述(11，22，23)。包涵体在受感染红细胞的细胞质中观察到且往往为1至3个，以及偶尔多至每细胞6个。检测EIBS最常用的方法是用氯化频哪氰醇染色血涂片，氯化频哪氰醇结合核酸，随后使用光学显微镜检测染色的细胞质包涵体。在目前的研究中，使用氯化频哪氰醇染色观察到类似的包涵体，指示之前对EIBS的诊断观察可能已经检测到PRV感染的红细胞。

已经将核酸的选择性荧光染料吖啶橙用于表征在EIBS中观察到的包涵体。吖啶橙在结合至双链(dsDNA或dsRNA)时发绿色荧光以及在结合至单链(ssDNA或ssRNA)时发红色荧光。报告了EIBS包涵体染红色，指示存在单链核酸RNA。在本研究中，通过使用针对dsRNA的单克隆抗体证实了包涵体中的dsRNA。不知道这些不同观察结果的原因。

在银鲑鱼(cohosalmon)(O.kisuth)监控红细胞包涵体的发展和血细胞比容值的实验性挑战中研究了EIBS的发展。示出EIBS的发作、包涵体的最大数目、持续时间和恢复阶段是温度相关的。在12℃下进行本研究，并将测试不同的温度用于进一步优化目前的体外实验方案。

近年来的研究已经示出鲑鱼红细胞在免疫应答中可以扮演活跃角色并引发对聚(I:C)刺激的抗病毒应答(25)。我们观察到PRV感染诱发IFNα产生和体外感染的RBC中Mx和RIG-I的基因活化，指示稳健抗病毒应答的归一化。干扰素(IFN)信号机制在鱼中是良好保守的，并进一步导致Mx诱导，已经示出其抑制病毒复制并保护不受草鱼呼肠孤病毒感染。但是没有研究Mx对PRV具有抑制功能。预期RIG-I上调会使细胞对细胞质dsRNA敏感，其还可以限制我们的培养物中的进一步感染和复制。这指示RBC引发的抗病毒应答可以是调节的希望目标，目的是得到体外RBC中更有效的病毒增殖。

在整个感染实验过程中从相同个体鱼中收集血液的能力对于研究病毒-宿主相互作用是理想的。在该研究中描述的体外感染模型可以进一步发展用于更有效的病毒增殖并将可能有益于进一步研究PRV感染、复制和从RBC释放。使用已知是体内PRV的主要靶细胞的初级(原发，primary)RBC将产生密切反应体内状况的信息。

实施例4：用于在鲑科鱼血红细胞(RBC)中培养诸如PRV的正呼肠孤病毒的实验方案的实施例。

制备接种物

1.将血样收集在肝素化管中。

2.在4℃下2000g离心10min。

3.除去血浆部分。

4.将血液1:10稀释在PBS中。

5.冷冻/解冻或超声处理接种物用于细胞溶解(参见以下)。

冷冻解冻

1.在-80℃下冷冻/解冻三次。

2.离心2000g/5min/4℃。

3.收集上清液。用作接种物。

超声处理

1.在冰上超声处理(以25Hz脉冲10X10sec，之间休息30秒)。

2.离心2000g/5min/4℃。

3.收集上清液。用作接种物。

培养

1.使用包含2％FCS和庆大霉素的L15中的10mill/mL将3ml幼鱼RBC涂覆至24深孔板中。

2.使用100μl接种物接种细胞(冷冻/解冻或超声处理)。

3.在15℃的InForsEcotron振动器(shaker)(200rpm)中温育7或14天。

取样

1.除去RBC悬浮物。

2.离心800g/5min/4℃。

3.通过任何用于RNA分离的标准操作分离RNA，并运行用于分析诸如PRV的正呼肠孤病毒的RT-qPCR。

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Claims (21)

1.一种用于增殖和分离正呼肠孤病毒的体外方法，所述方法包括在有核鱼红细胞中体外增殖和分离所述正呼肠孤病毒。

2.根据权利要求1所述的体外方法，其中，所述正呼肠孤病毒是感染鱼的正呼肠孤病毒。

3.根据权利要求1或2所述的体外方法，其中，所述正呼肠孤病毒在有核红细胞中复制。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的体外方法，其中，所述正呼肠孤病毒是鱼呼肠孤病毒(PRV)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的体外方法，其中，所述有核鱼红细胞是鲑科红细胞。

6.根据权利要求5所述的体外方法，其中，所述鲑科是鲑鱼或虹鳟鱼。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)共培养基本上不含正呼肠孤病毒的有核鱼红细胞与正呼肠孤病毒感染的有核鱼红细胞和/或包含正呼肠孤病毒源的任何其他物质以得到混合培养物；

b)温育步骤a)中得到的所述混合培养物，

c)从步骤b)的所述混合培养物中除去正呼肠孤病毒感染的红细胞，

d)可选地重复步骤a)至c)的操作，和

e)从步骤c)的所述红细胞中分离正呼肠孤病毒。

8.根据权利要求7所述的体外方法，其中，步骤b)的所述温育进行约14天或更长时间，诸如约4-45天。

9.根据权利要求7-8中任一项所述的体外方法，其中，将步骤a)至d)的操作重复至少2次，诸如约2-10次。

10.一种制备疫苗组合物的体外方法，所述方法包括权利要求1-9中任一项所述的方法，随后是灭活步骤e)中得到的分离的正呼肠孤病毒，以及此后制备包含灭活的所述正呼肠孤病毒的疫苗组合物。

11.根据权利要求10所述的体外方法，其中，所述正呼肠孤病毒是鱼呼肠孤病毒(PRV)且所述疫苗组合物用于治疗和/或预防心脏和骨骼肌炎症(HSMI)。

12.一种用于诊断鲑科物种鱼中的正呼肠孤病毒感染或PRV病毒存在的体外方法，所述方法包括：

a)从来自所述鲑科物种鱼的生物血样中分离红细胞，

b)检测从步骤a)得到的所述红细胞中正呼肠孤病毒的存在。

13.根据权利要求12所述的体外方法，其中，所述正呼肠孤病毒是鱼呼肠孤病毒(PRV)。

14.根据权利要求12-13中任一项所述的体外方法，其中，所述检测通过RT-qPCR进行。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的体外方法，其中，所述鲑科是鲑鱼。

16.有核鱼红细胞用于增殖正呼肠孤病毒的用途。

17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述正呼肠孤病毒是感染鱼的正呼肠孤病毒。

18.根据权利要求16或17所述的用途，其中，所述正呼肠孤病毒在有核红细胞中复制。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中，所述有核鱼红细胞是鲑科红细胞。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的用途，其中，所述鲑科是鲑鱼。

21.根据权利要求16-19中任一项所述的用途，其中，所述鲑科是虹鳟鱼。