CN105658657A - 病毒检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测流感病毒的方法和材料，其利用纳米颗粒探针如金纳米颗粒探针，所述探针包含多个糖缀合物配体，每个糖缀合物配体(GL)具有多个通过多价核(X)连接于纳米颗粒的含唾液酸的识别基团(Y)，其中所述多价核(X)是三价核，由此对于每个配体存在3个识别基团，其中所述生物缀合物上的识别基团特异性结合于所述目标流感病毒上的血凝素。探针可以包含结合于纳米颗粒的其它配体，所述其它配体不特异性结合于流感病毒-例如为聚乙二醇基团。这些可以调节纳米颗粒表面上糖缀合物配体的密度。探针的结合通过对流感病毒具有特异性的等离子体信号检测。

Description

病毒检测
技术领域
本发明总地涉及用于检测流感病毒的方法和材料。
背景技术
季节性流感是每年数万至数十万人的死因[1]。但是，特别值得关注的是由从动物传出的流感病毒所引起的大流行病的威胁。这种大流行流感的最近的实例是2009年爆发的流感A(H1N1)’猪流感’，其引起了高发病率，在一些情况下还引起了严重的疾病和死亡率。
流感病毒具有两种类型的表面糖蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA识别宿主细胞表面上存在的唾液酸并结合于这些糖类以便于感染细胞，NA从受感染细胞释放子代病毒[2]。预防新的流感病毒流行的措施包括疫苗接种和抗病毒药两者，后者理想状态下应在感染的48小时内给药[3]。
抗病毒药物的有效使用需要快速和早期的诊断。检测病毒的现有方法包括：包括反转录PCR、免疫荧光抗体染色的流感分离株的分子鉴定法，在细胞培养或鸡胚培养中的病毒分离法，及通过血凝抑制或通过微量中和进行的血清学诊断[3b]。所有这些方法均耗时，需耗费数小时或甚至数天才能得到结果，并且也需要专门的设备和受过培训的分析员。
水混悬液中的金纳米颗粒(直径为约16nm)由于它们的表面等离子体吸收带而表现出强烈的红色。这一光学性质是有赖于距离的，一旦金属纳米颗粒聚集，则溶液变色。容易用肉眼观察的颜色变化是由于颗粒的表面等离子体场之间的相互耦合作用。基于金纳米颗粒的比色测定法已经报告[4]用于检测多种物质种类，包括寡聚核苷酸，金属离子，阴离子，有机小分子和蛋白质，最近由Rotello等人对该领域进行综述[5]。通过用特定合成的糖类配体使金属纳米颗粒官能化，可以产生糖纳米颗粒[6]。基于糖纳米颗粒的比色测定法已经用于检测凝集素，钙离子，和霍乱毒素[7]。
金纳米颗粒已经用于抑制流感病毒。Papp等人利用由唾液酸封端的甘油树枝状大分子官能化的14nm金纳米颗粒来抑制X31流感病毒(携带A/Aichi/2/68的HA和NA基因的重配株H3N2流感病毒)[8]。另外，涂覆有可治疗流感的奥塞米韦的膦酸酯类似物的金纳米颗粒[9]、涂覆有巯基乙烷磺酸盐和巯基琥珀酸的金纳米颗粒[10]、及用ssRNA官能化的金纳米棒[11]也已经用于抑制流感病毒。
金纳米颗粒也已经用于检测流感病毒。流感A/PuertoRico/8/34(PR8)(H1N1)病毒已经使用抗体官能化的金纳米颗粒和动态光散射来检测[12]。用唾液酸的化学未改性单体官能化的金纳米颗粒已经用于通过唾液酸和病毒上的HA之间的相互作用来以比色法检测B/Victoria和B/Yamagata谱系的流感B病毒[13]。
US2008/0194801涉及据报道的新化合物库，所述化合物库包括在一端具有附接元件且在另一端具有识别元件的间隔基。化合物库可以连接于固体载体并用于传感器和生物传感器。
WO2011/130332涉及结合特定目标Has的多糖阵列(glycanarrays)，且据报道其可检测各种亚型和毒株的流感病毒并且可区分它们。也报道性地公开了以利用纳米颗粒放大技术的试验使用多糖阵列的方法。
WO2008/123844涉及检测磁性纳米颗粒的方法和系统，包括测量光学响应中TP等离子体吸收的磁光增强。
US2012/0015344涉及由结合于磁性纳米颗粒的导电聚合物形成的颗粒状组合物。颗粒状组合物可以通过进一步包括结合于颗粒状组合物的导电聚合物的结合对成员(例如特异性识别病毒株或病毒表面蛋白的抗体或其片段)而形成生物学增强的电活性磁性(BEAM)纳米颗粒组合物。尽管存在上述进展，但是可以看出，本领域仍需要下述快速的诊断性试验，其操作简单，可在未纯化样品上操作，并且理想地能够区分人流感和出现的动物毒株，例如禽H5N1’禽流感’病毒(该病毒在2003-2004年再次出现之后已经引起了相当多的关注)或在2013年传染给人类的禽H7N9。
发明内容
发明人已经开发出糖纳米颗粒，其包含新型糖缀合物，所述糖缀合物具有流感特异性唾液酸部分，所述流感特异性唾液酸部分可借助于流感病毒株的结构及相应HA的唾液酸连接特异性而区分流感病毒株。这些糖纳米颗粒可以用于特异性地和快速地检测流感病毒。优选的糖缀合物是三价的，其形式提供改善的结合性质和特异性性质并且可以较好地与HA相互作用[15]。发明人已经证明具有唾液酸α2,6半乳糖识别基团的配体可以用于特异性检测人流感病毒。在其它实施方式中，唾液酸α2,3半乳糖序列可以用于优先结合禽流感病毒[14]。
因此，本发明提供检测流感病毒的方法及相关材料和制备相关材料的方法。
因此，本发明的一个方面提供了特异性检测样品中的目标流感病毒的方法，所述方法包括：
(a)提供包含多个糖缀合物配体的纳米颗粒探针，每个配体具有多于一个通过多价核连接于纳米颗粒的含唾液酸的识别基团(Y)，其中所述生物缀合物上的识别基团(Y)特异性结合于所述目标流感病毒上的血凝素；
(b)使所述纳米颗粒探针和所述样品在可有效使所述目标流感病毒的血凝素特异性结合于所述识别基团(Y)的条件下接触；
其中所述特异性结合产生对所述流感病毒具有特异性的可检测的等离子体信号(plasmonicsignal)；
(c)检测在步骤b)中产生的信号。
优选地，目标流感病毒是人流感病毒，且在(c)中产生的信号不同于由禽流感病毒产生的信号。但是，也可以提供如下所述的其它特异性。
本文中的“不同”是指在(c)中使用的条件下可容易区分，例如当在相当的条件下使用同等样品进行比较时。优选地，由非目标流感病毒产生的信号小于由目标病毒产生的信号的50％、40％、30％、20％、10％、5％。本文中的“信号”涉及表面等离子体(plasmon)吸收带的变化(位移或强度)。如下文实施例中所示，对人流感病毒(使用X31测试)目标具有特异性的优选纳米颗粒探针在禽流感病毒存在下的等离子体信号显示出可忽略的变化。
在优选的实施方式中，每个糖缀合物配体包含三价核，由此对于每个配体存在3个识别基团(Y)。
因此，每个糖缀合物配体(GL)可以具有下式：
其中：
Y是含唾液酸的识别基团；
在优选的实施方式中，Y终止于唾液酸部分的α-端基异构体(α-anomer)，且唾液酸部分通过2,6糖苷键结合于吡喃糖单糖单元(例如半乳糖)。优选地，唾液酸部分和单糖是硫键连接的。
Y可以进一步包含间隔基部分’Z’，该间隔基部分’Z’将含唾液酸的部分连接于核基团X。这可以包括例如亚烷基或亚烯基，所述亚烷基或亚烯基可以包含胺、酰胺、醚、酯或硫酯连接基并且任选地由一个或多个杂原子和/或环中断，所述环包括芳环(例如苯、吡啶或1,2,3-三唑)，所述环是任选取代的。
m≥1，例如3。
X优选为多价核部分；其将基团Y与颗粒隔开并将Y中的唾液酸部分分隔开以使结合最优化；
X可以包含’Z’中限定的基团。其可以包含多价碳原子(“三脚架型(tripodal)核”)，三个Y识别基团连接于(例如通过XL基团)该多价碳原子：
XL1、XL2和XL3可以是例如-CH2-O-CH2-。
在优选的实施方式中，Y基团的一个或多个唾液酸部分的端基异构中心与单个多价核碳原子相隔20至30个键长(例如22至25个键长)或相隔1.5至3nm(例如2至2.5nm)。
L是连接部分，例如硫连接基；其促进GL与纳米颗粒的连接。
也提供了制备本申请所述的GL化合物的方法。
可用于实施本发明的纳米颗粒包括本领域已知用于其它纳米颗粒探针的那些纳米颗粒且将由以下材料制成：金属(例如金、银、铂、钴)、半导体(例如Si、CdSe、CdS和CdS或由ZnS包覆的CdSe)、核壳颗粒(例如金包覆的银颗粒)、合金颗粒(例如银和金合金)、磁性(例如钴)和非金属(例如硅)胶体材料。核壳颗粒描述于PCT申请PCT/US01/50825和PCT/US02/16382及美国专利号7,147,687和7,238,172。也可以使用由例如对巯基具有亲和力的材料构成的其它纳米颗粒。
纳米颗粒优选为金纳米颗粒。
纳米颗粒的尺寸优选为约5nm至约150nm(平均粒径)，更优选为约5至约50nm，最优选为约10至约30nm。
在这些实施方式中，纳米颗粒的直径可以为例如3nm或更大、3.5nm或更大、4nm或更大或4.5nm或更大。
在这些实施方式中，纳米颗粒的直径可以为例如10nm或更小、15nm或更小、20nm或更小、30nm或更小、40nm或更小、50nm或更小、75nm或更小、100nm或更小。
金纳米颗粒的直径可以为例如3.5nm至15nm、3.5至20nm、3.5至40nm、3.5nm至50nm、3.5nm至75nm、3.5nm至100nm。
优选的直径为约16nm，例如12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或20nm。
优选地，纳米颗粒是直径为约16nm的金纳米颗粒。
每个纳米颗粒探针通常将具有多个连接的糖缀合物配体，其分散在整个纳米颗粒表面上。
例如，对于每个纳米颗粒，GL化合物的平均数目可以为5、10、25、50、100或200。
在一些实施方式中，除了糖缀合物配体之外，探针还具有一个或多个其它结合于纳米颗粒的配体。不特异性结合于流感病毒的其它配体可以用于调节纳米颗粒表面上糖缀合物配体的密度，从而使结合和特异性最优化。
在一种实施方式中，探针包含结合于固体载体的聚乙二醇(PEG)，例如硫醇化的PEG。
在一种这样的实施方式中，聚乙二醇是H(OCH2)4S-，其通过硫原子结合于纳米颗粒。
在一种实施方式中，探针包含结合于固体载体的相转移试剂。
在一种这样的实施方式中，相转移试剂是四辛基卤化铵，例如四辛基溴化铵(TOAB)。
糖缀合物配体:其它配体(例如PEG)的摩尔比可以为例如10:10至90:10。优选地，其它配体是过量的。
非限制性的示例性比例为1:99；5:95；10:90；25:75；50:50；75:25；或90:10。
在优选的实施方式中，糖缀合物配体:其它配体的比例为15:85至35:65，例如20:80至30:70，例如约25:75。
优选地，可检测的信号是可用肉眼观察到的颜色变化。
优选地，步骤(b)中的所述特异性结合引起纳米颗粒的聚集，其中所述聚集产生或促成所述可检测的等离子体信号。
优选地，可检测的信号在60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、10分钟或5分钟内产生。
在制备极少样品或不制备样品的情况下即可使用本发明的方法。本发明的方法可以用于例如在动物和/或人类的样品如拭子、排泄物和血液中、在环境样品中检测流感病毒和/或病毒颗粒。在一种实施方式中，本发明的方法用于在动物和/或人类的痰或唾液样品中检测流感病毒和/或病毒颗粒。
优选地，纳米颗粒探针在水混悬液中使用。
因此，在一个方面，本发明涉及病毒检测溶液，其包含结合于纳米颗粒的上述糖缀合物的水混悬液。
在一种实施方式中，糖缀合物覆盖的纳米颗粒在病毒检测溶液中的浓度为0.05nM至10nM，例如0.1nM至7.0nM或1nM至5nM。
在一种实施方式中，将感兴趣的样品直接添加(纯的)到病毒检测溶液中。在另一种实施方式中，在添加到病毒检测溶液中之前，将感兴趣的样品进行稀释。
在使用时，对可检测的等离子体信号例如颜色变化进行的观察可以使用本领域已知用于其它纳米颗粒探针的方法来评价。在对比色的背景反衬下用肉眼进行这样的评价可以较容易地进行。例如，当使用金纳米颗粒时，如下有助于观察颜色变化：使杂化溶液的样品在固体白色表面(例如硅胶或氧化铝TLC板、滤纸、硝酸纤维素膜和尼龙膜且优选为尼龙膜)上形成斑点且使斑点干燥。在目标病毒的存在下，溶液或斑点可由粉色/红色变为较蓝色的斑点。
颜色变化可以如下量化：用光学扫描装置例如平板扫描仪或CCD照相机记录板图像且分析每个单独斑点的颜色的量和类型。可选择地，滤光镜(例如红色滤光镜)可以用于滤除特定颜色，由此可以记录和分析每个斑点的信号强度。
允许或有助于对可检测的变化进行观察的基质可以是本领域已知的那些基质。适宜的基质包括透明的固体表面(例如玻璃、石英、塑料和其它聚合物)、不透明的固体表面(例如白色固体表面，例如TLC硅胶板、滤纸、玻璃纤维过滤器、硝酸纤维素膜、尼龙膜)和导电固体表面(例如氧化铟锡(ITO))。基质可以具有任何形状或厚度，但是通常将是平坦和薄的。优选的是透明基质例如玻璃(例如载玻片)或塑料(例如微量板的孔)。
在通过本申请所述方法检测之后，可使样品接受确认试验，例如反转录聚合酶链反应。
在本发明的其它方面，糖缀合物配体可以连接于不同的(非纳米颗粒)固体载体。术语“固体载体”是指本发明化合物可以与其结合的具有刚性或半刚性表面的材料。
这样的载体优选呈现的形式是小珠、钉状物/冠状物、层状表面、丸、圆盘。
固体载体例如基于表面等离子体共振或表面增强拉曼光谱而可以是检测系统的一部分。
在本发明的其它方面，糖缀合物配体可以连接于荧光纳米颗粒，例如量子点、荧光标记的聚合物珠、荧光标记的硅珠(例如硅纳米颗粒)或荧光标记的磁性珠(例如磁性纳米颗粒)。应该理解的是，除非上下文另有其它要求，否则这些其它固体基质应该比照适用本申请任何关于金纳米颗粒的讨论。
现在将讨论纳米颗粒探针的一些优选实施方式：
如上所述，本发明的纳米颗粒探针最广义地包含：
·多个任选多价的糖缀合物配体，
·每个配体具有至少一个含唾液酸的识别基团(Y)，
·其中Y经由对Y任选多价的核连接于纳米颗粒。
在使用中，生物缀合物上的识别基团(Y)特异性结合于目标流感病毒上的血凝素，所述特异性结合产生对所述流感病毒具有特异性的可检测的等离子体信号。
纳米颗粒探针包含连接于纳米颗粒的糖缀合物配体(GL)，其中每个GL化合物包含1个或多个、优选2个、最优选3个如式(I)所示的含唾液酸的识别基团(Y)：
GL可以具有式(II)：
其中：
Y是含唾液酸的识别基团；
m≥1，例如1、2、3或4。
X是核部分；其将基团Y与颗粒隔开，且其中X是多价的，将Y中的唾液酸部分分隔开；
L是连接部分；其有助于GL与纳米颗粒的连接。
在一种实施方式中，m为3至6。
在一种实施方式中，m为3至5。
在一种实施方式中，m为3或4。
在优选的实施方式中，m为3。
含唾液酸的识别基团Y包含连接于一个或多个单糖单元的唾液酸部分，其中单糖单元通过键或通过间隔基部分连接于核X。
在优选的实施方式中，Y终止于唾液酸部分的α-端基异构体，且唾液酸部分通过2,3糖苷键结合于吡喃糖单糖单元(例如半乳糖)。
在优选的实施方式中，Y终止于唾液酸部分的α-端基异构体，且唾液酸部分通过2,6糖苷键结合于吡喃糖单糖单元(例如半乳糖)。
在优选的实施方式中，唾液酸部分的端基异构中心与核部分X的多价中心相隔20至30个键长(例如22至25个键长)。这在下文更详细地描述。
在优选的实施方式中，唾液酸部分的端基异构中心与核部分X相隔1.5至3nm(例如2至2.5nm)。
在一种实施方式中，含唾液酸的识别基团Y各自独立地为具有下式的部分：
其中：
Sia是唾液酸部分；
Sac1是唾液酸连接的单糖单元；
SacN是单糖单元；
Z是间隔基部分或单键；
n≥0；和
波浪线表示与X的连接点。
在一种实施方式中，Y的相对分子量小于5,000。
在一种实施方式中，Y的相对分子量小于3,000。
在一种实施方式中，Y的相对分子量小于2,000。
在一种实施方式中，Y的相对分子量小于1,000。
在一种实施方式中，每个核部分X连接于多于一种类型的含唾液酸的识别基团Y(例如具有不同的Sia、Sac1、SacN、Z和/或n的含唾液酸的识别基团)。例如，GL化合物可以具有两种不同类型的含唾液酸的识别基团：Y1和Y2，或三种不同类型的含唾液酸的识别基团：Y1、Y2和Y3。
但是，在优选的实施方式中，每个核部分X连接于仅一种类型的含唾液酸的识别基团Y(即所有识别基团都具有相同的Sia、Sac1、SacN、Z和n)。
唾液酸部分“Sia”是与神经氨酸有关的部分，其具有下式：
更特别地，唾液酸部分是具有下式的部分或其盐：
其中：
-W为S或C；
-RC2为C(＝O)OR1；P(＝O)(ORP1)(ORP2)；或S(＝O)2ORS1；
-RC4为OR4或NRN4RN5；
-R1为H或RA1；
-R4为H或RA4；
-R7为H或RA7；
-R8为H或RA8；
-R9为H或RA9；
-RN4为H或C1-6烷基；
-RN5为H；C1-6烷基；C(＝NH)(NH2)；或C(＝O)C1-6烷基；
-RA1为C1-6烷基；
-RA4为C1-6烷基；C(＝O)C1-6烷基；P(＝O)(ORP1)(ORP2)；或S(＝O)2ORS1；
-RA7为C1-6烷基；C(＝O)C1-6烷基；P(＝O)(ORP1)(ORP2)；或S(＝O)2ORS1；
-RA8为C1-6烷基；C(＝O)C1-6烷基；P(＝O)(ORP1)(ORP2)；或S(＝O)2ORS1；
-RA9为C1-6烷基；C(＝O)C1-6烷基；P(＝O)(ORP1)(ORP2)；或S(＝O)2ORS1；
-RP1为H或C1-6烷基；
-RP2为H或C1-6烷基；
-RS1为H或C1-6烷基；
-RN1为H或C1-6烷基；
-RN2为H；C1-6烷基；或C(＝O)RNN2；
-RNN2为C1-6烷基或CH2ORNNN2；
-RNNN2为H；RNNNN2；或C(＝O)RNNNN2；
-RNNNN2为C1-6烷基；和
波浪线表示与Sac1的连接点。
本申请使用的术语“C1-6烷基”属于通过从具有1-6个碳原子的饱和烃化合物的碳原子除去氢原子而得到的一价部分。对于具有多于3个碳原子的基团，该基团可以是线型或支化的。
在优选的实施方式中，唾液酸部分是具有下式的部分或其盐：
其中：
-W为S；且
R1、R4、R7、R8、R9、RN1、RN2和如上定义。
适当的式(V)和(VI)的部分的实例包括例如表I中所示的部分。
表I-落入式(V)和(VI)范围内的唾液酸部分的实例
在一种实施方式中，Sia是式(Sia-1)、(Sia-2)或(Sia-3)的部分。
在一种实施方式中，Sia是式(Sia-1)或(Sia-2)的部分。
在一种实施方式中，Sia是式(Sia-1)的部分。
应该注意的是，以上式(V)的Sia部分具有至少六个手性中心，具体为在下式中标记有星号(*)的碳原子。在这些位置的碳原子各自可以呈(R)或(S)构型。除非另有说明，否则提及一种对映异构体/非对映异构体意在提及两种对映异构体/所有非对映异构体。
在一种实施方式中，唾液酸部分具有下式：
应该注意的是，如下式所示，该部分可以存在称为alpha(α)和beta(β)的两种端基异构形式。“端基异构体”是环状糖的立体异构体，其不同仅在于它们在半缩醛碳或半缩酮碳处的构型。这样的分子的半缩醛碳或半缩酮碳称为“端基异构碳”或“端基异构中心”。在下式中，端基异构碳/端基异构中心用星号(*)标记。
在α-端基异构体中，RC2基团(例如COOR1)处于直立位置。在β-端基异构体中，RC2基团(例如COOR1)处于平伏位置。
在一种实施方式中，唾液酸部分Sia是α-端基异构体。
在优选的实施方式中，唾液酸部分Sia是式(VI)化合物的α-端基异构体即式(IX)的部分：
落入式(IX)范围内的唾液酸部分的实例包括例如表II所示的部分。
表II-落入式(IX)范围内的唾液酸部分的实例
在一种实施方式中，Sia是式(Sia-1a)、(Sia-2a)或(Sia-3a)的部分。
在一种实施方式中，Sia是式(Sia-1a)或(Sia-2a)的部分。
在一种实施方式中，Sia是式(Sia-1a)的部分。
在优选的实施方式中，Sia是具有下式的部分：
在另一种优选的实施方式中，Sia是具有下式的部分：
W
在一种实施方式中，W为S。
在一种实施方式中，W为C。
R C2
在一种实施方式中，RC2为C(＝O)OR1。
在一种实施方式中，RC2为P(＝O)(ORP1)(ORP2)。
在一种实施方式中，RC2为S(＝O)2ORS1。
R C4
在一种实施方式中，RC4为OR4。
在一种实施方式中，RC4为NRN4RN5。
R 1
在一种实施方式中，R1为H。
在一种实施方式中，R1为RA1。
R 4
在一种实施方式中，R4为H。
在一种实施方式中，R4为RA4。
R 7
在一种实施方式中，R7为H。
在一种实施方式中，R7为RA7。
R 8
在一种实施方式中，R8为H。
在一种实施方式中，R8为RA8。
R 9
在一种实施方式中，R9为H。
在一种实施方式中，R9为RA9。
R N4
在一种实施方式中，RN4为H。
在一种实施方式中，RN4为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RN4为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RN4为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RN4为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RN4为甲基。
R N5
在一种实施方式中，RN5为H。
在一种实施方式中，RN5为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RN5为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RN5为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RN5为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RN5为甲基。
在一种实施方式中，RN5为C(＝NH)(NH2)。
在一种实施方式中，RN5为C(＝O)C1-6烷基。
在一种实施方式中，RN5为C(＝O)Me、C(＝O)Et、C(＝O)iPr、C(＝O)nPr、C(＝O)tBu、C(＝O)iBu、C(＝O)sBu或C(＝O)nBu。
在一种实施方式中，RN5为C(＝O)Me或C(＝O)Et。
在一种实施方式中，RN5为C(＝O)Me。
R A1
在一种实施方式中，RA1为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA1为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RA1为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RA1为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RA1为甲基。
R A4
在一种实施方式中，RA4为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA4为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RA4为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RA4为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RA4为甲基。
在一种实施方式中，RA4为C(＝O)C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA4为C(＝O)Me、C(＝O)Et、C(＝O)iPr、C(＝O)nPr、C(＝O)tBu、C(＝O)iBu、C(＝O)sBu或C(＝O)nBu。
在一种实施方式中，RA4为C(＝O)Me或C(＝O)Et。
在一种实施方式中，RA4为C(＝O)Me。
R A7
在一种实施方式中，RA7为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA7为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RA7为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RA7为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RA7为甲基。
在一种实施方式中，R7A为C(＝O)C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA7为C(＝O)Me、C(＝O)Et、C(＝O)iPr、C(＝O)nPr、C(＝O)tBu、C(＝O)iBu、C(＝O)sBu或C(＝O)nBu。
在一种实施方式中，RA7为C(＝O)Me或C(＝O)Et。
在一种实施方式中，RA7为C(＝O)Me。
R A8
在一种实施方式中，RA8为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA8为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RA8为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RA8为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RA8为甲基。
在一种实施方式中，RA8为C(＝O)C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA8为C(＝O)Me、C(＝O)Et、C(＝O)iPr、C(＝O)nPr、C(＝O)tBu、C(＝O)iBu、C(＝O)sBu或C(＝O)nBu。
在一种实施方式中，RA8为C(＝O)Me或C(＝O)Et。
在一种实施方式中，RA8为C(＝O)Me。
R A9
在一种实施方式中，RA9为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA9为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RA9为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RA9为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RA9为甲基。
在一种实施方式中，RA9为C(＝O)C1-6烷基。
在一种实施方式中，RA9为C(＝O)Me、C(＝O)Et、C(＝O)iPr、C(＝O)nPr、C(＝O)tBu、C(＝O)iBu、C(＝O)sBu或C(＝O)nBu。
在一种实施方式中，RA9为C(＝O)Me或C(＝O)Et。
在一种实施方式中，RA9为C(＝O)Me。
R P1
在一种实施方式中，RP1为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RP1为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RP1为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RP1为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RP1为甲基。
R P2
在一种实施方式中，RP2为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RP2为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RP2为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RP2为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RP2为甲基。
R S1
在一种实施方式中，RS1为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RS1为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RS1为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RS1为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RS1为甲基。
R N1
在一种实施方式中，RN1为H。
在一种实施方式中，RN1为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RN1为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RN1为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RN1为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RN1为甲基。
R N2
在一种实施方式中，RN2为H。
在一种实施方式中，RN2为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RN2为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RN2为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RN2为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RN2为甲基。
在一种实施方式中，RN2为C(＝O)RNN2。
R NN2
在一种实施方式中，RNN2为C1-6烷基。
在一种实施方式中，RNN2为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RNN2为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RNN2为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RNN2为甲基。
在一种实施方式中，RNN2为CH2ORNNN2。
R NNN2
在一种实施方式中，RNNN2为H。
在一种实施方式中，RNNN2为RNNNN2。
在一种实施方式中，RNNN2为C(＝O)RNNNN2。
R NNNN2
在一种实施方式中，RNNNN2为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RNNNN2为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RNNNN2为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RNNNN2为甲基。
唾液酸部分Sia连接于单糖单元Sac1，该单糖单元Sac1是基于吡喃糖的单糖。
其可以涉及例如具有下式的吡喃糖形式的环状己醛糖：
在一种实施方式中，单糖单元Sac1是具有下式的化合物：
其中；
RQ1、RQ2、RQ3、RQ4和RQ6之一是连接于唾液酸部分的W的键；
RQ1、RQ2、RQ3、RQ4和RQ6中的至少一个是R’或OR’，其中：
当n＝0时，R’是连接于Z的键；
当n>0时，R’是连接于SacN的键；且
剩余的RQ1、RQ2、RQ3、RQ4和RQ6选自以下基团：
RQ1为ORQQ1或NHC(＝O)RQQQ1；
RQ2为ORQQ2或NHC(＝O)RQQQ2；
RQ3为ORQQ3或NHC(＝O)RQQQ3；
RQ4为ORQQ4或NHC(＝O)RQQQ4；
RQ6为ORQQ6或NHC(＝O)RQQQ6；
RQQ1为H或RQQQ1；
RQQ2为H或RQQQ2；
RQQ3为H或RQQQ3；
RQQ4为H或RQQQ4；
RQQ6为H或RQQQ6；
RQQQ1为C1-6烷基；
RQQQ2为C1-6烷基；
RQQQ3为C1-6烷基；
RQQQ4为C1-6烷基；和
RQQQ6为C1-6烷基。
应该注意的是，该单糖单元可以存在称为alpha(α)和beta(β)的两种端基异构形式。在α端基异构形式中，连接于端基异构碳C-1的RQ1与连接于C-5的基团是顺式的。在β端基异构形式中，连接于端基异构碳C-1的RQ1与连接于C-5的基团是反式的。
还应该注意的是，以上式(XIII)的Sac1部分具有至少五个手性中心，具体为处于1、2、3、4和5位的碳原子，它们在下式中各自用星号(*)标记。在这些位置的碳原子各自可以为(R)或(S)构型。除非另有说明，否则提及一种对映异构体/非对映异构体意在提及两种对映异构体/所有非对映异构体。
适宜的单糖单元包括吡喃糖形式的例如以下单元：
阿洛糖(All)；
阿卓糖(Alt)；
半乳糖(Gal)；
葡萄糖(Glc)；
古洛糖(Gul)；
艾杜糖(Ido)；
甘露糖(Man)；
塔罗糖(Tal)；
葡糖醛酸；或
半乳糖醛酸；
及其N-乙酰化氨基脱氧衍生物。
在优选的实施方式中，Sac1是D-半乳糖单元。换言之，在优选的实施方式中，Sac1具有下式：
在特别优选的实施方式中，Sac1是半乳糖单元的β-端基异构体。
单糖单元Sac1通过糖苷键连接于唾液酸部分的基团W。当W为S时，其对应于S-糖苷键。当W为C时，其对应于C-糖苷键。
基团RQ1、RQ2、RQ3、RQ4和RQ6中的任何一个可以是连接于唾液酸部分的基团W的键，如表III所示。
表III-Sac1与Sia的连接，其中表示与Sia的W的连接点
R Q1
在一种实施方式中，RQ1为连接于唾液酸部分的W的键。
在一种实施方式中，RQ1为R’。
在一种实施方式中，RQ1为OR’。
在一种实施方式中，RQ1为ORQQ1。
在一种实施方式中，RQ1为NHC(＝O)RQQQ1。
R Q2
在一种实施方式中，RQ2为连接于唾液酸部分的W的键。
在一种实施方式中，RQ2为R’。
在一种实施方式中，RQ2为OR’。
在一种实施方式中，RQ2为ORQQ2。
在一种实施方式中，RQ2为NHC(＝O)RQQQ2。
R Q3
在一种实施方式中，RQ3为连接于唾液酸部分的W的键。
在优选的实施方式中，Sac1为通过2,3键连接于Sia的D-半乳糖单元。在这样的实施方式中，Sac1具有下式：
其中表示与Sia的W的连接点。
在特别优选的实施方式中，Sac1为通过α-2,3键连接于Sia的D-半乳糖单元。换言之，Sia为α-端基异构体并且通过2,3糖苷键连接于D-半乳糖单元。在这样的实施方式中，Sia-Sac1具有下式：
在这些优选的实施方式中优选的是，D-半乳糖单元为β-端基异构体。
在一种实施方式中，RQ3为R’。
在一种实施方式中，RQ3为OR’。
在一种实施方式中，RQ3为ORQQ3。
在一种实施方式中，RQ3为NHC(＝O)RQQQ3。
R Q4
在一种实施方式中，RQ4为连接于唾液酸部分的W的键。
在一种实施方式中，RQ4为R’。
在一种实施方式中，RQ4为OR’。
在一种实施方式中，RQ4为ORQQ4。
在一种实施方式中，RQ4为NHC(＝O)RQQQ4。
R Q6
在一种实施方式中，RQ6为连接于唾液酸部分的W的键。
在优选的实施方式中，Sac1为通过2,6键连接于Sia的D-半乳糖单元。在这样的实施方式中，Sac1具有下式：
其中表示与Sia的W的连接点。
在特别优选的实施方式中，Sac1为通过α-2,6键连接于Sia的D-半乳糖单元。换言之，Sia为α-端基异构体并且通过2,6糖苷键连接于D-半乳糖单元。在这样的实施方式中，Sia-Sac1具有下式：
在这些优选的实施方式中优选的是，D-半乳糖单元为β-端基异构体。
在一种实施方式中，RQ6为R’。
在一种实施方式中，RQ6为OR’。
在一种实施方式中，RQ6为ORQQ6。
在一种实施方式中，RQ6为NHC(＝O)RQQQ6。
R QQ1
在一种实施方式中，RQQ1为H。
在一种实施方式中，RQQ1为RQQQ1。
R QQ2
在一种实施方式中，RQQ2为H。
在一种实施方式中，RQQ2为RQQQ2。
R QQ3
在一种实施方式中，RQQ3为H。
在一种实施方式中，RQQ3为RQQQ3。
R QQ4
在一种实施方式中，RQQ4为H。
在一种实施方式中，RQQ4为RQQQ4。
R QQ6
在一种实施方式中，RQQ6为H。
在一种实施方式中，RQQ6为RQQQ6。
R QQQ1
在一种实施方式中，RQQQ1为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RQQQ1为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RQQQ1为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RQQQ1为甲基。
R QQQ2
在一种实施方式中，RQQQ2为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RQQQ2为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RQQQ2为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RQQQ2为甲基。
R QQQ3
在一种实施方式中，RQQQ3为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RQQQ3为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RQQQ3为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RQQQ3为甲基。
R QQQ4
在一种实施方式中，RQQQ4为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RQQQ4为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RQQQ4为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RQQQ4为甲基。
R QQQ6
在一种实施方式中，RQQQ6为甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、仲丁基或正丁基。
在一种实施方式中，RQQQ6为甲基、乙基、异丙基或正丙基。
在一种实施方式中，RQQQ6为甲基或乙基。
在一种实施方式中，RQQQ6为甲基。
Sac N
除了唾液酸连接的单糖单元Sac1之外，化合物还可以包含另外的单糖单元SacN。
SacN单元的存在数目由整数n确定。
在一种实施方式中，n为0至10。
在一种实施方式中，n为0至8。
在一种实施方式中，n为0至6。
在一种实施方式中，n为0至5。
在一种实施方式中，n为0至4。
在一种实施方式中，n为0至3。
在一种实施方式中，n为0至2。
在一种实施方式中，n为0或1。
在一种实施方式中，n为0(即不存在SacN)。
在一种实施方式中，n≥1(即存在一个或多个SacN)。例如，n可以为1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。
在一种实施方式中，n为1(即存在一个SacN单元)。在这样的实施方式中，Sac1和SacN形成二糖。
适宜的单糖单元包括吡喃糖形式的例如以下单元：
阿洛糖(All)；
阿卓糖(Alt)；
半乳糖(Gal)；
葡萄糖(Glc)；
古洛糖(Gul)；
艾杜糖(Ido)；
甘露糖(Man)；
塔罗糖(Tal)；
葡糖醛酸；或
半乳糖醛酸；
及其衍生物(例如其脱氧和氨基脱氧衍生物及前述任何单元的酯、酰胺和乙酰基官能化形式)。
在一种实施方式中，SacN选自表IV中所示的单糖单元中的一种：
表IV-适当的SacN单元
在一种实施方式中，Sac1结合于式(Sac-2b)的单糖单元。
适当的基于N-乙酰化氨基脱氧己醛糖的单糖部分的实例如表V所示：
表V-合适的SacN单元
在一种实施方式中，Z为单键。
但是，在优选的实施方式中，Z为间隔基部分。
间隔基部分是用于将核部分连接于Sac1(当n＝0时)或SacN(当n>0时)的二官能或多官能部分。
有利地，间隔基部分使得能够调节含唾液酸的识别基团Y的长度、组成和刚性。这允许含唾液酸的识别基团出现在血凝素的结合位点同时使糖缀合物配体化合物中的应力最小。
在一种实施方式中，Z为C1-20亚烷基(例如C1-15或C1-10亚烷基)。
本申请使用的术语“C1-20亚烷基”是指如下得到的二价部分：从具有1-20个碳原子(除非另有说明)的可为脂族或脂环族的饱和烃化合物的同一碳原子上除去两个氢原子或从具有1-20个碳原子(除非另有说明)的可为脂族或脂环族的饱和烃化合物的两个不同碳原子上各自除去一个氢原子。
在一种实施方式中，亚烷基是线型脂族亚烷基。
在一种实施方式中，Z为具有1-3个碳-碳双键的C1-20亚烯基(例如C1-15或C1-10亚烯基)。
本申请使用的术语“具有1-3个碳-碳双键的C1-20亚烯基”是指如下得到的二价部分：从具有1-20个碳原子(除非另有说明)和1-3个碳-碳双键的可为脂族或脂环族的烃化合物的同一碳原子上除去两个氢原子或从具有1-20个碳原子(除非另有说明)和1-3个碳-碳双键的可为脂族或脂环族的烃化合物的两个不同碳原子上各自除去一个氢原子。
在一种实施方式中，Z为具有1-3个碳-碳三键的C1-20亚炔基(例如C1-15或C1-10亚炔基)。
本申请使用的术语“具有1-3个碳-碳三键的C1-20亚炔基”是指如下得到的二价部分：从具有1-20个碳原子(除非另有说明)和1-3个碳-碳三键的可为脂族或脂环族的烃化合物的同一碳原子上除去两个氢原子或从具有1-20个碳原子(除非另有说明)和1-3个碳-碳三键的可为脂族或脂环族的烃化合物的两个不同碳原子上各自除去一个氢原子。
Z基团可以任选地包含一个或多个胺、酰胺、醚、酯或硫酯连接基。
以上Z基团可以任选地由一个或多个杂原子和/或芳环(例如苯、吡啶或1,2,3-三唑)中断，所述芳环是任选取代的。
在一种实施方式中，Z包括亚烷基或亚烯基，其任选包含一个或多个胺、酰胺、醚、酯或硫酯连接基并且任选由一个或多个杂原子(例如O、S、N)和/或芳环(例如吡啶、苯、1,2,3-三唑)中断。
在一种实施方式中，Z包括三唑基团。
在一种实施方式中，Z包括酰胺连接基。
在一种实施方式中，Z为C1-20胺基团(例如C1-15或C1-10胺基团)。
在一种实施方式中，Z为C1-20酰胺基团(例如C1-15或C1-10酰胺基团)。
在一种实施方式中，Z为C1-20醚基团(例如C1-15或C1-10醚基团或C1-20、C1-15或C1-10聚醚基团)。
在一种实施方式中，Z为C1-20酯基团(例如C1-15或C1-10酯基团)。
在一种实施方式中，Z为C1-20硫醚基团(例如C1-15或C1-10硫醚基团或C1-20、C1-15或C1-10聚硫醚基团)。
在一种实施方式中，Z包含第一官能团A1，其将Z连接于X。
在一种实施方式中，A1选自：
-C6-10亚芳基；
-C5-10杂亚芳基；
-C(＝O)NH-；
-C(＝O)O-；
-NHC(＝O)-；
-OC(＝O)-；
-OC(＝O)O-；
-NHC(＝O)O-；
-OC(＝O)NH-；
-NHC(＝O)NH-；
-C(＝O)NHC(＝O)-；
-C(＝O)-。
在一种实施方式中，A1为C6-10亚芳基或C5-10杂亚芳基。
在一种实施方式中，A1为C5-10杂亚芳基。
在一种实施方式中，A1为通过CLICK化学得到的基团。
在一种实施方式中，A1为通过1,3-偶极环加成得到的基团。
在一种实施方式中，A1是1,2,3-三唑基团。例如，A1可以是具有下式的基团：
其中波浪线表示与Z的剩余部分的连接点，且星号*表示X所连接的碳。
这样的基团可以通过叠氮基团和炔基团之间的Huisgen环加成得到。
在一种实施方式中，Z包含第二官能团A2，其将Z连接于Sac1(当n为0时)或SacN(当n>0时)。
在一种实施方式中，A2选自
-C6-10亚芳基；
-C5-10杂亚芳基；
-RA2C(＝O)NH-；
-RA2C(＝O)O-；
-RA2NHC(＝O)-；
-RA2OC(＝O)-；
-RA2OC(＝O)O-；
-RA2NHC(＝O)O-；
-RA2OC(＝O)NH-；
-RA2NHC(＝O)NH-；
-RA2C(＝O)NHC(＝O)-；
-RA2C(＝O)-；
-RA2S-；
-RA2S-S-；或
-RA2＝N-NH-；
其中RA2为H或C1-6亚烷基。
在一种实施方式中，A2为-RA2NH(C＝O)-，且RA2为C1-6亚烷基。
在一种实施方式中，A2为-RA2NH(C＝O)-，且RA2为-CH2-、-C2H4-、-C3H6-或-C4H8-。
在一种实施方式中，A2为-RA2NH(C＝O)-，且RA2为-C3H6-。
在一种实施方式中，Z为具有下式的部分：
其中：
d为1至6；
e为1至6；和
波浪线表示与Sac1或SacN的连接点，且星号*表示X所连接的碳。
在一种实施方式中，d为3，且e为5。
核部分X是含唾液酸的识别基团Y所连接的基团。
在一种实施方式中，X为Y所连接的C1-30基团(例如C1-20基团或C1-15基团)。
在一种实施方式中，X为C1-30亚烷基(例如C1-20亚烷基或C1-15亚烷基)。
在一种实施方式中，X为C1-30亚烯基，该基团具有1-3个碳-碳双键(例如C1-20亚烯基或C1-15亚烯基)。
在一种实施方式中，X为C1-30亚炔基，该基团具有1-3个碳-碳三键(例如C1-20亚炔基或C1-15亚炔基)。
在一种实施方式中，X为C1-30胺基团(例如C1-20或C1-15胺基团)。
在一种实施方式中，X为C1-30酰胺基团(例如C1-20或C1-15酰胺基团)。
在一种实施方式中，X为C1-30醚基团(例如C1-20或C1-15醚基团或C1-30、C1-20或C1-15聚醚基团)。
在一种实施方式中，X为C1-30酯基团(例如C1-12或C1-15酯基团)。
在一种实施方式中，X为C1-30硫醚基团(例如C1-20或C1-15硫醚基团，或C1-30、C1-20或C1-15聚硫醚基团)。
以上X基团任选由一个或多个杂原子(例如O、S、N)、芳环(例如苯、吡啶或1,2,3-三唑)或其它官能团(例如-C(＝O)NH-；-C(＝O)O-；-NHC(＝O)-；-OC(＝O)-；-OC(＝O)O-；-NHC(＝O)O-；-OC(＝O)NH-；-NHC(＝O)NH-；-C(＝O)NHC(＝O)-；-C(＝O)-；-S-S-；或＝N-NH-)中断。
在优选的实施方式中，三个Y识别基团连接于核部分上的单个碳原子，如下式所示：
其中：
XL1、XL2和XL3是连接基团，且波浪线表示与X的剩余部分的连接点。
在一种实施方式中，XL1、XL2和XL3是RX1ORX2、RX1NHRX2或RX1SRX2，其中RX1是键或C1-6亚烷基，且RX2是键或C1-6亚烷基。
在一种实施方式中，三个Y识别基团连接(例如经由XL基团)于核部分的同一单个多价碳原子(“三脚架型核”)，且唾液酸部分的端基异构中心与所述单个碳原子相隔20至30个键长(例如22至25个键长)。
在一种实施方式中，三个Y识别基团连接于核部分上的单个碳原子，且唾液酸部分的端基异构中心与所述单个碳原子相隔1.5至3nm(例如2至2.5nm)。
在一种实施方式中，X是具有下式的部分：
其中：
XL1、XL2和XL3是连接基团；
f为1至6；
g为1至6；和
波浪线表示与L的连接点。
在一种实施方式中，f为4，且g为3。
在一种实施方式中，XL1、XL2和XL3为-CH2-O-CH2-或-CH2-S-CH2-。
在优选的实施方式中，X是具有下式的部分：
连接部分L包含将核部分X与纳米颗粒连接的官能团。
在一种实施方式中，L是结合于纳米颗粒的硫原子即S，即L是具有下式的部分：
其中波浪线表示与X的连接点，且星号*表示与纳米颗粒O的连接点。
在一种实施方式中，L源自1,2-二硫戊环。例如，在一种实施方式中，L是具有下式的部分：
其中波浪线表示与X的连接点，且星号*表示与纳米颗粒O的连接点。
例如，L可以源自硫辛酸(硫辛酸)或硫辛酸酰胺或其衍生物的1,2-二硫戊环基团。
在优选的实施方式中，缀合物具有式(I)：
其中：
O为纳米颗粒；和
GL为式(II)的糖缀合物配体化合物：
Y为式(III)的含唾液酸的识别基团：
其中n＝0，且Sia-Sac1共同形成唾液酸α2,6或α2,3半乳糖基部分，例如式(XXVII)或(XXVIII)的部分：
W为S；
R1、R4、RN1、R7、R8和R9为H；
RQ1为OR’；
RQ2、RQ3、RQ4和RQ6为OH；
RN2为C(＝O)RNN2；
其中n、RNN2、R’、Z、X和L如上定义。
在该优选的实施方式中优选的是，式(I)中的O是金纳米颗粒。
在该优选的实施方式中优选的是：
Z为式(XXI)的部分：
X为式(XXIII)的部分：
L为S；和
n、W、d、e、f、g、XL1、XL2和XL3如上定义。
在该优选的实施方式中优选的是，n为0。
在该优选的实施方式中优选的是，d为3，且e为5。
在该优选的实施方式中优选的是，f为5，且g为4。
在该优选的实施方式中优选的是，XL1、XL2和XL3为-CH2-O-CH2-。
在该优选的实施方式中优选的是，缀合物另外包含聚乙二醇，优选地，HB:PEG比例为25:75。
在优选的实施方式中，糖缀合物配体具有下式：
其中星号(*)表示X所连接的碳原子。
在优选的实施方式中，缀合物具有下式：
本发明也涉及可以连接于纳米颗粒以制备纳米颗粒探针的糖缀合物配体化合物及这样的化合物的前体。因此，在进一步的方面，本发明涉及具有下式的糖缀合物配体化合物：
其中：
X、Y和m如上定义。
在进一步的方面，本发明涉及具有下式的糖缀合物配体化合物：
其中：
X、Y和m如上定义；和
L*是用于将化合物与纳米颗粒连接的连接部分。
连接部分L*包含可将核部分X连接于纳米颗粒的官能团。
在一种实施方式中，L是硫醇基团(thiolgroup)(例如SH)。
除非另有说明，包括在上述中的是这些取代基的公知的离子形式、盐形式、溶剂化物形式和保护形式。例如，对羧酸(-COOH)的提及也包括其阴离子(羧酸根)形式(-COO-)、盐形式或溶剂化物形式及常见保护形式。类似地，对氨基的提及包括氨基的质子化形式(-N+HRaRb)、盐形式或溶剂化物形式例如盐酸盐及氨基的常见保护形式。类似地，对羟基的提及也包括其阴离子形式(-O-)、盐形式或溶剂化物形式及常见保护形式。
本申请所述的纳米颗粒探针构成本发明的一个方面，包含所述探针的试剂盒也构成本发明的一个方面。
本发明的糖缀合物可以使用本领域已知的常规方法制备或通过以常规方式调整本领域已知的常规方法制备。
具有S-糖苷键(W＝S)的含唾液酸的识别基团的合成如下所述。具有C-糖苷键(W＝C)的含唾液酸的识别基团可以使用例如下述文献中所述的方法制备：Glycoscience:ChemistryandChemicalBiology(例如标题为“C-Oligosaccharidesynthesis”的部分[31])和Sodeoka[32]。
其中RC4为-NRN4RN5的唾液酸部分的合成可以使用例如以下文献中描述的方法制备：Vonitzstein[33]。
其中RC2为P(＝O)(ORP1)(ORP2)的唾液酸部分的合成可以使用例如类似于以下文献中所述那些方法的方法制备：Stanley[34]。
在进一步的方面，本发明涉及制备上述糖缀合物的方法。
在一种实施方式中，制备糖缀合物的方法包括：
(i)通过将一个或多个单糖单元连接于唾液酸产生用于结合HA的含唾液酸的识别基团(Y)；
(ii)将三个或更多个含唾液酸的识别基团(Y)连接于包含连接部分(L)的核部分(X)。
本发明的探针可以如下提供：
(iii)将糖缀合物配体化合物经由连接部分(L)连接于纳米颗粒。
在一种实施方式中，产生基团Y的步骤包括以下步骤：使单糖单元与间隔基部分(Z)反应。
在一种实施方式中，步骤(i)涉及在唾液酸与一个或多个单糖单元中的一个之间形成α-2,3糖苷键。
在一种实施方式中，步骤(i)涉及在唾液酸与一个或多个单糖单元中的一个之间形成α-2,6糖苷键。
在一种实施方式中，将三个或更多个糖缀合物配体连接于核部分的步骤包括进行1,3偶极环加成。
在一种实施方式中，1,3偶极环加成涉及炔丙基醚部分和叠氮部分的环加成。
仅为了方便而在本申请中引入任何子标题，而不应将其理解为以任何方式限制本申请所公开的内容。
现在将参考以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。本领域技术人员鉴于这些可以想到本发明的其它实施方式。
本申请引用的所有参考文献的公开内容由于其可以由本领域技术人员用来实施本发明，而特别通过交叉引用并入本申请。
在整个说明书中，包括所附权利要求，除非上下文另有要求，否则措辞“包括”及其时态变化应理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的集合，而不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的集合。
必须注意，当在说明书和所附权利要求中使用时，除非上下文明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“这个”包括复数指代物。因此，例如对“药物载体”的提及包括两种或更多种这样的载体的混合物等。
范围通常在本申请表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一种实施方式包括从该一个特定值和/或至该另一个特定值。类似地，当通过在数值前使用“约”而将数值表示为近似值时，应该理解的是该特定值形成另一种实施方式。
本申请公开内容包括可以用于理解本发明的信息。但这并非承认本申请提供的任何信息是现有技术或与要求保护的本发明有关系，也并非承认明示或暗示参考的任何公开物是现有技术。
应该知道，本发明的某些特征是为了清楚而在分开的实施方式中进行描述，它们也可以在单个实施方式中以组合的方式出现。相反，本发明的多种特征是为了简要而在单个实施方式中进行描述，它们也可以单独出现或以任何适当的子组合形式出现。关于以上定义的化学基团的实施方式的所有组合是本发明明确包含的并且是本申请所公开的，就如同每个组合是单独和明确公开的，在这个意义上这样的组合包括为稳定糖缀合物(即可以分离、表征和测试其生物活性)的糖缀合物。另外，描述这些变量的实施方式中所列出的化学基团的所有子组合也是本发明明确包含的并且是本申请所公开的，就如同化学基团的每个这样的子组合是本申请单独和明确公开的。
附图说明
图1.在流感病毒存在下糖纳米颗粒的聚集的示意图。金纳米颗粒表面上的三价配体1结合于病毒表面上的血凝素，这诱导的聚集。
图2.a)在加入流感病毒X31(2.55μg/mL)之后240分钟测得的用以下物质官能化的金纳米颗粒的紫外-可见光消光光谱：仅柠檬酸盐(――)和下述比例的三价配体1:PEG：2:98(······)、5:95(―·―)、10:90(―··―)、25:75(―)和50:50(---)。在添加浓度增加的纯化流感病毒X31(0(黑色)-3.0(深灰色)μg/mL)之后，用以下物质官能化的金纳米颗粒的紫外-可见光消光光谱的变化：b)三价配体1:PEG(25:75)、c)一价配体3:PEG(25:75)和d)PEG；在添加病毒之后30分钟进行测量。
图3.以下样品的紫外-可见光谱：a)在添加体积增加的流感AFX31(H3N2)(0(黑色)-43.1(深灰色)μL)之后，三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒，插图：在添加AFX31(43.1μL)之前(左边)和之后(右边)，包含三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的比色皿；和b)在添加浓度增加的禽流感病毒RG14(H5N1)(0(黑色)-3.1(深灰色)μg/mL)之后，三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒。
图4.三价配体1:PEG官能化的金纳米颗粒的示意图：用三价配体1和PEG配体2官能化的金纳米颗粒。
图5.一价配体3:PEG官能化的金纳米颗粒的示意图：用一价配体3和PEG配体2官能化的金纳米颗粒。
图6.a)三价配体1:PEG(50:50)官能化的金纳米颗粒的样品的透射电镜(TEM)(比例尺表示100nm)，和b)三价配体1:PEG(50:50)官能化的金纳米颗粒的粒度分布，其中位值为16.4±1.6nm(n＝116nm)。
图7.优化的三价配体1:PEG官能化比例。在添加病毒X31(2.55μg/mL)之前(黑色)及之后0分钟、15分钟、30分钟、60分钟和240分钟(深灰色)，不同官能化的金纳米颗粒的样品的紫外-可见光谱。不同的稳定化的金纳米颗粒是：a)柠檬酸盐包覆的金纳米颗粒及b)-f)三价配体1:PEG官能化的金纳米颗粒，其中三价配体1:PEG比例为：b)2:98、c)5:95、d)10:90、e)25:75和f)50:50。
图8.优化的一价配体3:PEG官能化比例。在添加病毒X31(2.55μg/mL)之前(黑色)及之后0分钟、15分钟、30分钟、60分钟和240分钟(深灰色)，不同官能化的金纳米颗粒的样品的紫外-可见光谱。不同的官能化的金纳米颗粒是具有以下一价配体3:PEG比例的一价配体3:PEG官能化的金纳米颗粒：a)2:98、b)5:95、c)10:90、d)25:75和e)50:50。
图9.三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒、一价配体3:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒和PEG官能化的金纳米颗粒的比较。a)随着病毒X31浓度不同，以下样品在525nm的消光强度：三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒(▲)、一价配体3:PEG官能化的金纳米颗粒(●)和PEG官能化的金纳米颗粒(■)；和b)包含三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒与不同浓度的病毒X31的比色皿。在添加病毒之后30分钟测量消光强度。
图10.PEG官能化的金纳米颗粒的示意图：用PEG配体2官能化的金纳米颗粒。
图11.稀释效应对照。a)随着Tri缓冲液体积不同(0(黑色)-47.1(深灰色)μL)，三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的紫外-可见光谱的变化；和b)随着来自尿囊液的X31病毒体积不同(■)及随着Tris缓冲液体积不同(●)，三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒在525nm的消光强度。在添加病毒之后30分钟测量消光强度。
图12.以下样品的紫外-可见光谱：a)在添加浓度增加的(0(黑色)-6.8(深灰色)μg/mL)的RG14(H5N1)之后，三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒(在添加每种病毒浓度之后30分钟测量紫外-可见光谱)；和b)在添加禽流感病毒RG14(H5N1)(······)和人流感病毒X31(H3N2)(---)(6.8μg/mL)之前(―)和之后6天，三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒。
实施例
实施例1-呈递三价α2,6-硫连接的唾液酸的糖纳米颗粒可以在简单的比色测定中 在30分钟内检测出人流感毒株。
在流感病毒存在下糖纳米颗粒的聚集的示意图在图1中图示。
用三价配体1官能化的金纳米颗粒和用一价α-硫连接的唾液酸(一价配体3，图5)官能化的金纳米颗粒之间的比较证实了三价配体1对于检测人流感病毒提供了显著较好的结果。
为显示三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒对于未纯化样品的效用，将该颗粒用于检测来自临床相关浓度的尿囊液(AF)的X31病毒。重要的是，α2,6-结合的三价唾液酸糖纳米颗粒表现出与禽流感病毒相比可特异性检测人流感病毒。
方案1.合成三价唾液酸衍生物(三价配体1)。试剂和条件：a)10％Pd-C，EtOAc；b)叠氮基己酸NHS酯，Et3N，CH2Cl2；c)NaOMe-MeOH；d)TBDMS-Cl/DMF；e)Ac2O/Pyr；f)10％TFA在80％AcOH水溶液中；g)Tf2O/Pyr；h)Et2NH/DMF；i)NaOMe/MeOH；j)CuSO4-NaAsc-tBuOH/H2O1:1；k)1MNaOH水溶液；l)80％TFA水溶液；和m)γ-硫代丁内酯/DTT/0.5MNaHCO3水溶液/EtOH1.5:1。
流感病毒HA的结晶结构的分析表明在HA三聚物络合物内的HA单体的糖类结合位点之间存在约4nm的距离[8，16]。为向3个HA结合位点呈递3个配体而又不会向系统引入应力，要求在唾液酸端基异构中心和三脚架型核的中部之间具有约2-2.5nm(22-25个键长)的极限长度。基于这些距离考量，三价配体1按照方案1中的概述合成。为有助于稍后配体呈递的最优化，设计基于偶极环加成点击化学的模块化合成方法[17]，使其能够修改极限长度、组成和刚性。二价唾液酸的有关合成方法之前已经由Kale等人报告[18]。简言之，将已知的叠氮基丙基半乳糖苷4还原并用已知的6-叠氮基己酸NHS酯将其酰化[19]。用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)醚5处理保护基团，得到不稳定的三氟甲磺酸酯6，将其直接与已知的唾液酸硫代乙酸酯7[20]反应，从而得到化学和生物学稳定的硫糖苷[21]。使所得α2,6-硫连接的唾液酸衍生物8与三炔丙基醚9进行CuI-催化的1,3-偶极环加成[17a，22]，所述三炔丙基醚9通过已知N-Boc-三-O-炔丙基-三羟基甲基氨基甲烷的标准转化法制备[23]。三价化合物10的整体脱保护及所得伯胺与硫代丁内酯的最终衍生化得到用于在金纳米颗粒上固定的三价α2,6-硫连接的唾液酸(三价配体1)。
方案2.合成一价配体3。试剂和条件：a)碘乙酸酐，Et2O；b)1.NaOMe/MeOH，-40℃。2.AmberliteIR-120(H+)，-40℃；c)12，DIPEA，DCM；d)NaOMe/MeOH，r.t.；e)1.1MNaOH，r.t.；f)TFA，DCM，r.t.；g)γ-硫代丁内酯，NaHCO3水溶液/EtOH.DTT，50℃。
一价配体3的合成在方案2中详细讨论。一价配体3的烷基硫糖苷的脂族侧链由N-Boc-2,2’-(乙二氧基)二(乙胺)(11)开始进行合成，该化合物11由相应的二胺按照公开的过程制备[25]。然后使单-N-Boc-保护的二胺11与碘乙酸酐反应，以70％收率得到相应的碘乙酰胺12。化合物12然后用于形成硫糖苷15。一价配体3的合成以已知的α-硫代乙酸酯13开始[26,27]。之后在低温Zemplén条件下的化学选择性脱-S-乙酰化然后通过酸性(H+)树脂进行低温淬灭生成α-构型的Neu5Ac硫醇14[27,28]，该硫醇14直接用于下一步骤。在Hunig’s碱存在下在二氯甲烷中用碘乙酰胺12将硫醇14烷基化[29]经历2步以65％的收率得到硫糖苷15。整体脱保护[29]及之后游离胺与γ-硫代丁内酯在缓冲的(pH～9.0)乙醇溶液中的反应[30]得到3的钠盐，将其酸化得到所需的烷基一价配体3，经历4步，收率为84％。从唾液酸开始，在10个合成步骤中以34％的总收率制备所需一价配体3。
金纳米颗粒(直径为约16nm)的合成通过使用柠檬酸盐同时作为金核的还原剂和稳定剂实现[24]。柠檬酸盐还原的金纳米颗粒用由硫醇化的三价α2,6-连接的唾液酸(三价配体1)和硫醇化的聚乙二醇衍生物(PEG配体2)构成的混合单层(图4)官能化。
为确定流感病毒与金纳米颗粒表面上的三价配体1的结合是否受配体密度的影响，使用不同比例的三价配体1:PEG(50:50、25:75、10:90、5:95和2:98)将颗粒官能化。官能化的金纳米颗粒的TEM图像显示平均粒度为16.4±1.6nm的分散的纳米颗粒(图6)。具有不同配体密度的纳米颗粒溶液的颜色均为深红色并且显示出在约525nm的表面等离子体吸收带。与对柠檬酸盐包覆的纳米颗粒所观察到的相比，表面等离子体吸收带红移约5nm，这是由于单层在金表面上的组装。将人流感病毒X31(2.55μg/mL)添加到各种三价配体1:PEG官能化的金纳米颗粒中。柠檬酸盐包覆的金纳米颗粒用作对照。在添加病毒之前和之后的0分钟、15分钟、30分钟、60分钟和240分钟测量各样品的紫外-可见光消光光谱(图7)。当将用比例25:75的三价配体1:PEG官能化的纳米颗粒与人流感病毒X31相互作用240分钟时，观察到表面等离子体吸收带的最大变化(图2a)。图2a中的紫外-可见光谱强调了25:75比例三价配体1:PEG金纳米颗粒的表面等离子体吸收带变宽，这表明与流感病毒的显著相互作用。使用不同比例的一价配体3:PEG配体2(50:50、25:75、10:90、5:95和2:98)官能化的金纳米颗粒进行相同的实验。所得结果表明25:75比例的一价配体3:PEG也是优化的配体密度(图8)。
优化的糖纳米颗粒用于比色法检测浓度增加的X31流感病毒。如图2b所示，在添加人流感病毒X31之后，表面等离子体吸收带红移(从525nm移至536nm)并随着病毒浓度增加而强度降低(图2b和图9a)。结果表明流感病毒诱导糖纳米颗粒的聚集，如图1图示。在添加浓度增加的病毒之后30分钟，光谱法测量优化的糖纳米颗粒的聚集。由于添加病毒带来的表面等离子体吸收带的变化导致溶液颜色改变，从最初的深红色变为较浅的红色(图9b)。比较三价配体1:PEG(25:75)和一价配体3:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒与人流感病毒X31的结合亲和力。将人流感病毒X31添加到一价配体3:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的溶液中使表面等离子体吸收带强度产生小的降低和红移(从525nm移至534nm)且在约620nm的消光增加(图2c和图9a)。这些结果表明纳米颗粒的聚集开始。但是，当一价配体3用于产生与对三价配体1:PEG官能化的金纳米颗粒观察到的相同的消光光谱的变化时，需要显著较大浓度的病毒。在添加浓度增加的流感病毒X31之后，仅用PEG配体2官能化的金纳米颗粒(图10)的对照实验使消光光谱产生的变化可忽略(图2d和图9a)。这些结果强调了与一价唾液酸配体3:PEG官能化的颗粒相比，三价唾液酸配体1:PEG糖纳米颗粒对人流感病毒X31的亲和力增加。而且，对照实验表明唾液酸衍生物的存在对于使糖纳米颗粒经由HA结合位点结合于病毒从而有助于病毒的比色测定是必要的。
为模拟具有未知浓度和纯度的临床样品，来自流感尿囊液(AF)的人流感病毒X31的比色测定使用三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒来进行。将体积增加的X31流感AF添加到官能化的金纳米颗粒的样品中诱导优化的糖纳米颗粒的聚集。在增加X31流感AF的体积之后，观察到表面等离子体吸收带在约525nm的消光强度降低及溶液颜色由深红色变为无色(图3a)。将体积增加的Tris缓冲液添加到三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的对照实验证实了观察到的变化是由于存在X31AF而不是由于稀释效应(图11)。
合成α2,6-构型的三价唾液酸官能化的金纳米颗粒的主要目的是为了创造可区分人流感病毒和禽流感病毒的传感器。合成包含三个α2,6-硫连接的唾液酸的三价配体1。人流感病毒优先结合于α2,6残基，而禽流感病毒优先结合于α2,3残基[14]。因此，在禽流感病毒存在下，优化的糖纳米颗粒不应该聚集。将来自禽流感病毒A/Vietnam/1194/2004(H5N1)的具有HA和NA基因的重配株流感病毒RG14以增加的浓度(0-3.1μg/mL)添加到三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的溶液中。在添加病毒之后30分钟监测表面等离子体吸收带的变化。如图3b所示，在添加3.1μg/mL禽流感病毒RG14之后，观察到官能化的金纳米颗粒的表面等离子体吸收带没有任何变化。在类似浓度的人流感病毒X31存在下，官能化的金纳米颗粒的表面等离子体吸收带的光谱特性在糖纳米颗粒结合和聚集之后发生显著变化(图2b)。为进一步证明合成的糖纳米颗粒特异性结合于人流感病毒，将禽流感病毒RG14在官能化的金纳米颗粒的溶液中的浓度增至6.8μg/mL。观察到颗粒的表面等离子体吸收带的变化可忽略(图12a)。将禽流感病毒与纳米颗粒培养6天时间，之后测量颗粒的紫外-可见光消光光谱。仅可观察到消光强度有小的降低(图12b-参见点状线[······])，与由存在相同浓度的人流感病毒X31且培养相同时间所引起的表面等离子体吸收带的变化(图12b-参见短划线[---])相比。从这些结果显然看出所设计的三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒能够容易地区分人流感病毒毒株和禽流感病毒毒株。
总之，发明人已经实现合成硫醇化的三价α2,6-硫连接的唾液酸衍生物以将金纳米颗粒官能化。由硫醇化的三价α2,6-硫连接的唾液酸衍生物和硫醇化的PEG衍生物构成的优化的糖纳米颗粒按25:75的比例自组装到金表面上。这些糖纳米颗粒用于流感病毒的等离子体检测。三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒用于在30分钟内检测人流感病毒X31(H3N2)。尿囊液中未纯化的流感病毒由官能化的纳米颗粒成功检测。三价和一价α2,6-硫连接的唾液酸官能化的纳米颗粒之间的比较证实使用三价配体实现了较快速得到结果且以较大灵敏度来检测X31病毒。重要的是，三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒能够区分人流感病毒(α2,6结合)和禽流感病毒(α2,3结合)。由于人流感病毒的优势毒株随季节变化，且由于不同动物种类之间流感病毒可能存在威胁及由此引发大流行病的潜在可能性，因而区分人流感病毒毒株和禽流感病毒毒株的能力是非常重要的。合成三价α2,6-硫连接的唾液酸衍生物以将金纳米颗粒官能化提供了对于临床样品中流感病毒毒株的特异性识别和检测的新型生物测定法。
说明书和实施例1的参考文献：
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实施例2-合成三价配体1、PEG配体2和一价配体3
合成三价配体1、PEG配体2和一价配体3
通用方法
商业试剂得自Acros、Aldrich、AlfaAesar和Fluka且无需进一步纯化即使用。N-Boc氨基戊酸(戊酸)购自SigmaAldrich。TLC在包含荧光指示剂的预制硅胶板(Merck60F254，0.25mm)上进行。将化合物在UV(254nm)下和通过以下步骤可视化：将TLC板浸到5％H2SO4在乙醇中的溶液、茚三酮(200mg)在丁醇(95mL)和乙酸(10％，5mL)中的溶液或用硫酸铈(IV)饱和的15％硫酸水溶液中后加热。凝胶色谱法在TSKHW40S凝胶上使用XK16/40柱进行。快速柱色谱法在硅胶(BiotageKP-SIL60A，40–63μm)上进行。标准柱色谱法在硅胶(Fluka60，63-200μm)上进行。在Bruker波谱仪上记录NMR波谱：在400MHz记录的1HNMR波谱对于CDCl3以δH7.26为基准或对于CD3OD以δH3.34为基准；在100MHz记录的13CNMR波谱对于CDCl3以δC77.0为基准或对于CD3OD以δC49.05为基准。相对于内部丙酮分别在δH2.22ppm和δC30.89ppm的甲基共振报告在D2O中记录的NMR信号的化学位移。借助于COSY和HSQC实验进行指认归属。13CNMR波谱中的多重信号由HSQC波谱确定。
合成3-氨基丙基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳吡喃糖苷
将3-叠氮基丙基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳吡喃糖苷4[1](6.5g，15.1mmol)和10％Pd-C(200mg)在乙酸乙酯(EtOAc，50mL)中在氢气气氛下搅拌6小时，此时的TLC显示完全转化为移动较慢的产物(Rf＝0.1，二氯甲烷/甲醇3:1)。通过使混悬液过滤通过硅藻土滤层除去催化剂，用乙酸乙酯洗涤，将合并的滤液真空浓缩，得到无色油状物。将残留物在硅胶上进行柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，分段梯度为10:1、5:1)，得到相应的氨基丙基糖苷(5.8g，95％)。1HNMR(CDCl3):δ＝6.04(bt,1H,NH),5.41(dd,1H,H4,3J3,4＝3.4Hz,3J4,5＝1.1Hz),5.20(dd,1H,H2,3J1,2＝7.9Hz,3J2,3＝10.4Hz),5.04(dd,1H,H3,3J2,3＝10.4Hz,3J3,4＝3.4Hz),4.45(d,1H,H1,3J1,2＝7.9Hz),4.08-4.22(m,2H,H6),4.00(m,1H,Ha),3.92(m,1H,H5,3J4,5＝1.1Hz,3J5,6＝6.6Hz),3.58(m,1H,Ha),3.47-3.38(m,1H,Hc),3.34-3.20(m,1H,Hc),2.17,2.08,2.06,1.99(4s,12H,CH3CO),1.92-1.72(m,2H,Hb)；13CNMR(CDCl3)fromHSQC:δ＝102.2(d,1C,H1),70.9,(d,1C,C5),70.6(d,1C,C3),69.2(t,1C,Ca),68.8(d,1C,C2),66.9(d,1C,C4),61.2(t,1C,C6),37.7(t,1C,Cc),29.1(t,1C,Cb),20.7(4xq,3C,4xCH3CO-)；m/z(MALDI+)405.90[M+H]+；HR-MS，对于C17H28NO10 +[M+H]+，计算值为406.1708，实测值为406.1707。
合成3-(N-叠氮基戊基氧基羰基)氨基丙基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳吡喃糖苷
向3-氨基丙基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳吡喃糖苷(5.5g，13.5mmol)和6-叠氮基己酸NHS酯[2](3.4g，13.5mmol)在无水二氯甲烷(CH2Cl2，50mL)中的溶液中添加三乙胺(Et3N，4.1mL，30mmol)，将反应混合物在室温搅拌3小时，此时的TLC显示反应完全(产物Rf＝0.6，乙酸乙酯)。真空除去溶剂，将所得残留物通过硅胶柱色谱法(分段梯度，乙酸乙酯/己烷50:50、100:0)纯化，得到相应的酰胺(5.0g，68％)，其为糖浆状物。1HNMR(CDCl3):δ＝5.94(s,1H,NH),5.41(d,J3,4＝3.5Hz,1H,H-4),5.20(dd,J1,2＝8.0Hz,J2,3＝10.5Hz,1H,H-2),5.04(dd,J2,3＝10.5Hz,J3,4＝3.5Hz,1H,H-3),4.45(d,J1,2＝8.0Hz,1H,H-1),4.16(m,2H,H6a,H6b),4.00(m,1H,OCHHCH2CH2NH-),3.92(t,J6.6Hz,1H,H-5),3.58(m,1H,H-OCHHCH2CH2NH-),3.45(m,1H,OCH2CH2CHHNH-),3.28(m,3H,OCH2CH2CHHNH,NHCO(CH2)4CH2N3),2.21(m,2H,NHCOCH2(CH2)4N3),2.17,2.08,2.06,2.00(4s,each3H,4xCOCH3),1.78(m,2H,OCH2CH2CH2NH-),1.51(m,4H,NHCOCH2CH2(CH2)3N3,NHCO(CH2)3CH2CH2N3),1.43(m,2H,NHCO(CH2)2CH2(CH2)2N3)；13CNMR(CDCl3):δ＝172.84,170.39,170.19,170.08,169.93(CO.(CH2)5N3,4xCOCH3),101.42(C-1),70.82(C-3),70.64(C-5),69.32(C-2),68.92(C-4),66.98(OCH2(CH2)2NH-),61.20(C-6),51.29(NHCO(CH2)4CH2N3),37.55(NHCOCH2(CH2)4N3),36.24(O(CH2)2CH2NH-),29.30,28.63,26.41,25.22(OCH2CH2CH2NH-,NHCOCH2CH2CH2CH2CH2N3),20.83,20.68,20.57(4xCOCH3)；m/z(MALDI+)567.14[M+Na]+；HR-MS，对于C23H36N4NaO11 +[M+Na]+，计算值为567.2273，实测值为567.2262。
合成3-(N-叠氮基戊基氧基羰基)氨基丙基2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-半乳吡喃糖苷(5)
向3-(N-叠氮基戊基氧基羰基)氨基丙基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳吡喃糖苷(3.0g，5.5mmol)在无水甲醇(20mL)中的溶液中添加1M甲醇钠-甲醇(NaOMe-MeOH，0.25mL)，将反应在室温搅拌1小时。然后将混合物用AmberliteIR120(H+)树脂中和，将溶液过滤，将滤液真空浓缩至胶状物。TLC(乙酸乙酯)表明不存在起始原料。将残留物吸收在二甲基甲酰胺(DMF，10mL)中，将溶液冷却至0℃，加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMS-Cl，1.1g，7.5mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时，然后真空除去DMF。将残留的油状物吸收在吡啶(Pyr，10mL)和乙酸酐(Ac2O，10mL)的混合物中，将反应混合物在室温搅拌过夜。然后真空除去溶剂，将所得残留物吸收在CH2Cl2(50mL)中，用水洗涤，将有机萃取物干燥(MgSO4)并真空浓缩，得到乙酰化的TBDMS醚[Rf＝0.6(乙酸乙酯/己烷3:1)]。将该物质溶解于10％三氟乙酸(TFA)在80％乙酸水溶液(AcOH水溶液)混合物(10mL)中的溶液，使其在室温静置1小时，直到TLC显示起始原料完全消失(产物TLC：Rf＝0.3，乙酸乙酯)，真空除去溶剂。使残留物在硅胶上进行柱色谱法(乙酸乙酯/己烷，分段梯度为5:1、3:1、1:0)，得到糖浆状物的伯醇5(1.8g，65％，经历4步)。1HNMR(CDCl3):δ＝6.12(bs,1H,NH),5.26(dd,1H,H2,3J1,2＝7.9Hz,3J2,3＝10.3Hz),4.97(dd,1H,H3,3J2,3＝10.3Hz,3J3,4＝3.2Hz),4.43(d,1H,H1,3J1,2＝7.9Hz),4.3(m,2H,H6),4.06(d,1H,H4,3J3,4＝3.2Hz),3.98(m,1H,Ha),3.66-3.53(m,1H,Ha),3.49-3.29(m,2H,Hc),3.28(t,2H,Hi,3Jh,i＝6.8Hz),2.22(t,2H,He,3Je,f＝7.5Hz),2.09,2.07,2.05(3s,9H,CH3C(O)),1.86-1.73(m,2H,Hb),1.71-1.59(m,4H,Hf,Hh),1.45-1.37(m,2H,Hg)；13CNMR(CDCl3):δ＝173.2,170.9,171.1,171.0(4xs,4C,3xCH3CO-,Cd),101.2(d,1C,H1),72.9(d,1C,C3),69.1(dt,3C,C2,Ca),61.9(t,1C,C6),51.1(t,1C,Ci),37.6(t,1C,Cc),36.2(t,1C,Ce),29.1(t,1C,Cb),28.4(t,1C,Cf),26.3(t,1C,Cg),25.2(t,1C,Ch),20.8(3xq,3C,3xCH3C(O))；m/z(MALDI+)525.01[M+Na]+；HR-MS，对于C21H34N4NaO10 +[M+Na]+，计算值为525.2167，实测值为525.2163。
合成3-(N-叠氮基戊基氧基羰基)氨基丙基2,3,4-三-O-乙酰基-6-O-三氟甲磺酰基-β-D-半乳吡喃糖苷(6)
在0℃在氮气下向伯醇5(0.2g，0.4mmol)在无水CH2Cl2(10mL)中的搅拌溶液中加入吡啶(126μL，1.5mmol)，然后加入三氟甲磺酸酐(Tf2O，140μL，1mmol)。当TLC现实完全转化为产物(Rf＝0.7，乙酸乙酯)时，将反应化合物在0℃搅拌30分钟。加入CH2Cl2(25mL)，将有机溶液用1MHCl(25mL)洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩至约10mL。将所得溶液施加到硅胶柱(1cm×2cm)，将产物用乙酸乙酯彻底洗涤。将洗脱的级分与DMF(2mL)混合，真空除去乙酸乙酯，留下在DMF溶液中的产物6，留待后使。[NB-三氟甲磺酸酯6在浓缩至干时迅速分解]。
合成3-(N-叠氮基戊基氧基羰基)氨基丙基S-(5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖甲酯)-(2-6)-6-脱氧-6-硫-β-D-半乳吡喃糖苷(3-(N-azidopentyloxycarbonyl)aminopropylS-(methyl5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosylonate)-(2-6)-6-deoxyl-6-硫-β-D-galactopyranoside)(8)
在0℃在氮气下向已知的预-N,O-乙酰化的唾液酸硫代乙酸酯7[3](0.15g，0.3mmol)在DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加二乙胺(Et2NH，0.5mL，19mmol)。15分钟之后，在0℃添加三氟甲磺酸酯6在DMF中的溶液(参见上文)，将反应混合物搅拌2小时。然后真空除去DMF，将所得残留物吸收在CH2Cl2(25mL)中，用水洗涤，干燥(MgSO4)，浓缩至干。使残留物进行在硅胶上的柱色谱法(分段梯度，乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇95:5)，得到玻璃状物的乙酰化的硫糖苷中间体。Rf＝0.3(乙酸乙酯/甲醇95:5)；
m/z(MALDI+)1014.31[M+Na]+，对于C41H61N5NaO21S[M+Na]+计算值＝1014.36。向乙酰化的中间体(0.12g，120μmol)在无水甲醇(2mL)中的溶液中添加1M甲醇钠-甲醇(50μL)，将反应在室温搅拌1小时。将反应混合物用AmberliteIR120(H+)树脂中和，将溶液过滤，将滤液真空浓缩为固体。将该物质通过TSK凝胶色谱法(水，流速0.5mL/min)纯化，得到作为白色固体的脱-O-乙酰化的叠氮化物8(40mg，25％，经历3步)。1HNMR(D2O):δ＝4.27(d,1H,H1’,3J1,2＝7.9Hz),3.89(d,1H,H4’,3J3’,4’＝3.4Hz,3J4’,5’＝1.1Hz),4.84-3.60(m,7H,H4,H6’,H7,H8,Ha),3.81(s,3H,CH3CO),3.54(dd,2H,H3’,3J2’,3’＝10.0Hz,3J3’,4’＝3.4Hz),3.48(dd,1H,H5’,3J4’,5’＝1.1Hz,3J5’,6’＝8.7Hz),3.40(dd,1H,H2’,3J1’,2’＝7.9Hz,3J2’,3’＝10.0Hz),3.26(t,2H,Hi,3Jh,i＝6.8Hz),3.21(m,2H,Hc),3.0-2.83(m,2H,H9),2.76(dd,2H,H3eq,2J3ax,3eq＝12.8Hz,3J3eq,4＝4.7Hz),2.22(t,2H,He,3Je,f＝7.3Hz),1.96(s,3H,CH3CO.NH),1.80(m,1H,H3ax),1.70(m,2H,Hb),1.59-1.44(m,4H,Hf,Hh),1.42-1.26(m,2H,Hg)；13CNMR(D2O):δ＝176.8,174.9,171.0(3s,4C,CH3C(O)O,C2,CH3C(O)NH),Cd),102.8(d,1C,H1’),75.0,73.8(dd,2C,C7,C8),72.8(d,1C,C3’),70.4(d,1C,C2’),68.9(d,1C,C2,C4’),68.0(d,1C,C5’),67.7(t,1C,Ca),67.5(d,1C,C4),63.0(t,1C,C6’),51.5(q,1C,CH3C(O)O),51.1(t,1C,Ci),39.9(t,1C,C3),36.1(t,1C,Cc),35.6(t,1C,Ce),29.0(t,1C,C9),28.4(t,1C,Cb),27.6(t,1C,Cf),25.3(t,1C,Cg),24.9(t,1C,Ch),21.9(q,1C,CH3CONH)；m/z(MALDI+)720.16[M+Na]+，HR-MS，对于C27H47N5NaO14S[M+Na]+，计算值为720.2737，实测值为720.2740。
合成N-(叔丁基氧基羰基)-N-(丁酰基)三[(炔丙氧基)甲基]氨基甲烷(9)
将已知的三-O-炔丙基-三羟基甲基氨基甲烷[4](0.15g，0.5mmol)溶解于80％三氟乙酸水溶液(1mL)中，使溶液在室温静置15分钟，然后真空除去溶剂。将残留物先与乙醇、然后与甲苯共蒸发，得到黄色油状物(0.1g)。将该油状物吸收在无水DMF(0.5mL)中，将其添加到商购N-Boc氨基戊酸(86mg，0.4mmol)、HATU(2-(1H-7-偶氮苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)(0.2g，0.5mmol)、N-甲基吗啉(0.1g，1mmol)在DMF(1mL)中的混合物中。将反应混合物在室温搅拌过夜，真空除去DMF，将所得残留物吸收在CH2Cl2(25mL)中，用水洗涤，干燥(MgSO4)，浓缩至干。将残留物通过在硅胶上的柱色谱法(分段梯度，乙酸乙酯/己烷5:95、25:75、40:60)纯化，得到糖浆状物的化合物9(0.14g，78％)。Rf0.7(乙酸乙酯/己烷1:1)。1HNMR(CDCl3):δ＝5.71(brs,1H,NH),4.65(brs,1H,NH),4.15(s,6H,3xOCH2CΞCH),3.84(s,6H,NHC(CH2O)3-),3.13(m,2H,NHCH2-),2.44(s,3H,3xOCH2CΞCH),2.19(t,JHH＝7.2Hz,2H,-CH2CONH-),1.65(m,2H,-NHCH2CH2CH2-),1.52(m,2H,-NHCH2CH2CH2-),1.48(s,9H,3xCCH3)；m/z(MALDI+)435.04[M+H]+；HR-MS，对于C23H35N2O6 +[M+H]+，计算值为435.2490，实测值为435.2490。
合成N-Boc-保护的三价甲酯(10)
向叠氮化物8(10mg，14μmol)和三炔丙基醚9(2mg，4.6μmol)在叔丁醇/水1:1混合物(tBuOH/H2O，2mL)中的搅拌溶液中添加1M硫酸亚铜(CuSO4，1μL，1μmol)和1M抗坏血酸钠(NaAsc，2μL，2μmol)的预混合水溶液。将反应混合物在50℃搅拌2小时，真空除去溶剂。将所得残留物吸收在水(0.5mL)中，使其过滤通过0.2μm注射器式过滤器，将溶液施加于TSK凝胶柱(水，0.5mL/min)。得到为白色固体的三点击的产物10(5mg，43％)。1HNMR(600MHz；D2O):δ＝7.63(s,3H,CHNN),4.09(t,6H,Hi,3Jh,i＝6.7Hz),3.99(d,3H,H1’,3J1’,2’＝7.9Hz),3.64(d,3H,H4’,3J3’,4’＝3.4Hz),3.60-3.30(m,21H,H4,H7,H8,H6’,Ha),3.54(s,9H,CH3CO-),3.29(dd,6H,H3’,3J2’,3’＝9.8Hz,3J3,4＝3.4Hz),3.23(d,3H,H6,3J6,7＝9.0Hz),3.16(dd,3H,H2’,3J1’,2’＝7.9Hz,3J2’,3,’＝9.8Hz),2.94(m,6H,Hc),2.6-2.7(m,6H,H9),2.67(t,2H,Ht,3Js,t＝6.7Hz),2.48(dd,6H,H3eq,2J3e,3a＝12.8Hz,3J3e,4＝4.5Hz),1.89(t,6H,He,3Je,f＝6.7Hz),1.85(t,2H,Hq,3Js,t＝7.2Hz),1.71(s,3H,CH3CO-),1.56-1.53(2xm,9H,H3ax,Hh),1.55(m,3H),1.47(m,6H,Hb),1.28(m,6H,Hf),1.17(m,2H,Hq),1.07(m,2H,Hs),1.07(m,6H,Hg)；13CNMR(D2O):δ＝176.4,174.9,174.0,171.0(4xs,8C,CH3CO-,Cd,Cp,Cu),143.9(s,3C,Ck),124.8(d,3C,Cj),102.9(d,3C,C1’),94.0(s,3C,C2),83.1(s,1C,Cv),73.7(d,3C,C7orC8),72.7(d,3C,C3’),70.9(d,3C,C4),70.4(d,3C,C2’),69.0(2xd,6C,C2,C4’),68.1(d,3C,C6),67.7(t,3C,Ca),67.6(d,3C,C8orC7),59.6(2xt,6C,C6’,Cl),53.6(q,3C,CH3C(O)O),50.2(t,3C,Ci),40.0(t,3C,C3),39.4(t,1C,Ht),36.1(t,3C,Cc),35.7(t,1C,Cq),35.5(t,3C,Ce),29.1(2xt,6C,C9,Ch),28.4(2xt,4C,Cb,Cs),25.0(t,3C,Cg),24.7(t,3C,Cf),22.0(t,1C,Cr)；
m/z(MALDI+)2591.19[M+Cu]+，对于C104CuH175N17O486[M+Cu]+计算值＝2591.33。
合成脱保护的巯基丁酸酯衍生物1(三价配体1)
向N-Boc-保护的三价甲酯10(15mg，6μmol)在水(1mL)中的溶液中添加1M氢氧化钠(NaOH，10μL)，使反应在室温静置12小时。将溶液用AmberliteIR-120(H+)中和，过滤并冻干，得到白色固体，将该白色固体用80％三氟乙酸水溶液(100μL)处理15分钟。真空蒸发溶剂，将残留物吸收在0.5M碳酸氢钠/乙醇1.5:1(2mL)中。向该溶液中添加γ-硫代丁内酯(125μL，1.4mmol)和二硫苏糖醇(DTT)(0.1g，0.7mmol)，将反应混合物在50℃加热2小时。真空除去溶剂，将所得残留物吸收在水(0.5mL)中，使其过滤通过0.2μm注射器式过滤器，在TSK凝胶上进行色谱法(水，0.5mL/min)，得到作为白色固体的产物1(6mg，41％，经历3步)。1HNMR(D2O):δ＝7.85(s,3H,CHNN),4.48(bs,6H,Hl),4.33(t,6H,Hi,3Jh,i＝6.9Hz),4.26(d,3H,H1’,3J1’,2’＝7.9Hz),3.93(d,3H,H4’,3J3’,4’＝3.4Hz),3.39(dd,3H,H2’,3J1’,2’＝7.9Hz,3J2’,3’＝10.0Hz),3.18(t,6H,Hc,3Jb,c＝6.6Hz),2.87(dd,6H,H9),2.73(dd,3H,H3eq,2J3e,3a＝12.2Hz,3J3e,4＝4.5Hz),2.60,2.38,(2xt,4H,Hq-HtorHv-x),2.14(t,6H,He,3Je,f＝7.6Hz),1.85-1.77(m,6H,Hh),1.71(m,6H,Hb),1.71-1.65(m,3H,H3ax),1.52(m,6H,Hf),1.22-1.13(m,6H,Hg)；13CNMR(D2O):δ＝125.6(d,3C,CHNN),102.5(d,3C,C1’),70.4(d,3C,C2’),68.7(d,3C,C4’),63.2(t,3C,Cl),49.9(t,3C,Ci),36.3(t,3C,Cc),35.3(t,3C,Ce),29.2(t,3C,C9),28.7(t,3C,Ch),28.2(t,3C,Cb),24.8(t,3C,Cg),24.5(t,3C,Cf)；
m/z(MALDI+)2527.78[M+K]+，对于C100H168KN17O477[M+K]+的计算值＝2527.85。
合成PEG配体2
PEG配体2的S-乙酰基衍生物购自QuantaBiodesign，在使用前将其用催化量的甲醇盐脱乙酰化，然后立即使用。
合成2-(2-(2-(2-碘乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁基酯(12)：
使碘乙酸酐(555mg，1.57mmol)溶解于无水乙醚(10ml)，在氮气气氛下且在无光照下将该溶液添加到2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁基酯(11)(299.6mg，1.21mmol)在无水乙醚(10ml)中的搅拌溶液中。将混合物在室温搅拌60分钟，进行TLC(Rf＝0.67，乙酸乙酯/甲醇20:1)，然后形成产物。真空蒸发挥发物，使残留物在硅胶上进行柱色谱法(先乙酸乙酯后乙酸乙酯/甲醇20:1)，得到浅黄色油状物的纯的12(353.5mg，70％)。1HNMR(400MHz；CDCl3):δ＝8.09和6.77(2bs,1H,C-N旋转异构体NHC(O)CH2),5.55和5.01(2bs,1H,C-N旋转异构体NHC(O)O),3.66(s,2H,H21),3.57(bs,4H,H25,H26),3.51(t,4H,3J3,4＝3J7,8＝4.4Hz,H24,H27),3.43-3.39(m,2H,H23),3.29-3.22(m,2H,H28),1.40(s,9H,(CH3)3CO)；13CNMR(100MHz；CDCl3):δ＝167.6(s,1C,C2),156.3(s,1C,C9),79.5(s,1C,(CH3)3CO),70.7,70.5,70.4,69.6(4xt,4C,C4,C5,C6,C7),40.6(t,1C,C8),40.4(t,1C,C3),28.7(3xq,3C,(CH3)3CO),-0.3(t,1C,C1)；HR-MS，对于C13H26IN2O5 +[M+H]+，计算值为417.0881，实测值为417.0882。
合成(3’,12’-二氮杂-15’,15’-二甲基-6’,9’-二氧杂-2’,13’-二氧代十六烷基)5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-二脱氧-2-硫-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸甲酯(methyl(3’,12’-diaza-15’,15’-dimethyl-6’,9’-dioxa-2’,13’-dioxohexadecyl)5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonate)(15)：
在氮气气氛下向冷却至-40℃的5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-2-S-乙酰基-3,5-二脱氧-2-硫-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸甲酯(13)(267mg，486μmol)在无水甲醇(12.3ml)中的溶液中添加1MMeONa的甲醇溶液(437μl，437μmol)。将混合物在-40℃搅拌30分钟，然后用AmberliteIR-120H+树脂中和，同时在-40℃搅拌15分钟。将混合物过滤，将滤液真空蒸发，得到粗制的5-乙酰氨基-4,7,8,9-四-O-乙酰基-3,5-二脱氧-2-硫-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸甲酯14。将残留物溶解于二氯甲烷(15ml)，将所得溶液添加到碘乙酰胺12(240mg，577μmol)和N,N-二异丙基乙胺(254μl，1457μmol)在二氯甲烷(15ml)中的溶液中。将混合物在室温搅拌12小时，通过TLC监测反应。将混合物用二氯甲烷(30ml)稀释并用水(10ml)洗涤。将有机层用MgSO4干燥，过滤，蒸发，使残留物在硅胶上进行柱色谱法(7g，乙酸乙酯/己烷1:10，然后纯乙酸乙酯，然后纯二氯甲烷，从而洗脱未反应的碘乙酰胺12，然后分段梯度的二氯甲烷/甲醇40:1、30:1和20:1)，得到纯的15(251.2mg，65％，经历2步)。Rf＝0.58(氯仿/甲醇10:1)；[α]D 25+8.8(c＝0.49，CHCl3)；1HNMR(400MHz；CDCl3)：δ＝6.95和6.79(bs，1H，C-N旋转异构体NHC(O)CH2)，5.39(bs，1H，H7)，5.31-5.22(m，2H，H8，CH3C(O)NH)，4.99(bs，1H，NHC(O)OtBu)，4.81(ddd，1H，3J4,5＝3J4,3a＝10.8Hz，3J4,3e＝4.2Hz，H4)，4.21(dd，1H，2J9a,9b＝12.4Hz，3J9a,8＝2.4Hz，H9a)，4.01-3.96(m，2H，H5，H9b)，3.76-3.70(m，1H，H6)，3.70(s，3H，COOCH3)，3.52-3.46(m，10H，H24’，H25’，H26’，H27’，H1’a，H3’a)，3.40-3.33(m，1H，H3’b)，3.26-3.22(m，3H，H1’b，H28’)，2.68(dd，1H，2J3e,3a＝12.8Hz，3J3e,4＝4.2Hz，H3e)，2.14，2.09，1.99，1.97(4×s，12H，4×CH3C(O)O)，1.92-1.88(m，1H，H3a)，1.81(s，3H，CH3C(O)NH)，1.38(s，9H，(CH3)3CO)；13CNMR(100MHz；CDCl3)：δ＝170.2，169.9，169.7，169.2，169.1，167.6，167.3(7×s，8C，C2’，COOCH3，4×CH3C(O)O，CH3C(O)NH)，155.0(s，1C，C9’)，81.1(s，1C，C2)，78.2(s，1C，(CH3)3CO)，72.9(d，1C，C6)，69.2，68.7(2×t，4C，C4’，C5’，C6’，C7’)，68.4(d，1C，C4)，66.9(d，1C，C7)，65.9(d，1C，C8)，61.3(t，1C，C9)，52.2(q，1C，COOCH3)，48.2(d，1C，C5)，39.3(t，1C，C8’)，38.6(t，1C，C3’)，36.4(t，1C，C3)，31.5(t，1C，C1’)，27.4(q，3C，(CH3)3CO)，22.2(q，1C，CH3C(O)NH)，20.4，19.9，19.8(3×q，4C，4×CH3C(O)O)；m/z(ESI+)818([M+Na]+，100％)，796([M+H]+，71)，696(5)；HR-MS，对于C33H54N3O17S+[M+H]+，计算值为796.3168，实测值为796.3168。
合成3’,12’-二氮杂-6’,9’-二氧杂-2’,13’-二氧代-17’-硫杂十七烷基5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-2-硫-D-甘油-α-D-半乳-2-吡喃壬酮糖酸(一价配体3)：
将硫糖苷15(178mg，224μmol)溶解于无水甲醇(8.3ml)并用0.5NNaOMe的甲醇溶液(966μl，484μmol)处理。在室温搅拌1小时之后(TLC监测，产物Rf＝0.08(氯仿/甲醇10:1))，真空除去溶剂，然后将1NNaOH(1.72ml，1.72mmol)添加到残留物中。搅拌1.5小时之后，添加冰醋酸/水的1:1混合物(1.6ml)，然后真空蒸发挥发物。将残留物溶解于二氯甲烷(4.2ml)，在室温用三氟乙酸(4.2ml)处理。在3小时之后，将反应混合物浓缩，得到粗制的胺的TFA盐，其无需进一步纯化即使用。将粗制胺(～115mg，～224μmol)溶解于0.5M碳酸氢钠(10.3ml，pH～9.0)和乙醇(8.2ml)的混合物，然后添加二硫苏糖醇(173mg，1.12mmol)和γ-硫代丁内酯(194μl，2.24mmol)。将混合物在50℃在氮气气氛下搅拌过夜。使用1MHCl将混合物的pH调节至6.0。将混合物在37℃真空浓缩，将残留物冻干。将残留物吸收在甲醇中并过滤。将滤液蒸发，残留物使用在硅胶柱上的柱色谱法(6g，对样品先后施用甲醇、氯仿/甲醇2:1和氯仿/甲醇/水55:45:10)纯化，得到纯的3(116mg，84％，经历4步)。在氮气气氛下在-20℃储存纯化合物。Rf＝0.58(乙酸乙酯/甲醇/乙酸/水3:3:3:1)；1HNMR(400MHz；D2O)：δ＝3.85-3.79(m，2H，H5，H9a)，3.71-3.61(m，11H，H4，H8，H9b，H24’，H25’，H26’，H27’)，3.59-3.53(m，2H，H6，H7)，3.49-3.41(m，6H，H21’，H23’，H28’)，2.79(dd，1H，2J3e,3a＝12.4Hz，3J3e,4＝4.8Hz，H3e)，2.56-2.52(m，2H，H212’)，2.39-34(m，2H，H210’)，2.01(s，3H，CH3C(O)NH)，1.92-1.76(m，3H，H3a，H211’)；13CNMR(100MHz；CDCl3)：δ＝176.8，175.6，174.2，172.5(4×s，4C，CH3C(O)NH，C1，C2’，C9’)，86.1(s，1C，C2)，75.5(d，1C，C6)，72.4(d，1C，C8)，70.1，70.0，69.4，69.3(4×t，4C，C4’，C5’，C6’，C7’)，69.1(d，1C，C4)，68.7(d，1C，C7)，63.2(t，1C，C9)，52.2(d，1C，C5)，41.1(t，1C，C3)，39.9，39.5(2×t，2C，C3’，C8’)，35.0(t，1C，C10’)，33.8(t，1C，C1’)，30.1(t，1C，C11’)，23.7(t，1C，C12’)，22.6(q，1C，CH3C(O)NH)；m/z(ESI+)660([M-H+2Na]+，100％)，638([M+Na]+，21)；m/z(ESI-)614([M-H]+，100％)；HR-MS，对于C23H41N3NaO12S2 +[M+Na]+，计算值为638.2024，实测值为638.2028。
柠檬酸盐包覆的金纳米颗粒、官能化的金纳米颗粒的合成及病毒检测试剂
除非另有说明，否则所有试剂均为分析级，原样使用且购自Sigma-Aldrich(UK)。MillexGP注射器驱动过滤装置(0.22μm)和AmiconUltra-4离心过滤装置(10,000MW截止功率)购自MilliporeCorporation，USA。灭活病毒：X31和RG14和尿囊液(AF)病毒X31由WHOCollaboratingCentreforReferenceandResearchonInfluenza,DivisionofVirology,NationalInstituteofMedicalResearch,UK提供。
仪器方法
紫外可见光谱使用PerkinElmerLambda25UV-Vis光谱仪在室温记录。使用光路长为1cm的石英比色皿。透射电镜(TEM)图像使用在200KV操作的Jeol2000EX透射电镜通过以下过程获得：使样品沉积在得自英国AgarScientific的有孔碳膜300目铜网上。
合成柠檬酸盐稳定化的金纳米颗粒
通过由Enüstün和Turkevich报告的柠檬酸盐还原法[5]制备水溶性金纳米颗粒。简言之，制备HAuCl4·3H2O的水溶液(12.5mg，32μmol，在100mL中)和柠檬酸三钠盐二水合物的水溶液(50mg，168μmol，在50mL中)，将其加热至60℃。在剧烈搅拌的同时，快速将柠檬酸钠溶液加入到金溶液中。将温度升至85℃，将溶液搅拌2.5小时。得到澄清的红色金纳米颗粒溶液，将其冷却至室温，并过滤通过MillerGP注射器驱动过滤装置(0.22μm)。颗粒在柠檬酸盐稳定化的金纳米颗粒溶液中的浓度为约3nM。
合成用三价配体1和PEG配体2官能化的金纳米颗粒(三价配体1:PEG官能化的金纳米颗粒)
金纳米颗粒用不同比例的三价配体1和PEG配体2官能化。将不同摩尔比的三价配体1和基于PEG的配体2(表4)添加到新鲜制备的金纳米颗粒的等分液(17mL)中并在室温搅拌60h，从而确保配体自组装到金表面上。纳米颗粒溶液使用SorvallLegendRT离心机中的AmiconUltra-4离心过滤装置(10,000MW截止功率)以4,000×g离心10分钟，从而除去过量的三价配体1和PEG配体2。使离心的纳米颗粒重新悬浮于Tris缓冲溶液(17mL，10mM，pH7.6)中。总共重复离心过程两次。
表4.添加到金纳米颗粒的三价配体1和PEG配体2的摩尔比。
％三价配体1 三价配体1的添加量(nmol) ％PEG配体2 PEG配体2的添加量(nmol)
50 15.1 50 15.1
25 7.6 75 22.6
10 3.0 90 27.2
5 1.5 95 28.7
2 0.6 98 29.6
合成用一价配体3和PEG配体2官能化的金纳米颗粒(一价配体3:PEG官能化的金纳米颗粒)
金纳米颗粒用不同比例的一价配体3和PEG配体2官能化。将不同摩尔比的一价配体3和基于PEG的配体2(表5)添加到新鲜制备的金纳米颗粒的等分液(17mL)中并在室温搅拌60小时，以确保配体自组装到金表面上。按照之前针对三价配体1和PEG配体2官能化的金纳米颗粒的描述除去过量的配体。
表5.添加到金纳米颗粒的一价配体3和PEG配体2的摩尔比。
％一价配体3 一价配体3的添加量(nmol) ％PEG配体2 PEG配体2的添加量(nmol)
50 15.1 50 15.1
25 7.6 75 22.6
10 3.0 90 27.2
5 1.5 95 28.7
2 0.6 98 29.6
合成用PEG配体2官能化的金纳米颗粒(PEG官能化的金纳米颗粒)
将PEG配体2(30.2nmol)添加到新鲜制备的柠檬酸盐稳定化的金纳米颗粒溶液(17mL)中。将溶液在室温搅拌60小时，以确保配体自组装在金表面上。按照之前针对用三价配体1和PEG配体2官能化的金纳米颗粒的描述除去过量的配体。
金纳米颗粒为用于检测人流感病毒的优化官能化
将X31病毒(H3N2)(2.55μg/mL)添加到每种合成的金纳米颗粒的样品中，所述金纳米颗粒包括：柠檬酸盐包覆的金纳米颗粒；三价配体1:PEG官能化的金纳米颗粒(50:50、25:75、10:90、5:95和2:98)；和一价配体3:PEG官能化的金纳米颗粒(50:50、25:75、10:90、5:95和2:98)。将样品在室温搅拌，在添加病毒之前及在添加病毒之后的0分钟、15分钟、30分钟、60分钟和240分钟记录紫外-可见光谱。
使用三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒、一价配体3:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒和PEG官能化的金纳米颗粒比色法检测X31病毒
将浓度增加的X31病毒(0-3μg/mL)添加到官能化的金纳米颗粒的样品中。在添加病毒之前及在添加相应病毒浓度之后30分钟测量每种官能化的金纳米颗粒溶液的紫外-可见光谱。
使用三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒比色法检测来自尿囊液的流感病毒X31
将体积增加的来自尿囊液(AF)的X31病毒(0-43.1μL)添加到三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的样品(1000μL)中。在添加AFX31病毒之前及在添加相应体积的AFX31病毒之后30分钟测量样品的紫外-可见光谱。作为稀释效应的对照实验，重复相同的测量法，所不同的是将体积增加的Tris缓冲液(0-47.1μL)添加到三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的样品(1000μL)中。
使用三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒比色法检测禽流感病毒RG14
将浓度增加的禽流感RG14病毒(H5N1)(0-6.8μg/mL)添加到三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的样品中。在添加每种浓度的病毒之前及之后的30分钟测量样品的紫外-可见光谱。
使用三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒区分人流感病毒X31(H3N2)和禽流感病毒RG14(H5N1)
将每种病毒(6.8μg/mL)添加到三价配体1:PEG(25:75)官能化的金纳米颗粒的样品中。在将样品在室温搅拌6天之后测量每种样品的紫外-可见光谱。
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Claims (51)

1.特异性检测样品中的目标流感病毒的方法，所述方法包括：
(a)提供包含多个糖缀合物配体的纳米颗粒探针，
每个糖缀合物配体(GL)具有多个通过多价核(X)连接于纳米颗粒的含唾液酸的识别基团(Y)，
其中所述多价核(X)是三价核，由此对于每个配体存在3个识别基团，
其中所述生物缀合物上的识别基团特异性结合于所述目标流感病毒上的血凝素；
(b)使所述纳米颗粒探针和所述样品在可有效使所述目标流感病毒的血凝素特异性结合于所述识别基团的条件下接触，其中所述特异性结合产生对所述流感病毒具有特异性的可检测的等离子体信号；
(c)检测在步骤b)中产生的信号。
2.权利要求1的方法，其中所述或每个识别基团终止于唾液酸部分的α-端基异构体，且所述唾液酸部分通过2,6糖苷键结合于单糖。
3.权利要求2的方法，其中所述目标流感病毒是人流感病毒。
4.权利要求3的方法，其中所述人流感病毒是H3病毒。
5.权利要求1的方法，其中所述或每个识别基团终止于唾液酸部分的α-端基异构体，且所述唾液酸部分通过2,3糖苷键结合于单糖，且所述目标流感病毒是禽流感病毒。
6.权利要求2至5中任一项的方法，其中所述唾液酸部分和单糖是硫键连接的。
7.权利要求2至6中任一项的方法，其中所述单糖是半乳糖。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述探针具有一个或多个结合于所述纳米颗粒的其它配体。
9.权利要求8的方法，其中所述其它配体是不特异性结合于流感病毒的配体。
10.权利要求8至9中任一项的方法，其中所述其它配体包含聚乙二醇(PEG)，任选为硫醇化的PEG。
11.权利要求8至10中任一项的方法，其中糖缀合物配体:其它配体的摩尔比为10:10至90:10。
12.权利要求11的方法，其中糖缀合物配体:其它配体的摩尔比为15:85至35:65，更优选为20:80至30:70，最优选为约25:75。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述纳米颗粒是金纳米颗粒。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述纳米颗粒的直径为约10至约30nm。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中每个纳米颗粒探针包含平均数目等于或至少5、10、25、50、100或200个的糖缀合物配体分子/纳米颗粒。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中所述可检测的信号是可用肉眼观察到的颜色变化。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中步骤(b)中的所述特异性结合引起纳米颗粒的聚集，其中所述聚集产生或促成所述可检测的等离子体信号。
18.权利要求1至17中任一项的方法，其中所述可检测的信号在60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、10分钟或5分钟内产生。
19.权利要求1至18中任一项的方法，其中所述样品是人或动物样品，其任选地选自拭子或体液，
或者所述样品是环境样品。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述纳米颗粒探针在水混悬液中使用。
21.权利要求20的方法，其中所述混悬液包含0.1至7.0nM的纳米颗粒探针。
22.权利要求1至21中任一项的方法，其进一步包括使阳性样品接受确认试验，所述确认试验任选基于核酸检测。
23.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述糖缀合物配体(GL)具有下式：
其中：
Y是含唾液酸的识别基团；
m＝3；
X是多价核部分；
L是将GL连接于纳米颗粒的连接部分。
24.权利要求23的方法，其中L＝硫连接基。
25.权利要求23至24中任一项的方法，其中基团X包含多价碳原子，其中三个Y识别基团通过XL基团连接于该多价碳原子：
其中XL1、XL2和XL3选自-CH2-O-CH2-或-CH2-S-CH2-。
26.权利要求25的方法，其中所述Y基团的唾液酸部分的端基异构中心与所述多价碳原子相隔20至30个键长或相隔1.5至3nm。
27.权利要求23至26中任一项的方法，其中X是具有下式的部分：
其中f为4，且g为3，
且其中XL1、XL2和XL3是-CH2-O-CH2-。
28.权利要求23至27中任一项的方法，其中Y包含将所述含唾液酸的部分与核基团X连接的间隔基部分(Z)，
其中Z包含亚烷基或亚烯基，所述亚烷基或亚烯基任选地包含一个或多个胺、酰胺、醚、酯或硫酯连接基且任选地由一个或多个杂原子和/或芳环中断。
29.权利要求28的方法，其中Z包含三唑基团。
30.权利要求28或29的方法，其中Z包含酰胺连接基。
31.权利要求23至30中任一项的方法，其中Z是具有下式的部分：
d为3，且e为5。
32.权利要求31的方法，其中Y具有下式：
33.权利要求1至4或从属于权利要求3或4的权利要求6至32中任一项的方法，其中所述糖缀合物配体化合物具有下式：
34.如权利要求1至33中任一项所定义的糖缀合物配体化合物。
35.具有下式的糖缀合物配体化合物：
其中：
X、Y和m如权利要求23至32中任一项所定义或者参照关于其的描述。
36.权利要求35的糖缀合物配体化合物，其具有下式：
其中L*是用于将所述化合物连接于固体载体的连接部分，所述连接部分任选为硫醇基团。
37.权利要求34至36中任一项的糖缀合物配体，其连接于固体载体。
38.如权利要求1至33中任一项所定义的纳米颗粒探针。
39.纳米颗粒探针，其包含连接于纳米颗粒的如权利要求34至37中任一项所定义的糖缀合物配体化合物。
40.流感病毒检测组合物，其包含权利要求38或39的纳米颗粒探针的水混悬液。
41.试剂盒，其包含权利要求34或37中任一项的糖缀合物配体、权利要求38至39中任一项的纳米颗粒探针或权利要求40的流感病毒检测组合物，在每种情况下任选带有用于进行权利要求1至33中任一项的方法的使用说明。
42.权利要求34至41中任一项的试剂盒、配体、探针或组合物，其用于权利要求1至33中任一项的方法。
43.制备权利要求34或37中任一项的糖缀合物配体化合物的方法，所述方法任选地基本上如参照本申请说明书和附图所述。
44.制备权利要求34至37中任一项的糖缀合物配体化合物的方法，所述方法包括：
(i)通过将一个或多个单糖单元连接于唾液酸产生用于结合HA的含唾液酸的识别基团(Y)；
(ii)将三个或更多个含唾液酸的识别基团(Y)连接于包含连接部分(L)的核部分(X)。
45.权利要求43至44中任一项的方法，其中产生基团Y的步骤包括使所述单糖单元与间隔基部分(Z)反应的步骤。
46.权利要求43至45中任一项的方法，其中步骤(i)包括在唾液酸与一个或多个单糖单元中的一个之间形成α-2,3糖苷键。
47.权利要求43至45中任一项的方法，其中步骤(i)包括在唾液酸与一个或多个单糖单元中的一个之间形成α-2,6糖苷键。
48.权利要求43至47中任一项的方法，其中将三个或更多个糖缀合物配体连接于核部分的步骤包括进行1,3偶极环加成。
49.权利要求48的方法，其中所述1,3偶极环加成涉及炔丙基醚部分和叠氮部分的环加成。
50.制备权利要求38或39的纳米颗粒探针的方法。
51.制备纳米颗粒探针的方法，所述方法包括：
(a)进行权利要求43或49中任一项的方法，
(b)将所述糖缀合物配体化合物经由连接部分(L)连接于纳米颗粒。
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