CN105651753A - 氧化石墨烯荧光传感器、制备方法及其应用 - Google Patents

氧化石墨烯荧光传感器、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，具体为一种氧化石墨烯荧光传感器、制备方法及其应用。本发明通过先将有机胺小分子的一端连接到氧化石墨烯上，再将另一端的氨基经过叔胺化后，与荧光分子TO3-I发生嫁接反应制备出可用于检测双链DNA的氧化石墨烯荧光传感器。本发明的有益效果在于：采用有机胺作为连接剂，通过共价键实现了荧光染料分子与氧化石墨烯的嫁接。本发明的氧化石墨烯荧光传感器在水溶液或复杂的体系中具有对双链DNA(例如，鲑鱼精子StDNA)可特异性识别的能力。在DNA未加入前，荧光分子处于荧光猝灭状态；加入DNA后，DNA与荧光分子相互作用，产生较强的荧光发射信号。

Description

氧化石墨烯荧光传感器、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于荧光传感器技术领域，具体涉及石墨烯荧光传感器的制备和在615nm激光激发下对双链DNA进行检测的方法。
背景技术
近年来，简单灵敏的荧光检测技术在一些疾病的检测中越来越起到重要作用。作为携带众多遗传信息的DNA，由于各种外界原因的诱导而产生突变并有可能导致细胞癌变，因此对于DNA的特异性识别和定量分析对于癌症的早期诊断非常必要。在众多DNA检测方法中，荧光探针技术由于其高灵敏、快速响应和简单方便的特点，吸引了研究者的广泛关注。
目前，荧光传感器淬灭剂材料主要可以分为三类：(1)贵金属纳米颗粒，如：纳米金、纳米银等，它们具有较高的荧光淬灭效率和较小的尺寸，但是该类荧光传感器的制备成本比较高。(2)聚合物纳米材料，如：悬挂型聚合物、介孔纳米材料聚合物、共轭聚合物和薄膜聚合物，它们具有较高的选择性和灵敏度，不过该类材料大多运用于一些金属离子的检测。(3)碳纳米材料，如：氧化石墨烯和碳纳米管，该类荧光传感器的制备成本较低，而且具有比较高的荧光淬灭效率。并且氧化石墨烯表面含有大量的含氧官能团，可以使其很容易的分散在各种溶剂中。
在已报道的氧化石墨烯荧光传感器中，荧光基团绝大部分是采用非共价键的形式与石墨烯作用，石墨烯与荧光材料之间的作用力比较弱。在检测过程中，探针未遇到被测物质就可能产生荧光基团的脱吸附现象，使得荧光恢复。导致探针的特异性能力较低且不可以重复利用。也有一些研究者已经采用共价键的形式与氧化石墨烯结合制备出氧化石墨烯荧光传感器，但是他们一般采用价格比较昂贵的PEG、多肽或单链DNA为连接剂，增加了探针的制备成本，限制了其应用范围。在检测DNA时，也大多采用以荧光标记单链DNA分子，去检测互补链，实现单链DNA的检测。
对于双链DNA的检测，目前主要采用的是破坏互补链，使得释放出的荧光标记DNA链被吸附到氧化石墨烯上，荧光被淬灭。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种构思不同的氧化石墨荧光传感器、制备方法及其应用，该传感器在水溶液中可实现对双链DNA的检测。
本发明中，采用有机胺作为连接剂，通过共价键实现了荧光染料分子与氧化石墨烯的嫁接。该氧化石墨烯复合材料在水溶液或复杂的体系中具有对双链的DNA(例如:鲑鱼精子StDNA)可特异性识别的能力。在DNA未加入前，荧光分子处于荧光猝灭状态；加入DNA后，DNA与荧光分子相互作用，产生较强的荧光发射信号。
一、氧化石墨烯荧光传感器的制备方法
本发明所涉及的石墨烯荧光传感器，其结构通式如下：
式中：R为氧化石墨烯GO或二次氧化石墨烯sGO，6≤n≤12，a、b为自然数。
本发明提供一种氧化石墨烯荧光传感器，其结构通式如下：
本发明还提供上述氧化石墨烯荧光传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)氧化石墨烯材料的氨基化反应
①将氧化石墨烯材料均匀分散在无水DMF中，然后在冰水浴下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，进行羧基的活化处理，培育10-30min；其中：氧化石墨烯材料和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为2：0.95-2:1.1；氧化石墨烯材料是氧化石墨烯或二次氧化石墨烯；
②向培育后的氧化石墨烯材料中，加入NH2-(CH2)n-NH2，6≤n≤12，以及4-二甲氨基吡啶，在30-50℃温度下反应；
③反应结束后，用去离子水，抽滤洗涤除去其他物质，透析2-3天后浓缩冷冻干燥，得到氨基化的氧化石墨烯材料；
(2)氨基化的氧化石墨烯材料的叔胺化
①氨基化的氧化石墨烯材料于乙酸中分散；
②加入37wt％甲醛水溶液和乙酸锌，超声分散，并在25-35℃温度下反应2-5小时；其中：氨基化的氧化石墨烯材料和乙酸锌的质量比为1：0.95-1:1.1；
③反应结束后，用去离子水，抽滤洗涤，透析，浓缩后冷冻干燥，得到叔胺化的氧化石墨烯材料；
(3)氧化石墨烯荧光传感器的制备
①将叔胺化的氧化石墨烯材料于无水DMF中超声搅拌，使其分散均匀。
②向步骤①得到的溶液中，加入噻唑橙荧光染料TO3-I和K2CO3，惰性气氛保护下50-65℃温度下右反应30-60小时；
③反应结束后，用去离子水冲洗，透析，浓缩后冷冻干燥，得到氧化石墨烯荧光传感器。
上述步骤(3)中，叔胺化的氧化石墨烯材料和噻唑橙荧光染料TO3-I的质量比为1:1-1:10。
进一步的，本发明提供上述氧化石墨烯荧光传感器在双链DNA检测领域的应用。优选的，所述双链DNA包括鲑鱼精子StDNA、鲱鱼精子DNA和小牛胸腺DNA。
本发明的有益效果在于：本发明的石墨烯荧光传感器其和现有的传感器构思不同，该氧化石墨烯复合材料在水溶液或复杂的体系中具有对双链的DNA(例如:鲑鱼精子StDNA、鲱鱼精子DNA和小牛胸腺DNA等)可特异性识别的能力。同时可通过调整荧光分子与石墨烯之间的距离或者反应比例，以及改变氧化石墨烯的种类制备出不同荧光效果的传感器。
附图说明
图1为本发明传感器设计原理图；其中a为氧化石墨烯平台；b为氧化石墨烯荧光传感器复合材料；c为加入双链DNA后的氧化石墨烯荧光传感器复合材料作用机理。
图2为实施例5加入不同浓度的StDNA后GONT12-TO3的荧光发射光谱。
图3为实施例6加入不同浓度的StDNA后sGONT12-TO3的荧光发射光谱。
图4为实施例7中GONT12-TO3在相同浓度下的不同生物小分子的选择性实验。(1:去离子水,2:StDNA,3:半胱氨酸,4:脯氨酸,5:精氨酸,6:谷胱甘肽,7:葡萄糖,8:蔗糖)
具体实施方式
实施例1荧光染料分子的合成
(1)4-二甲基喹啉碘盐的合成
将4-甲基喹啉(2.19g,15.3mmol)加入到装有40mL甲苯的100mL的圆底烧瓶中，然后加入碘甲烷(2.30g,16.10mmol)。用油浴锅把混合物加热到80℃左右，反应6-8小时，观察有大量的黄色沉淀析出。抽滤收集固体，用甲苯洗涤三次，在真空冷冻干燥器中干燥24小时，得到黄色固体(3.88g,13.60mmol)。
(2)化合物(Z/E)-1-甲基-4-(2-(苯基氨基)乙烯基)喹啉碘盐的合成
将N,N-二苯甲脒(0.688g,3.52mmol)和1，4-二甲基喹啉碘盐(1.0g,3.52mmol)放到研钵中充分研磨，使它们充分混合。然后将混合均匀的粉末转移到100mL烧瓶中，在氩气保护下160℃反应30分钟，有黑色焦油状物质生成。冷却到室温，用80mL二氯甲烷/甲醇(1:1)混合溶剂溶解，浓缩到约6-7mL有紫黑色固体析出，然后用甲醇洗涤两次，得到紫色固体(1.0g,2.58mmol)。
(3)BSN-I的合成
2-甲基苯并噻唑(1.0g,6.71mmol)和1，2-二(2-碘乙氧基)乙烷(10.0g,27.03mmol)加入到100mL圆底烧瓶。对反应体系进行氩气保护，然后将混合物加热到110℃左右，反应24小时，有白绿色的固体产生。然后冷却至室温，使用80mL的二氯甲烷/石油醚(3:1)混合溶剂将粗产物洗涤3次，抽滤收集固体，真空冷冻干燥，最终得到白色固体(0.65g,1.25mmol)。
(4)TO3-I的合成
BSN-I(0.3g,0.578mmol)，(Z/E)-1-甲基-4-(2-(苯基氨基)乙烯基)喹啉碘盐(0.197g,0.525mmol)和醋酸钾(51.5mg,0.525mmol)加入到50mL圆底烧瓶中，然后向其中加入15mL醋酸酐。对反应体系进行氩气保护，将混合物加热到70℃左右，反应30分钟。然后用旋蒸除去溶剂，用硅胶柱层析，甲醇/二氯(0-2％)做流动相洗脱。最终得到蓝色固体(0.13g,0.19mmol)。
实施例2氧化石墨烯(GO)的制备
(1)量取25mL浓硫酸加入100mL烧瓶中，加热至90℃，然后依次缓慢加入5g过硫酸钾和5g五氧化二磷。当温度降至80℃时，加入5g石墨粉，反应4到5小时。然后加入1L的去离子水稀释并放置过夜。
(2)用2L蒸馏水将上面的预氧化石墨进行抽虑洗涤，去除大部分酸，然后将得到的石墨粉末置于50℃干燥过夜。
(3)取230mL浓硫酸置于1L的烧瓶中，用冰浴冷却20min，然后依次缓慢加入上面处理过的预氧化石墨和30g高锰酸钾，并大力搅拌20min，接着将反应体系置于35℃水浴中反应2小时，然后往反应体系中缓慢加入460mL蒸馏水，直至当最后一滴蒸馏水加入时，不再引起明显的温度变化，然后再加入1.4L的去离子水稀释，缓慢搅拌，反应2个小时后，加入25mL30％的过氧化氢水溶液，此时溶液颜色变成土黄色。最后用5％的稀盐酸洗涤3次，2L去离子水洗涤2次，离心得到较浓的氧化石墨溶液。
(4)用去离子水稀释所得到的氧化石墨，然后超声剥离，直至成透明的棕色悬浮液，得到氧化石墨烯。
实施例3二次氧化石墨烯的制备
(1)量取25mL的浓硫酸加入到100mL的反应瓶中，缓慢的加入1g氧化石墨烯，并搅拌使其均匀分散在浓硫酸中，在室温下加入5g的高锰酸钾，搅拌20分钟。
(2)等反应结束后，用200mL浓盐酸抽洗三次，然后用2L蒸馏水将上面的残余的高锰酸钾和酸抽滤洗涤，以达到中和的效果。
(3)将抽滤中和的产物在超声下溶入100mL的蒸馏水中，透析4-5天。然后旋去溶剂，冷冻干燥得到二次氧化石墨烯(sGO)。
实施例4氧化石墨烯荧光传感器的DNA检测方法
(1)DNA溶液的配制
0.0072mol·mL-1StDNA的配置：用移液器将10mL的去离子水加入到20mL白色透明的容量瓶中，然后向其中加入0.5mg的StDNA(购自Sigma)，然后放入到4℃的冰箱中放置至少48小时后才可以使用。我们通过紫外吸收光谱以及研究者们常用的野生DNA碱基对的估算公式，来计算StDNA的碱基对浓度。
(2)GONT12-TO3的配制
用移液器取3mL的去离子水加入到5mL的离心管中，然后向其中加入1mg的氧化石墨烯荧光传感器，超声1小时，使其在水溶液中均匀分布。
(3)DNA的检测
量取2945μL的去离子水加入到荧光比色皿中，加入45μL的氧化石墨烯荧光传感器溶液，然后再加入DNA水溶液，磁力搅拌20分钟，运用稳态/瞬态荧光光谱仪(FLS920)进行荧光检测。
实施例5不同连接剂的氧化石墨烯荧光传感器的制备
(1)以1，6-己二胺为例
1，6-己二胺与氧化石墨烯的氨基化反应：量取50mL的无水DMF加入到100mL的反应瓶中，加入100mg的氧化石墨烯超声搅拌，使其均匀分散在无水DMF中。然后在冰水域下加入45mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，进行羧基的活化处理，培育20min。向培育后的氧化石墨烯溶液中，加入200mg1，12-十二烷二胺和45μL三乙胺，然后再加入50mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在40℃下反应48小时。等反应结束后，用1L的去离子水，抽滤洗涤除去其他物质，透析2-3天后浓缩冷冻干燥，得到氨基化的氧化石墨烯(GON6)。
GON6的叔胺化：量取20ml的乙酸加入到100mL的反应瓶中，加入25mgGON6超声20分钟，使其均匀分散。然后加入10mL的甲醛(含水量37％，过量)和30mg的乙酸锌，超声5min，在30℃下反应4小时。等反应结束后，用200mL的去离子水，抽滤洗涤，透析24小时，浓缩后冷冻干燥，得到叔胺化的氧化石墨烯材料GONT6。
(2)以1，12-十二烷二胺为例
1，12-十二烷二胺与氧化石墨烯的氨基化反应：量取50mL的无水DMF加入到100mL的反应瓶中，加入100mg的氧化石墨烯超声搅拌，使其均匀分散在无水DMF中。然后在冰水域下加入45mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，进行羧基的活化处理，培育20min。向培育后的氧化石墨烯溶液中，加入200mg1，12-十二烷二胺和45μL三乙胺，然后再加入50mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在40℃下反应48小时。等反应结束后，用1L的去离子水，抽滤洗涤除去其他物质，透析2-3天后浓缩冷冻干燥，得到氨基化的氧化石墨烯(GON12)。
GON12的叔胺化：量取20ml的乙酸加入到100mL的反应瓶中，加入25mgGON12超声20分钟，使其均匀分散。然后加入10mL的甲醛(含水量37％，过量)和30mg的乙酸锌，超声5min，在30℃下反应4小时。等反应结束后，用200mL的去离子水，抽滤洗涤，透析24小时，浓缩后冷冻干燥，得到叔胺化的氧化石墨烯材料GONT12。
我们选用了噻唑橙荧光染料(TO3-I)与GONT12(或者GONT6)不同质量比来进行嫁接反应(即1:1，3:1，5:1，10:1)，并且反应前后溶液颜色会有明显变化(蓝色→黄绿色)。但在10:1比例反应时，反应结束后仍为蓝色的溶液。
以TO3-I与GONT12为5:1反应制备石墨烯荧光传感器为例
量取30mL的无水DMF加入到100mL的反应瓶中，然后加入10mg经过叔胺化的氧化石墨烯(GONT12)，超声搅拌30分钟，使其分散均匀。分别称取50mg的TO3-I和35mg的K2CO3加入到石墨烯DMF溶液中，在氩气保护下60℃左右反应48小时。反应结束后，用500mL的去离子水冲洗6次，透析3-4天，浓缩后冷冻干燥，得到GONT12-TO3，采用实施例4方法进行DNA的检测，其加入85.5μM的StDNA(加入浓度分别是0，1.6，4.8，8.0，11.2，14.4，22.8，36.9，50.1，85.5μM)后的荧光发射光谱强度比未加入StDNA的荧光发射强度增加了16倍(如图2)。
实施例6不同种类的氧化石墨烯荧光传感器的制备，以二次氧化石墨烯荧光传感器的制备为例
1，12-十二烷二胺与二次氧化石墨烯的氨基化反应：量取20mL的无水DMF加入到100mL的反应瓶中，加入30mg的二次氧化石墨烯超声搅拌，使其均匀分散在无水DMF中。然后在冰水浴下加入15mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，使氧化石墨烯表面的羧基活化，培育20分钟左右。向培育后的氧化石墨烯溶液中，加入80mg1，12-十二烷二胺和15μL三乙胺，然后再加入15mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在40℃下反应48小时。等反应结束后，用1L的去离子水，抽虑洗涤除去其他物质，透析2-3天后浓缩冷冻干燥，得到氨基化的二次氧化石墨烯(sGON12)。
sGON12的叔胺化：量取20ml的乙酸加入到100mL的反应瓶中，加入25mgsGON12超声20分钟，使其均匀分散。然后加入10mL的甲醛(含水量37％，过量)和30mg的乙酸锌，超声5min，在30℃下反应4小时。等反应结束后，用200mL的去离子水，抽虑洗涤，透析24小时，浓缩后冷冻干燥，得到叔胺化的二次氧化石墨烯材料sGONT12。
量取30mL的无水DMF加入到100mL的反应瓶中，然后加入10mg经过叔胺化的二次氧化石墨烯(sGONT12)，超声搅拌30分钟，使其分散均匀。分别称取50mg的TO3-I和35mg的K2CO3加入到石墨烯DMF溶液中，在氩气保护下60℃左右反应48小时。反应结束后，用500mL的去离子水冲洗6次，透析3-4天，浓缩后冷冻干燥，得到sGONT12-TO3，采用实施例4方法进行DNA的检测，当加入85.5μM的StDNA(加入浓度分别是0，1.6，4.8，8.0，11.2，14.4，22.8，36.9，50.1，85.5μM)后的荧光发射光谱强度比未加入StDNA的荧光发射强度增加了18倍(如图3)。
实施例7氧化石墨烯荧光传感器的选择性实验以GONT12-TO3检测为例
通过计算分别取StDNA、半胱氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖和蔗糖配制成3mL的0.0072mol·mL-1的水溶液。
取8只5mL的离心管，分别往里面加入2940μL的去离子水和45μL的GONT12-TO3水溶液。然后再用50μL的移液器分别取15μL的去离子水、StDNA、半胱氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖和蔗糖等加入到不同的离心管中，分别标记为1、2、3、4、5、6、7、8号，放置20分钟后，分别检测荧光发射光谱，发现在加入StDNA后GONT12-TO3的荧光发射强度增加非常明显，而其他生物分子的加入对GONT12-TO3的荧光强度变化基本没有影响(如图4)。
上述实施例为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改、变化、变通或替换方案，均在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种氧化石墨烯荧光传感器，其特征在于，其结构通式如下：
式中：R为氧化石墨烯GO或二次氧化石墨烯sGO，6≤n≤12，a、b为自然数。
2.一种氧化石墨烯荧光传感器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)氧化石墨烯材料的氨基化反应
①将氧化石墨烯材料均匀分散在无水DMF中，然后在冰水浴下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，进行羧基的活化处理，培育10-30min；其中：氧化石墨烯材料和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为2:0.95-2：1.10:；氧化石墨烯材料是氧化石墨烯或二次氧化石墨烯；
②向培育后的氧化石墨烯材料中，加入NH2-(CH2)n-NH2，6≤n≤12，以及4-二甲氨基吡啶，在30-50℃温度下反应；
③反应结束后，用去离子水，抽滤洗涤除去其他物质，透析2-3天后浓缩冷冻干燥，得到氨基化的氧化石墨烯材料；
(2)氨基化的氧化石墨烯材料的叔胺化
①氨基化的氧化石墨烯材料于乙酸中分散；
②加入37wt％甲醛水溶液和乙酸锌，超声分散，并在25-35℃温度下反应2-5小时；其中：氨基化的氧化石墨烯材料和乙酸锌的质量比为1:0.95-1:1；
③反应结束后，用去离子水，抽滤洗涤，透析，浓缩后冷冻干燥，得到叔胺化的氧化石墨烯材料；
(3)氧化石墨烯荧光传感器的制备
①将叔胺化的氧化石墨烯材料于无水DMF中超声搅拌，使其分散均匀；
②向步骤①得到的溶液中，加入噻唑橙荧光染料TO3-I和K2CO3，惰性气氛保护下50-65℃温度下右反应30-60小时；
③反应结束后，用去离子水冲洗，透析，浓缩后冷冻干燥，得到氧化石墨烯荧光传感器。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，叔胺化的氧化石墨烯材料和噻唑橙荧光染料TO3-I的质量比为1:1-1:10。
4.一种氧化石墨烯荧光传感器在双链DNA检测领域的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述双链DNA包括鲑鱼精子StDNA、鲱鱼精子DNA和小牛胸腺DNA。
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