CN105641448A - 绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞u14细胞增殖药物中的应用 - Google Patents

绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞u14细胞增殖药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药技术领域,具体涉及一种绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用及绿及咳喘片的制备方法。所述绿及咳喘片由小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g作为原料药制成,采用超临界萃取制备而成,使得大黄素含量有很大提高。

Description

绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用
技术领域
本发明属于中药技术领域,具体涉及一种绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用及绿及咳喘片的制备方法。
背景技术
绿及咳喘颗粒标准号WS-10616(ZD-0616)-2002,记载于国家中成药标准汇编内科肺系(二)分册。由小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g作为原料药制成,具有养阴润肺、清热解毒、化瘀止血的功效,用于热燥犯肺引起的咳嗽,潮热,盗汗等症。
现有技术中,尚未有绿及咳喘片在在制备抑制人宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用的报道,也未见有绿及咳喘片提取制备方面采用超临界萃取的报道,而传统水煎煮、乙醇回流提取的方法,工艺粗糙、落后,杂质多,导致患者用量过大,不方便服用,严重影响了本品在临床上应用。
发明内容
发明目的:本发明的目的在于提供一种绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种绿及咳喘片的制备方法。
本发明的目的是通过如下的方案实现的:
绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用,所述绿及咳喘片由小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g作为原料药制成,所述绿及咳喘片的制备方法包括如下步骤:取小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%,萃取压力15-30MPa,温度30-50℃,CO2流量l-3ml/g生药·min,萃取时间700-800min,得超临界萃取物,将超临界萃取物加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成200片,每片重0.50g。
优选的,上述的绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用,所述绿及咳喘片的制备方法包括如下步骤:取小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,萃取压力25MPa,温度40℃,CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间750min,得超临界萃取物,将超临界萃取物加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成200片,每片重0.50g。
现有技术中,绿及咳喘颗粒口服,一次10g,一日3-4次。绿及咳喘颗粒服药量大。采用本发明方法制备成的绿及咳喘片每片重0.50g,每次仅需2片,一日服用3-4次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。
试验一、不同方法制备的绿及咳喘片中大黄素含量的比较
l、仪器及试药本发明绿及咳喘片:按实施例1方法制备,使用1000g原料药,经提取制成200片,每片重0.50g。原绿及咳喘颗粒,按照WS-10616(ZD-0616)-2002标准方法制备。Agilent1200高效液相色谱仪;METTLERAE240电子分析天平;大黄素对照品(中国药品生物制品检定所)。
2、方法
照高效液相色谱法(中国药典2015年版第四部凡例十五)测定。
色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)为流动相;检测波长为437nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品适量,加甲醇制成每1ml含10μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取本发明绿及咳喘片10片,研细,混匀,取0.1g,精密称定,加水20ml使溶解,加盐酸2ml,摇匀,加热回流30分钟,冷却,加氯仿30ml,超声处理10分钟,转入分液漏斗中,分取氯仿液,水液再用氯仿振摇提取2次,每次15ml,合并氯仿液,在80℃水浴上蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取滤液,即得。
对照产品供试品溶液的制备取对照的绿及咳喘颗粒20g,研细,混匀,取1g,精密称定,加水20ml使溶解,加盐酸2ml,摇匀,加热回流30分钟,冷却,加氯仿30ml,超声处理10分钟,转入分液漏斗中,分取氯仿液,水液再用氯仿振摇提取2次,每次15ml,合并氯仿液,在80℃水浴上蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取滤液,即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液、对照产品供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
3、结果
结果表明,本发明绿及咳喘片中大黄素的含量为1.65-3.28mg/片;而原绿及咳喘颗粒中大黄素的含量为1.62mg/袋(每袋含颗粒剂10g),每次服用量2片的大黄素含量为原颗粒剂10g含量的2-4倍,在服用量减少的情况下,大黄素含量有很大提高。
上述研究表明,采用本发明制备方法制备的绿及咳喘片,有效成分含量远远高于WS-10616(ZD-0616)-2002标准记载的方法制备的绿及咳喘颗粒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明,以便本领域的技术人员更了解本发明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
取小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,萃取压力25MPa,温度40℃,CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间750min,得超临界萃取物,将超临界萃取物加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成200片,每片重0.50g。
经检测,成品中大黄素的含量为3.28mg/片。
实施例2
取小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%,萃取压力15MPa,温度30℃,CO2流量1ml/g生药·min,萃取时间900min,得超临界萃取物,将超临界萃取物加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成200片,每片重0.50g。
经检测,成品中大黄素的含量为1.65mg/片。
实施例3
取小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%,萃取压力30MPa,温度60℃,CO2流量3ml/g生药·min,萃取时间800min,得超临界萃取物,将超临界萃取物加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成200片,每片重0.50g。
经检测,成品中大黄素的含量为2.08mg/片。
实施例4:绿及咳喘片抑制人宫颈癌细胞U14细胞增殖的实验研究资料
1.实验材料
1.1实验用细胞株
小鼠宫颈癌细胞U14细胞,山东大学实验室细胞库,DMEM+10%FBS常规培养。
1.2实验药物
研究药物:本发明绿及咳喘片:按实施例1方法制备。
药液储液:称取100mg绿及咳喘片,溶于5ml无水乙醇中,0.2μm滤器过滤,500μldoff管分装,-20℃存储,同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
1.3实验试剂
DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419);NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387);Trypsin(AMRESCO公司);EDTA(AMRESCO公司);PenicillinGSodiumSalt(AMRESCO公司1);StreptomycinSulfate(AMRESCO);无水乙醇(淄博亚杜兰经贸有限公司);MTT(Biosharp批号:0793):PBS(实验室自配);
1.4实验器材
莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190);C02培养箱(FORMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号:SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Sprlng公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:KA-1000);0.2μm滤器(MILLIPORE型号:SLGP033RB);1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司);细胞计数板;离心管、移液管、Tips若干。
2.实验方法
1)U14细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%C02进行常规培养(10cm培养皿),当细胞生长至对数期时,收集细胞,弃去培养液,PBS轻洗3遍,加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37℃消化2min后,向其中加入5ml完全培养基中和反应,吹打细胞后将其转入离心管中,1000rpm离心5min,调整细胞悬液浓度3×104个/ml。
2)将细胞种入96孔培养板中,每孔加入细胞悬液180μl,培养板放入细胞培养箱中(37℃,5%C02)常规培养。
3)根据细胞生长情况,一般长至50%-70%,加入绿及咳喘片溶液,继续培养24h。
4)24h后加入20μlMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。
5)4h后扣板法倒去上清,用吸水纸轻轻拍干,每孔加入200μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
6)同时设置本底(不加细胞,只加培养液),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定6个复孔。
7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)、对照孔OD值×100%。实验重复3次。
3.统计处理
采用MicrosoftExcel2007软件中的相关分析和Studentt检验,数据以mean±S.D.表示。
4.实验结果
MTT法实验后统计结果显示,与对照组比较,当剂量达到5mg/ml时,对U14细胞增殖抑制有差异(P<0.05),剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01),当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。
表1绿及咳喘片对U14细胞增殖抑制影响研究(X±SD)
组别 药物浓度(mg/ml) 抑制率(%)
对照组 0 0
1 5 13.86±5.21
2 10 26.03±7.21*
3 15 38.24±8.92**
4 20 46.35±11.36**
注:与对照组比较,*P<0.01;**P<0.001。
5.实验结论
本发明的绿及咳喘片可以抑制U14细胞增殖,减少U14细胞的细胞生长数目,该作用呈剂量依赖性。

Claims (2)

1.绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用,所述绿及咳喘片由小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g作为原料药制成,其特征在于,所述绿及咳喘片的制备方法包括如下步骤:取小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%,萃取压力15-30MPa,温度30-50℃,CO2流量l-3ml/g生药·min,萃取时间700-800min,得超临界萃取物,将超临界萃取物加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成200片,每片重0.50g。
2.根据权利要求l所述的绿及咳喘片在制备抑制宫颈癌细胞U14细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述绿及咳喘片的制备方法包括如下步骤:取小绿芨200g、鸡矢藤200g、功劳木100g、通关藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黄精100g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,萃取压力25MPa,温度40℃,CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间750min,得超临界萃取物,将超临界萃取物加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成200片,每片重0.50g。
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