CN105624169A - 一种罗氏沼虾雌激素相关受体基因err及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR，该基因ERR的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1中所示，该基因ERR的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:2中所示。本发明还公开了重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR在环境内分泌干扰物壬基酚检测和污染评估中的应用，本发明罗氏沼虾ERR蛋白在自然水体环境内分泌干扰物如NP检测和污染评估方面具有重要的应用价值。

Description

一种罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR及其应用。

背景技术

雌激素相关受体ERRα和ERRβ最早是Giguere于1988年发现的，针对ERα的DNA结合域(DNAbindingdomain,DBD)的保守序列，用低严谨度杂交方法筛选到了这两个人类新基因，由于它们与雌激素受体(ER)有很强的同源性，故而得名。目前共发现ERR家族有三个成员，即ERRα(NR3B1)，ERRβ(NR3B2)和ERRγ(NR3B3)，它们和ER共同构成第三类核受体的一个亚族，与ER不同是，它们不与雌激素结合，对雌二醇等天然雌激素的刺激作用没有应答，研究认为ERR可以在没有配体存在的情况下与共激活子(coactivator)作用而激活目标基因的表达，所以它们被成为孤儿核受体。虽然ERR不与雌激素结合，但是最近的研究却表明它们参与ER信号通路，因而成为近期研究热点。

雌激素的生理效应主要是通过靶细胞特异性的细胞核受体－雌激素受体(estrogenreceptor,ER)α和β调节的，人们对两种雌激素受体亚型的分子基础和作用机制已经有了较为深入的认识。但在近年来的研究中人们逐渐发现：在某些对雌激素有高应答反应的组织中，却只表达低水平的ER，人们对一种与雌激素的效应也有着密切关系的雌激素相关受体(estrogenrelatedreceptor,ERR)的认识为上述问题的解决提供了新的重要的思路和方向。研究表明：ERR也参与了雌激素的复杂信号转导体系，对ERR作用机制及ERR活性调节因子的认识在雌激素相关生理和病理过程研究中有着重要的应用。

和多数核受体一样，ERR分子结构由位于N端的A/B区域、DNA结合域、铰链区D和配体结合域(ligand-bindingdomain,LBD)组成。N端的A/B区域有一个不依赖于配体的AF1(activationfunction1)，由于不同的剪辑方式会使ERRγ产生缺少AF-1的异构体，目前已经发现两种ERRγ的异构体，ERRγ1和ERRγ2，其中ERRγ2比ERRγ1在N端多23个氨基酸。DBD主要依靠其中的2个锌指结构与靶基因DNA的反应元件结合，而LBD是一个由12个α螺旋(H1～H12)形成的三明治式的结构，疏水性配体通常结合于一个称为配体结合袋(ligandbindingpocket,LBP)的结构中。配体依赖的转录激活由核受体中位于LBD的H12的AF2(activationfunction2)介导，即由H3、H4和H12形成的疏水表面与共激活子家族的LXXLL基序之间的相互作用完成。

近年来，环境内分泌干扰化学物(EDCs)逐渐成为越来越被重视的又一全球性的环境问题。它们的统一特点是引发机体毒性效应的剂量少，存在体内的潜伏期长，能够干扰生物体机体正常激素的产生、释放、转移、结合、代谢和消除过程，或者在未受损伤的生物或其后代中引起不良效应和内分泌功能改变。随着现代工业的发展，越来越多的人工合成化学物被排放入环境中，其中有70多种目前已有证据显示其具有内分泌干扰物作用，其中有很多都被认定具有雌激素的效应。环境雌激素在环境中分布极广，且不易降解，能在土壤和水体中长期残存，通过各种迁移、转化途经散布到世界各地；污染物能沿食物链传播，在机体内有一定的蓄积性，导致生物体产生过敏反应，引起免疫系统和生殖系统受损等综合病症。在众多的环境雌激素中，壬基酚(Nonylphenol，简称NP)是典型代表，因其环境污染效应非常严重而引起了人们的高度重视。NP是非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)的主要降解产物之一。NPEOs是一种性能优异的表面活性剂，广泛应用于化工、塑料、造纸、纺织等行业中。NPEOs本身毒性较小，而且没有十分明显的雌激素效应，之所以研究学者对其重视，主要是它的降解产物NP具有较强的脂溶性、疏水性和生物累积性。NP在环境中更稳定，更难降解。NP能影响体内激素的合成、释放、结合和转运等过程，干扰机体内分泌系统功能，影响血浆中激素水平的稳定，对正常机体生理活动产生不利影响，甚至影响到子代的发育。当环境雌激素进入生物体后，主要通过相关受体介导的通路发挥作用，与体内的雌激素受体竞争结合，占据雌激素的结合位点，抑制原有的雌激素发挥效应；还可影响与受体无关的细胞信号传递途径，如与细胞内生物大分子结合形成复合物，进入细胞核，导致DNA构象发生改变，导致下游基因表达紊乱，诱使机体生化反应改变，从而破坏了生物体的正常代谢、内分泌功能。

建立有效的、简便的、经济适用性的壬基酚检测方法是一项重要及紧迫的任务。目前，检测壬基酚的方法主要有气相色谱—质谱联用法和高效液相色谱法。但这两种直接测定的方法检测要求较严格，而且操作繁琐和费用高。目前关于壬基酚的检测更多偏向于生物的间接检测方法。如，胡建英等建立了用酵母双杂交系统筛选具有抗雌激素作用物质的生物学测试法，能对水中的工业酚类物质如4-NP和4-n-NP进行有效筛选和测定。但酵母双杂交系统的操作相对复杂，不利于广泛使用。因此需要开发便利的检测和评估方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR。

本发明的第二个目的是提供一种重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR及其制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR在环境内分泌干扰物壬基酚检测和污染评估中的应用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR，该基因ERR的核苷酸序列如SEQIDNO：1中所示。

该罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR的cDNA序列如具体实施例中所示。

该基因ERR的氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示。

作为本发明的一种改进：本发明还提供一种表达载体，所述的表达载体含有上述罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR的制备方法，包括用上述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR。

其中宿主细胞是大肠杆菌。

进一步的，本发明提供的重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR，包括用上述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR的步骤的方法制备。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR在环境内分泌干扰物壬基酚检测和污染评估中的应用。

本发明通过搜索EST数据库与虾类的基因组数据库，并进行基因RACE技术克隆，首次证实了虾类ERR基因的存在，并证实了壬基酚(NP)刺激能显著增加罗氏沼虾ERR基因表达，显示出了较强的雌激素效应，从而可以将其开发为一种新型环境内分泌干扰物检测抗体。用于环境内分泌干扰物如壬基酚等的检测和污染评估，检测雌激素相关受体活性物质具有活性高、用量少、来源方便、成本低、无毒副作用及序列短、易合成等优点，因此将有广阔的应用前景。

本发明具有如下优点：

(1)本发明方法利用反转录PCR技术从罗氏沼虾中克隆到了罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR即内分泌调控基因ERR，并构建了ERR的原核表达载体，可大量表达罗氏沼虾内分泌调控基因ERR所编码的蛋白；

(2)在本发明中，罗氏沼虾ERR蛋白能够在卵巢组织的大量表达，说明了ERR参与调控罗氏沼虾中其他内分泌调控基因的表达，丰富了虾类内分泌调控的系统信号通路理论，能为相关虾类性别调控的研究提供一定的理论依据；

(3)在本发明中，NP刺激能显著增加罗氏沼虾ERR基因表达，显示出了较强的雌激素效应，说明罗氏沼虾ERR蛋白在自然水体环境内分泌干扰物如NP检测和污染评估方面具有重要的应用价值。

附图说明

图1是实施例1中罗氏沼虾总RNA的电泳鉴定；

图2是实施例1中带酶切位点ERR基因ORF区域片段鉴定；

图3是实施例1中pET-32a(+)-ERR重组表达载体双酶切鉴定；

图4是实施例1中pET-32a(+)-ERR重组表达载体菌落PCR鉴定；

图5是实施例1中pET-32a(+)-ERR重组表达载体原核表达纯化的SDS-PAGE分析，A，含有His标签的融合蛋白；B，不含标签的ERR蛋白；

图6是实施例2中罗氏沼虾ERR的mRNA在不同组织的表达，E，眼柄；B，脑神经节；M，肌肉；Hp，肝胰腺；He，心脏；Go，性腺；Gi，鳃；

图7是实施例3中罗氏沼虾ERR基因在不同浓度NP暴露下的表达；

图8是实施例3中罗氏沼虾ERR蛋白在不同浓度NP暴露下的表达，A，本发明实施例1中构建的重组ERR蛋白；B，对照组；C，NP浓度5μg/L；D，NP浓度25μg/L；E，NP浓度125μg/L；M，蛋白标准品；

图9是实施例3中罗氏沼虾ERR蛋白表达与NP处理浓度的线性关系图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

1.罗氏沼虾总RNA的提取

取健康罗氏沼虾，以冰浴麻醉约2min后，解剖取样，立即分离出卵巢组织。采用Trizol试剂法提取获得罗氏沼虾总RNA，其OD_260/280＝1.91，电泳结果(图1)显示，28SrRNA，18SrRNA条带清晰，28S条带亮度为18S的两倍，表明所得总RNA未被蛋白质、酚和基因组DNA污染，纯度高。

2.cDNA第一链的合成

1)取出保存的罗氏沼虾RNA2μg，加入1μL的多聚胸腺嘧啶Oligo(dT)(10mM)，混匀后置于70℃中水浴5min；

2)冰上放置5min后，于冰上向EP管中先后加入dNTPMixture(10mM)2μL、5XRTBuffer4μL、Rnase抑制剂1μL(10U/μL)、Rnase-freeddH₂O8μL、ReverTraAce1μL；

3)将EP管置于PCR仪中，按30℃10min，42℃60min，99℃5min，4℃5min程序后瞬时离心，反转录得到第一链的单链cDNA，其核苷酸序列如下文中所示，于-20℃冰箱保存备用。

根据生物信息学中相关序列比对和结构分析结果，在基因ERR的cDNA序列中，以ORF序列在两端设计特异性引物，如下：

上游引物ERR-expressF：(下划线为BamHI位点)

5’-CGCGGATCCATGTTGATAATCAAGGTGTGCAT-3’

下游引物ERR-expressR：(下划线为EcoRI位点)

5’-CCGGAATTCTCACCGCATGTGTGATTCAAGC-3’。

以第一链cDNA为模板，采用上游引物ERR-expressF和下游引物ERR-expressR进行PCR扩增，获得不含非编码区的ERR基因，扩增片段大小为1374bp，其中阴影部分表示编码区，上下游两端分别为非编码区，编码区核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。电泳分离DNA片段，切胶回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至pMD-19T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序，测序结果经BLAST比对分析，比对结果表明目的产物确为基因ERR。

ERR基因cDNA全长1922bp，包含开放阅读框1374bp(169～1542bp)，编码457个氨基酸(终止密码子未编码)，相对分子质量约50kDa。

3、基因ERR原核表达载体的构建

提取含有基因ERR的pMD-19T载体质粒，分别经过内切酶BamHI和EcoRI的酶切，获得目的片段，将目的片段连接到经BamHI和EcoRI双酶切过的pET-11a质粒载体，pET-32a为带有His标签的原核表达载体，连接过程中采有连接酶T4DNALigase，温度37℃，连接反应12～16h。

将上述连接产物转化进入扩增宿主，大肠杆菌DH5α的感受态细胞，筛选培养，将获得的阳性单克隆菌落进行菌液PCR验证，PCR扩增的片段大小与目的片段大小一致，如图2所示，并将该阳性单菌落进行双酶切验证(图3)和测序验证，测序结果与目的片段序列一致，说明成功构建了ERR的原核重组表达载体pET-32a-ERR。

4、基因ERR的原核表达及纯化

1)转化表达宿主：

提取构建好的重组表达载体质粒(pET-32a-ERR)，将质粒转化进入表达宿主大肠杆菌BL21的感受态细胞，用含氨苄霉素(Amp)的培养基进行筛选培养，挑取阳性单克隆菌落，进行菌液PCR验证(如图4所示)，PCR扩增的片段大小与目的片段大小一致。验证正确后，以含Amp的培养基过夜扩大培养该阳性菌落，取菌液加入甘油，按8％甘油终浓度保存在-80度冰箱中，进行菌种保存。

2)重组蛋白的诱导表达及纯化

将含有重组表达载体(pET-32a-ERR)的大肠杆菌BL21先经过LB培养基的扩大培养，再经过2xYT培养基的二级扩大培养，当菌液OD₆₀₀值介于0.4～0.6之间时，取少量诱导前的菌液，作为后续实验的对照。剩下的菌液加入IPTG进行诱导培养，诱导培养后收集菌液，离心获得菌体，用5mL1×PBS悬浮菌体，取10μL悬浮菌液加入10μL2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀，100℃孵育10min，冰上放置5min，室温条件下，12000r/min离心5min分离上清和沉淀，蛋白样品-20℃冰箱保存备用。上述2xYT培养基配方为：胰蛋白胨(Tryptone)16g，酵母提取物(YeastExtract)10g，氯化钠5g，加水至1L，120℃高压灭菌20分钟。

取测序正确重组菌液1mL接种于400mL液体培养基(含氨苄青霉素，50μg/mL)中，37℃，200r/min培养至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，37℃，200r/min诱导4h，诱导后菌液离心，洗涤。分离得到上清用Bio-Rad蛋白质纯化仪进行纯化。如图5A所示，条带单一，蛋白大小符合预期，表明重组蛋白纯化效果良好。经凝血酶酶切后，去除His标签蛋白，得到重组ERR蛋白(即重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR)，如图5B所示。

实施例2

罗氏沼虾ERR基因的组织表达。

采用半定量PCR检测罗氏沼虾ERR基因在各种组织中的表达，结果如图6中所示，结果显示ERRmRNA在心脏、脑、卵巢中具有较高的表达；在肝胰腺，精巢和鳃中的表达量较弱；在肌肉和眼柄中检测不到表达信号。说明了ERR参与调控罗氏沼虾中神经调节和其他内分泌调控基因的表达，丰富了虾类内分泌调控的系统信号通路理论，能为相关虾类性别调控的研究提供一定的理论依据。

实施例3

罗氏沼虾在NP浸浴过程中ERR基因及其蛋白的表达变化。

将健康的性分化成熟初期雌性罗氏沼虾分配到4个规格一致的独立的塑料桶(50L)中，驯养一周后，加入NP(壬基酚)使得终浓度分别为0，5，25，125μg/L。每天07:00，17:00准时投喂商业饲料，保持水温，光照等条件相同，处理一周后，用酒精麻醉，经处死、收集卵巢样品，液氮速冻处理，并存放于-80℃超低温冰箱保存。将收集到的卵巢样本进行总RNA的提取，反转录，并进行荧光定量检测ERR基因的表达变化。

结果如图7中所示，图7中的结果表明：与对照组相比，三个处理组中ERR的mRNA表达量均显著增加。NP刺激能显著增加罗氏沼虾ERR基因表达，显示出了较强的雌激素效应，说明罗氏沼虾ERR蛋白在自然水体环境内分泌干扰物如NP检测方面具有重要的应用价值。

同时，分别取NP终浓度为0,5,25,125μg/L三组沼虾卵巢组织的2μg总蛋白和0.1μg凝血酶酶切后的重组ERR蛋白(作为标准物，实施例1中构建)同时上样,展开SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

根据体外重组ERR蛋白的指示，确定出罗氏沼虾卵巢总蛋白中的内源性ERR蛋白的电泳位置(图8)。结果显示：与对照组相比，NP处理组中内源性ERR的蛋白表达量根据浓度的增加而逐步增加，并且存在剂量依存关系。

根据着色的深浅进行光密度分析，获得不同处理组(未知NP浓度的待测样品)与标准组的光密度比值，然后乘以体外重组表达的罗氏沼虾ERR蛋白(0.1μg)的含量，计算出不同处理组的内源性ERR的蛋白含量依次分别为0.67μg(对照组)、0.18μg、0.55μg和0.92μg。最后，根据内源性ERR的含量的线性方程(可以从而推测和评估罗氏沼虾受NP作用的浓度和污染程度(图9)。

因此，NP刺激能显著增加罗氏沼虾ERR基因表达，显示出了较强的雌激素效应，反过来，可以采用本发明构建的重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR，作为参照物测得环境样品中内源性ERR的蛋白含量，从而根据建立的NP-ERR标准曲线，进一步可以测试得环境中NP的含量，说明罗氏沼虾ERR蛋白在自然水体环境内分泌干扰物如NP检测和评估方面等方面具有重要的应用价值。

因此，可以通过将本发明中的重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR用于检测和评估环境内分泌干扰物壬基酚的检测和评估方面等方面。

进一步的，例如通过一个普通的聚合酶链反应、标记蛋白测定或酶联免疫吸附测定就可以检测出结果，不需要大型精密仪器设备，操作简便可行，且可直接取样，即时检测，操作简单。

Claims (7)

1.一种罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR，其特征是：该基因ERR的核苷酸序列如SEQIDNO：1中所示。

2.一种罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR，其特征是：该基因ERR的氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示。

3.一种表达载体，其特征是：所述的表达载体含有权利要求1或2所述的罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR。

4.一种重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR的制备方法，其特征是：包括用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR。

5.根据权利要求4所述的重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR的制备方法，其特征是：其中宿主细胞是大肠杆菌。

6.一种重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR，其特征是：包括用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR的步骤的方法制备。

7.权利要求6所述的重组罗氏沼虾雌激素相关受体基因ERR在环境内分泌干扰物壬基酚检测和污染评估中的应用。