CN105574358A - 体外再现体内反应的系统 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物代谢技术领域，提供了体外再现体内反应的系统，包括：打开计算机，调取数据库内存储的相关体内代谢的动力学参数；针对只含有辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的最小代谢网络系统进行胞内和胞外的对比干实验；针对含有非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的无抑制代谢网络系统进行胞内和胞外的对比实验；在高、中、低三种抑制水平下，得出CI的浓度高低对NCI稳态水平的影响；通过调整该反应过程中酶的含量来模拟基因敲入、敲出实验得出酶量对NCI和反应速率的影响以及抑制机制、辅因子代谢中间物CI、酶的含量、非辅因子代谢中间物NCI对细胞内反应具有影响，进而得出胞外代谢反应系统。本发明弥补了行业空白。

Description

体外再现体内反应的系统

技术领域

本发明属于生物代谢技术领域，特别涉及一种体外再现体内反应的系统以及在生物等领域内的应用。

背景技术

生命体内的代谢过程是表现生命特征的唯一的方式，从基因表达，蛋白质的合成，到个体的生长，所有生命特征都是通过细胞代谢表现出来。因此了解代谢反应的内在机制对于揭示生命的全部过程是非常有必要的。

另一方面，体内(invivo)反应和体外(invitro)反应的区别是几百年来跨在人类面前的一条几乎难以逾越的鸿沟。科学家们可以清清楚楚地看见差不多所有的体内反应，组学数据已经大量积累，但是就是还没有人能够在体外重现一个体内反应系统。人类已经有能力(至少)部分组装基因组系统，但是还是无法复制在化学上了解近百年的代谢系统。目前，最前沿的代谢网络理论和方法顶多就是设法逼近细胞反应的某些性质，对“代谢启动/合成”和“代谢简化”这样的“合成生物学”的方向几乎没有实质性的促进。

目前，“合成生物学”着眼于基因组组装。即便如此，对于独立的细胞而言，基因复制所需的核苷酸和DNA合成酶只有通过合成代谢方能获得。目前，合成生物学研究者尽量绕开这一问题，代谢系统采用“借腹怀胎”的方法。

总的来说，胞内代谢反应的理解依然停留在静态理解代谢反应途径方面，而对于代谢反应网络动态特征的描述很少。

代谢网络包含几千个酶和大量的小分子化合物，这些小分子化合物的数量是在一千至一万之间。平均来说，每个小分子在胞内的含量都很低，为32uM。胞内必然有某种机制在保证反应速度的条件下使得胞内代谢物摩尔浓度很低。了解这种机制，将有助于人工复制代谢网络反应(可用于代谢工程改造)，甚至构建非天然的代谢网络系统(可用于合成生物学)。此外代谢网络大都处于稳态，稳态对于细胞的存活具有重要的意义，在生物工程领域，稳态是实现生物产品高产的首要前提。

因此，为了解决上述问题，生物代谢技术领域急需一种体外再现体内反应的系统。

发明内容

本发明提供了一种体外再现体内反应的系统，技术方案如下：

体外再现体内反应的系统，包括如下实验步骤：

步骤一，打开计算机，调取数据库内存储的相关酶反应动力学参数，然后根据体内反应机理，在计算机中实现体内代谢网络反应；

步骤二，针对只含有辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的最小代谢网络系统进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应的浓度随时间的变化曲线图，得出辅因子代谢中间物CI在体内代谢反应中发挥着全局性的作用，而且辅因子代谢中间物CI在胞内的摩尔含量位于不太高的稳态，胞内代谢与胞外代谢相比的产物得率至少100-1000倍；

步骤三，针对含有非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的代谢网络系统在零抑制、低抑制、中抑制和高抑制四种抑制水平下进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应浓度随时间的变化曲线图；

步骤四，通过将步骤三条件下得出的多幅浓度随时间的变化曲线图进行比较，得出如下结论：(1)引入抑制后的胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持稳态，稳态水平的高低由抑制强度的高低决定；(2)辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物NCI能否维持稳态的不可或缺的因素；综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维持稳态的两个重要因素，两者缺一不可；

步骤五，在高、中、低三种抑制水平下，通过调整CI在系统中的摩尔含量，得出CI的浓度高低对NCI稳态水平的影响，得出CI浓度越低，NCI稳态时的水平越低；

步骤六，针对步骤三的实验，通过调整该反应过程中酶的含量来模拟基因敲入、敲出实验，基因敲出实验能够通过设置酶量为零来模拟，得出酶量对非辅因子代谢中间物NCI的稳态摩尔含量和反应速率具有影响，而且能够定量的计算出代谢流对于不同酶的敏感程度；

步骤七，根据步骤二、步骤四至步骤六得出的结论，得出与胞内反应相一致的胞外代谢反应系统，具体如下：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，B和Q代表辅因子代谢物CI，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，Y₁抑制E₁，Y₂抑制E₂，Y₃抑制E₃，Y₄抑制E₅，Y₅抑制E₆，Y₆抑制E₇。

优选的，在上述体外再现体内反应的系统中，步骤一中根据体内反应机理，在计算机中实现体内代谢网络反应的具体步骤为：

已知在体内代谢网络中，双底物反应的比例为70-80％，第一、第二底物都过量，那么在体内代谢网络的反应中能够得到2个底物对酶的亲和性常数Km、1个酶的催化常数kcat以及最大反应速度Vmax；

Vmax＝e_1,0×kcat；

双底物的不可逆反应式为：S₁+B→P₁+Q，该反应中包含的基元反应为：

其中，k_1,1,k_1,-1,k_1,2,k_1,-2,k_1,3,k_1,-3k_1,4，k_1,-4均为酶反应的速率常数，S₁和B表示反应的底物，P₁和Q表示反应的产物，E₁表示酶，E₁B、E₁BS₁、E₁Q表示酶复合物；

根据酶定量守恒定量，总酶量e_1,0满足如下公式：

e_1,0＝e₁+e₁b+e₁bs₁+e₁q

e₁代表E₁的摩尔量，e₁b代表E₁B的摩尔量，e₁bs₁代表E₁BS₁的摩尔量，e₁q代表E₁Q的摩尔量；

由于上述双底物反应式中和为不可逆反应，因此，k_1,-3＝k_1,-4＝0；

P1的生成速率的具体计算公式为：

$r_{p_1}=\frac{e_{1,0}\frac{k_{1,3}{k}_{1,4}}{(k_{1,3}+k_{1,4})}{s}_{1}b}{\frac{k_{1,-1}(k_{1,-2}+k_{1,3})k_{1,4}}{k_{1,1}{k}_{1,2}(k_{1,3}+k_{1,4})}+\frac{k_{1,1}{k}_{1,4}(k_{1,-2}+k_{1,3})}{k_{1,1}{k}_{1,2}(k_{1,3}+k_{1,4})}b+\frac{k_{1,3}{k}_{1,4}}{k_{1,1}(k_{1,3}+k_{1,4})}{s}_1+{\mathrm{bs}}_1}---\left(1\right)$

其中，代表P₁的生成速率，s₁代表底物S₁的摩尔量，b代表底物B的摩尔量，由公式(1)可知，除了由底物B和S₁确定外，还由k_1,1,k_1,-1,k_1,2,k_1,-2,k_1,3,k_1,4和e_1,0确定；

$K_{mb}=\frac{k_{1,3}{k}_{1,4}}{k_{1,1}(k_{1,3}+k_{1,4})}---\left(2\right)$

其中，K_mb表示底物B对酶的亲和性常数，并且K_mb越大，代表底物B对酶的亲和性越低；

$k_{cat}=\frac{k_{1,3}{k}_{1,4}}{(k_{1,3}+k_{1,4})}---\left(3\right)$

其中，k_cat表示酶的催化常数，并且k_cat越大，代表没得催化效率越高；

$K_{ms1}=\frac{k_{1,4}(k_{1,-2}+k_{1,3})}{k_{1,2}(k_{1,3}+k_{1,4})}---\left(4\right)$

其中，K_ms1表示底物S₁对酶的亲和性常数，并且K_ms1越大，代表底物S₁对酶的亲和性越低；

首先，假设s₁＞＞b，同时将公式(2)和(3)代入公式公式(1)中，得出：

$r_{p_1}\≅\frac{e_{1,0}{k}_{cat}b}{K_{mb}+b}---\left(5\right)$

然后，将公式(3)除以公式(2)，得出k_1,1，具体如下：

$k_{1,1}=\frac{k_{cat}}{K_{mb}}---\left(6\right)$

由公式(6)可知，k_1,1为固定值；

进一步地，假设b＞＞s₁，同时将公式(2)和(3)代入公式公式(1)中，得出：

$r_{p_1}\≅\frac{e_{1,0}{k}_{cat}{s}_1}{K_{ms1}+s_1}---\left(7\right)$

进一步地，将公式(2)、(3)和(4)代入公式(1)中，得出：

$r_{p_1}=\frac{e_{1,0}{k}_{cat}{s}_{1}b}{\frac{k_{1,-1}{K}_{ms1}}{k_{1,1}}+K_{ms1}b+K_{mb}{s}_1+{\mathrm{bs}}_1}---\left(8\right)$

由公式(8)可知，除了由底物B和S₁确定外，还由总酶量e_1,0、酶的催化常数k_cat、底物对酶的亲和性常数K_ms1、K_mb以及酶反应的速率常数k_1,-1确定；因此，在给定底物浓度s₁、b以及产物的生成速率时，能够得出e_1,0,k_cat,K_ms1,K_mb,andk_1,-1的关系式，进而从计算机的数据库内提取出满足e_1,0,k_cat,K_ms1,K_mb,andk_1,-1的关系式酶反应动力学参数；

由公式(3)可知，在k_cat求得后，通过任意调整k_1,3和k_1,4的值，使其满足的定值即可；

将公式(4)除以公式(3)，得出：

$\frac{K_{ms1}}{k_{cat}}=\frac{(k_{1,-2}+k_{1,3})}{k_{1,2}{k}_{1,3}}---\left(9\right)$

由公式(9)可知，在满足K_ms1和k_cat一定的条件下，通过任意调整k_1,-2和k_1,3的值，使其满足的定值即可；

因此，由公式(1)至(9)可知，对于双底物反应，在得到米氏动力学常数k_cat、K_ms1、K_mb，能够求得k_1,1、k_1,-1、k_1,2、k_1,-2、k_1,3、k_1,-3、k_1,4和k_1,-4；同理，对于单底物或者三底物反应，当给定的动力学参数的个数少于需要的速率常数的个数时，能够按照公式(1)至(9)的方法，找到数据库参数和速率常数之间的联系，然后求得各个速率常数k，再完成步骤二的步骤。

优选的，在上述体外再现体内反应的系统中，步骤二的具体步骤为：

(A)胞内代谢网络与基元反应式：

(B)胞外代谢网络与基元反应式：

其中，(A)胞内代谢网络及与它相关的基元反应中，B和Q为一组辅因子代谢物CI，他们在网络中不断消耗和产生，且不会耗尽也不会被排出网络，因此B+Q是一个含量很低的常数；(B)胞外代谢网络及与它相关的基元反应中，(1)中的B和S1为底物，Q和P1为相应的产物；(2)中的Q和S2为底物，B和P2为产物；并且(1)中产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)中产生的B也不能被(1)做底物使用；

为了让(A)胞内代谢网络和(B)胞外代谢网络具有可比性，将S1-P1和S2-P2的反应线路设计成完全相同的；即：S₁＝S₂，P₁＝P₂，E₁＝E₂，B＝Q，k_1，j＝k_2，j，k_1，-j＝k_2，-j，j＝1，2，3，4；因此对于胞内反应来说，根据步骤一中获得的动力学参数进行筛选，得出最小代谢网络的相关动力学参数表格；

在阐述胞内代谢网络相比于胞外代谢网络的优势之前，首先将引入四个定义：反应速率、产物得率、相对产物得率和相对反应速率；其中，反应速率分为产物反应速率和底物反应速率基于CI的产物得率为q_CI(s^-1)，胞内反应系统的基于CI的产物得率为胞外反应系统的基于CI的产物得率为基于CI的相对产物得率为R_q/q，R_q/q是客观衡量胞内反应相对于胞外反应的效率的标准；CI的相对反应速率为R_r/r，R_r/r是客观衡量胞内反应相对与胞外反应的速率的标准，具体计算公式如下：

$\begin{array}{ccc}{r}_{p_i}=\frac{{\mathrm{\Δp}}_i}{\mathrm{\Δ}t}m& r_{s_i}=\frac{{\mathrm{\Δs}}_i}{\mathrm{\Δ}t},& i=1,2;\end{array}$

$q_{CI}^{in-vivo}=\frac{{\mathrm{\Δp}}_i^{in-vivo}}{{\mathrm{\Δt}}^{in-vivo}\·b_{ss}^{in-vivo}};$

$q_{CI}^{in-vitro}=\frac{{\mathrm{\Δp}}_i^{in-vitro}}{{\mathrm{\Δt}}^{in-vitro}\·b_0^{in-vitro}};$

$R_{q/q}=\frac{q_{CI}^{in-vivo}}{q_{CI}^{in-vitro}};$

$R_{r/r}=\frac{r_p^{in-vivo}}{r_p^{in-vitro}};$

其中，in-vivo表示胞内反应，in-vitro表示胞外反应，Δt表示反应时间，Δp_i表示从产物积累的角度衡量反应的进程，Δs_i表示从底物消耗的角度衡量反应的进程，b_ss是B在稳态时的值，b₀表示B与S1同时耗尽；

根据最小代谢网络的相关动力学参数表格中的数值以及反应物、产物、辅因子代谢中间物CI与时间的变化曲线进行比较，得出如下结论：(1)胞内和胞外代谢网络的反应时间Δt、底物的消耗量ΔS和产物的生成量ΔP完全相同，因此胞内反应相比于胞外反应的基于CI的产物得率根据上述反应结果，表明反应速率中的快反应和慢反应，虽然会影响反应时间，但不会影响基于CI的相对产物得率Rq/q，而底物的初始值会对相对反应速率有影响；(2)胞内和胞外代谢网络中B和Q随着S1和S2的消耗而不断的消耗，因此在这样的胞外系统中用B和Q的初始值来计算基于CI的产物得率更加准确合理；尽管这个最小代谢反应不是真实的，但是它展示了辅因子代谢中间物CI一定是发挥着全局和局部的作用，而且他们在胞内位于低浓度的稳态，胞内代谢相比与胞外代谢的产物得率至少为100-1000倍。

优选的，在上述体外再现体内反应的系统中，步骤三的具体步骤为：

(C)含有NCI、无抑制胞内代谢网络反应过程为：

(D)含有NCI、无抑制胞外代谢网络反应过程为：

(C)和(D)中含有NCI、无抑制胞内和胞外代谢网络的基元反应式：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，B和Q代表辅因子代谢物CI，但是在胞外代谢网络(1)产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)产生的B也不能被(1)作为底物使用，因此在胞外代谢网络中B和Q不具有辅因子代谢物CI的全局性作用，全局性是指(1)或(2)产生的B或Q都作为底物再次参加(2)或(1)的反应，即循环反应；

(E)含有NCI和产物抑制的胞内代谢网络的反应过程为：

(F)含有NCI和产物抑制的胞外代谢网络的反应过程为：

(E)和(F)中含有NCI和产物抑制的胞内和胞外代谢网络的基元反应为：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，Y₁抑制E₁，Y₂抑制E₂，Y₃抑制E₃，Y₄抑制E₅，Y₅抑制E₆，Y₆抑制E₇，B和Q代表辅因子代谢物CI，但是在胞外代谢网络(1)产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)产生的B也不能被(1)作为底物使用，因此胞外系统中B和Q，不具有辅因子代谢物CI的全局性作用，全局性是指(1)或(2)产生的B或Q都作为底物再次参加(2)或(1)的反应，即循环反应；

对于胞内反应来说，根据步骤一中获得的动力学参数进行筛选，得出含有NCI的相关动力学参数表格；

将步骤二的最小代谢网络与步骤三中的代谢网络相比较，得知：在最小代谢网络中，由于没有NCI，总是有ΔP^invivo＝ΔP^invitro且Δt^invivo＝Δt^invitro，然而在目前复杂的模型中不能使ΔP^invivo＝ΔP^invitro且Δt^invivo＝Δt^invitro同时成立，否则此时胞内反应中B和Q的摩尔含量将高达30mM左右；在真实的细胞内，渗透压的原因以及细胞摩尔含量的可调性决定了CI的摩尔含量不会太高，大肠内CI的平均含量是1.5mM；因此我们采取了降低反应速度或者降低CI的摩尔含量的方法，从而延长反应时间的方法来评价R_q/q；

由含有NCI的相关动力学参数表格得出，产物抑制一方面减小了产物得率，另一方面也减小了反应的速度；然而，当减小辅因子代谢中间物CI在代谢网络中的含量时，基于CI的相对产物得率却明显上升，虽然这其中伴随值反应速率的略微减小，但是这一损失对细胞来说是划算的；较低的CI摩尔含量提高了代谢的效率，增强了代谢物摩尔含量对代谢流的敏感性，降低了反应速率从而保证其他每一个代谢中间物的摩尔含量都被控制在较低的水平；总的来说这一结果与我们在最小代谢网络中的结果完全一致，从而进一步巩固了CI对与细胞维持高效代谢活动的全局性作用；

进一步地，根据参数绘制在胞内以及胞外代谢网络中非辅因子代谢中间物NCI、反应物和产物的对应物质的量随时间的变化曲线图；

优选的，在上述体外再现体内反应的系统中，步骤四的具体步骤为：在没有抑制的条件下，非辅因子代谢中间物NCI有的维持稳态，有的没有维持稳态；但是当引入抑制后，所有胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持稳态；稳态水平的高低则由抑制强度的高低来决定；

比较胞内反应和胞外反应，虽然胞外反应与对应的胞内反应有相同的抑制机制、抑制水平，但是并不是所有的NCI都有稳态，考虑此时胞内网络和胞外反应唯一的区别是前者包含CI而后者虽然包含CI，但是不具有CI的性质，相当于胞外网络不具有CI，因此唯一的区别在于胞内含有CI，因此得出结论：辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物NCI能否维持稳态的不可或缺的因素，而且CI摩尔含量越低，NCI稳态时的摩尔含量水平越低，综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维持稳态的两个重要因素，两者缺一不可。

优选的，在上述体外再现体内反应的系统中，步骤五的具体步骤为：在高、中、低三种抑制水平下以CI的浓度大小为自变量，得出CI浓度的改变对胞内系统中其他NCI稳态水平的影响；得出如下结论：NCI总体对CI的改变是很敏感的，当CI浓度很低时，NCI对CI的敏感度最强，因此能够通过降低CI的浓度，使得NCI水平降低，从而提高产物得率。

优选的，在上述体外再现体内反应的系统中，步骤六的具体步骤为：

绘制单底物和双底物中酶反应的酶含量对胞内网络中非辅因子代谢中间物NCI的摩尔含量随着时间的变化曲线图，得出在胞内网路中，酶量的影响是全局性的；增加酶量会使得前面的非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度下降，后面的非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度上升；同时由于B+Q是常数，降低B会使Q升高，从而将酶量的影响由局部扩大到全局；

酶量对反应速率会产生影响，酶量越大，反应速率越大，但是反应速率对不同酶的敏感程度不一样，因此，酶量不管是反应速率还是对非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度的影响都是全局性的。

优选的，在上述体外再现体内反应的系统中，还包括：步骤八，根据所述步骤七中得出的胞外代谢反应系统，将数据库内的相关体内代谢的动力学参数代入胞外代谢反应系统内，在计算机上进行大量的干反应，最终得出一组非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的加入量，使其性能最好，然后在实验室进行湿实验，对胞外代谢反应系统进行微调，得出最优的非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的加入量值，即为最优的胞外代谢反应系统。

本发明的有益效果：

1、本发明是一项既有着深刻的理论影响又有着新颖的实用意义的创造性工作，提出了一种在合成生物学和代谢网络方面的全新的思维模式，从而独创性的构建了一个可以复制并放大的的体外再现体内反应的系统而且本发明必将在基因工程，代谢工程和合成生物学等领域中发挥着重要作用，帮助人类解决日益面临的能源和环境问题，弥补了行业内的空白，具有重要的理论和实践意义。

2、本发明通过数值模拟显示了(a)CI类代谢物全内循环式代谢流的全局性效应，(b)NCI类代谢物等各种反馈抑制的局域性效应，(c)低CI水平更有利于提高胞内代谢反应的产物的得率；这些结果同时验证了本发明的正确性。

3、本发明还通过数值模拟显示了酶是如何全局性地影响代谢系统中所有代谢物和代谢通量的，为计算机模拟基因工程操作提高一个非常有效的方法。

4、应用本发明可以构建出完整的细胞代谢系统，通过调试或更改系统，具体为小规模或大规模的基因变更，来寻求最优目标条件或目标产品，为使用活细胞实验室工作的开展节约了大量的时间，降低了劳动量，节约了成本，使实验的安排更加科学。

5、本发明适用于计算机应用模拟基因或基因组变更以及合成生物学研究等领域，应用领域广泛，提高湿实验的效率，更高效的得到改良的菌种，人类需要的各种生物制品，以解决人类面临的各种能源、疾病和环境等问题；在合成in-silico细胞基础上，与基因组，转录组等网络相匹配，最终达到合成人类所需的某些特定的生命体或类生命体，具有更加广泛的适用性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明：

图1为体外再现体内反应的系统的流程图。

图2-5为在最小代谢网络系统中，辅因子代谢中间物CI、底物以及产物所对应物质的量随时间的变化曲线图。

图6为在含有辅因子代谢物的胞内代谢网络系统中，在高，中，低抑制水平下，CI的浓度对相对产物得率Rq/q和相对反应速率Rr/r的影响曲线图。

图7为在含有辅因子代谢物的代谢网络系统中，在零抑制水平，胞内系统和胞外系统中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、B、Q、底物S1、S2和产物P1、P2的反应进程图。

图8为在含有辅因子代谢物的代谢网络系统中，在低抑制水平，胞内系统和胞外系统中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、B、Q、底物S1、S2和产物P1、P2的反应进程图。

图9为在含有辅因子代谢物的代谢网络系统中，在中等抑制水平，胞内系统和胞外系统中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、B、Q、底物S1、S2和产物P1、P2的反应进程图。

图10为在含有辅因子代谢物的代谢网络系统中，在高抑制水平，胞内系统和胞外系统中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、B、Q、底物S1、S2和产物P1、P2的反应进程图。

图11为在含有辅因子代谢物的胞内代谢网络系统中，在高，中和低抑制水平下，胞内系统中辅因子代谢物B、Q的浓度对非辅因子代谢物Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6稳态浓度的影响曲线图。

图12为在含有辅因子代谢物的胞内代谢网络系统中，模拟基因敲入实验中逐渐增大E2和E3的含量对NCI、B、Q稳态水平的影响曲线图。

图13为在含有辅因子代谢物的胞内代谢网络系统中，模拟基因敲入实验，逐渐增大E2和E3的含量对流过2条代谢途径的代谢流的影响曲线图。

具体实施方式

为了使本发明技术实现的措施、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

图1为体外再现体内反应的系统的流程图。

如图1所示，本发明的一种体外再现体内反应的系统，包括如下步骤：

步骤一，打开计算机，调取数据库内存储的相关酶反应动力学参数，然后根据体内反应机理，在计算机中实现体内代谢网络反应；

步骤二，针对只含有辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的最小代谢网络系统进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应的浓度随时间的变化曲线图，得出辅因子代谢中间物CI在体内代谢反应中发挥着全局性的作用，而且辅因子代谢中间物CI在胞内的摩尔含量位于不太高的稳态，胞内代谢与胞外代谢相比的产物得率约为100-1000倍；

步骤三，针对含有非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的代谢网络系统在零抑制、低抑制、中抑制和高抑制四种抑制水平下进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、底物以及产物所对应浓度随时间的变化曲线图；

步骤四，通过将步骤三条件下得出的多幅浓度随时间的变化曲线图进行比较，得出如下结论：(1)引入抑制后的胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持稳态，稳态水平的高低由抑制强度的高低决定；(2)辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物NCI能否维持稳态的不可或缺的因素；综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维持稳态的两个重要因素，两者缺一不可；

步骤五，在高、中、低三种抑制水平下，通过调整CI在系统中的摩尔含量，得出CI的浓度高低对NCI稳态水平的影响，得出CI浓度越低，NCI稳态时的水平越低；

步骤六，针对步骤三的实验，通过调整该反应过程中酶的含量来模拟基因敲入、敲出实验，基因敲出实验能够通过设置酶量为零来模拟，得出酶量对非辅因子代谢中间物NCI的稳态摩尔含量和反应速率具有影响，而且能够定量的计算出代谢流对于不同酶的敏感程度；

步骤七，根据步骤二、步骤四至步骤六得出的结论，得出与胞内反应相一致的胞外代谢反应系统，具体如下：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，B和Q代表辅因子代谢物CI，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，Y₁抑制E₁，Y₂抑制E₂，Y₃抑制E₃，Y₄抑制E₅，Y₅抑制E₆，Y₆抑制E₇。

实施例2：

图1是体外再现体内反应的系统的流程图。

如图1所示，体外再现体内反应的系统，包括如下步骤：

步骤一，打开计算机，调取数据库内存储的相关酶反应动力学参数，然后根据体内反应机理，在计算机中实现体内代谢网络反应；

已知在体内代谢网络中，双底物反应的比例为70-80％，第一、第二底物都过量，那么在体内代谢网络的反应中能够得到2个底物对酶的亲和性常数Km、1个酶的催化常数kcat以及最大反应速度Vmax；

Vmax＝e_1,0×kcat；

双底物的不可逆反应式为：S₁+B→P₁+Q，该反应中包含的基元反应为：

其中，k_1,1,k_1,-1,k_1,2,k_1,-2,k_1,3,k_1,-3k_1,4，k_1,-4均为酶反应的速率常数，S₁和B表示反应的底物，P₁和Q表示反应的产物，E₁表示酶，E₁B、E₁BS₁、E₁Q表示酶复合物；

根据酶定量守恒定量，总酶量e_1,0满足如下公式：

e_1,0＝e₁+e₁b+e₁bs₁+e₁q

e₁代表E₁的摩尔量，e₁b代表E₁B的摩尔量，e₁bs₁代表E₁BS₁的摩尔量，e₁q代表E₁Q的摩尔量；

由于上述双底物反应式中和为不可逆反应，因此，k_1,-3＝k_1,-4＝0；

P1的生成速率的具体计算公式为：

$r_{p_1}=\frac{e_{1,0}\frac{k_{1,3}{k}_{1,4}}{(k_{1,3}+k_{1,4})}{s}_{1}b}{\frac{k_{1,-1}(k_{1,-2}+k_{1,3})k_{1,4}}{k_{1,1}{k}_{1,2}(k_{1,3}+k_{1,4})}+\frac{k_{1,1}{k}_{1,4}(k_{1,-2}+k_{1,3})}{k_{1,1}{k}_{1,2}(k_{1,3}+k_{1,4})}b+\frac{k_{1,3}{k}_{1,4}}{k_{1,1}(k_{1,3}+k_{1,4})}{s}_1+{\mathrm{bs}}_1}---\left(1\right)$

其中，代表P₁的生成速率，s₁代表底物S₁的摩尔量，b代表底物B的摩尔量，由公式(1)可知，除了由底物B和S₁确定外，还由k_1,1,k_1,-1,k_1,2,k_1,-2,k_1,3,k_1,4和e_1,0确定；

$K_{mb}=\frac{k_{1,3}{k}_{1,4}}{k_{1,1}(k_{1,3}+k_{1,4})}---\left(2\right)$

其中，K_mb表示底物B对酶的亲和性常数，并且K_mb越大，代表底物B对酶的亲和性越低；

$k_{cat}=\frac{k_{1,3}{k}_{1,4}}{(k_{1,3}+k_{1,4})}---\left(3\right)$

其中，k_cat表示酶的催化常数，并且k_cat越大，代表没得催化效率越高；

$K_{ms1}=\frac{k_{1,4}(k_{1,-2}+k_{1,3})}{k_{1,2}(k_{1,3}+k_{1,4})}---\left(4\right)$

其中，K_ms1表示底物S₁对酶的亲和性常数，并且K_ms1越大，代表底物S₁对酶的亲和性越低；

首先，假设s₁＞＞b，同时将公式(2)和(3)代入公式公式(1)中，得出：

$r_{p_1}\≅\frac{e_{1,0}{k}_{cat}b}{K_{mb}+b}---\left(5\right)$

然后，将公式(3)除以公式(2)，得出k_1,1，具体如下：

$k_{1,1}=\frac{k_{cat}}{K_{mb}}---\left(6\right)$

由公式(6)可知，k_1,1为固定值；

进一步地，假设b＞＞s₁，同时将公式(2)和(3)代入公式公式(1)中，得出：

$r_{p_1}\≅\frac{e_{1,0}{k}_{cat}{s}_1}{K_{ms1}+s_1}---\left(7\right)$

进一步地，将公式(2)、(3)和(4)代入公式(1)中，得出：

$r_{p_1}=\frac{e_{1,0}{k}_{cat}{s}_{1}b}{\frac{k_{1,-1}{K}_{ms1}}{k_{1,1}}+K_{ms1}b+K_{mb}{s}_1+{\mathrm{bs}}_1}---\left(8\right)$

由公式(8)可知，除了由底物B和S₁确定外，还由总酶量e_1,0、酶的催化常数k_cat、底物对酶的亲和性常数K_ms1、K_mb以及酶反应的速率常数k_1,-1确定；因此，在给定底物浓度s₁、b以及产物的生成速率时，能够得出e_1,0,k_cat,K_ms1,K_mb,andk_1,-1的关系式，进而从计算机的数据库内提取出满足e_1,0,k_cat,K_ms1,K_mb,andk_1,-1的关系式酶反应动力学参数；

由公式(3)可知，在k_cat求得后，通过任意调整k_1,3和k_1,4的值，使其满足的定值即可；

将公式(4)除以公式(3)，得出：

$\frac{K_{ms1}}{k_{cat}}=\frac{(k_{1,-2}+k_{1,3})}{k_{1,2}{k}_{1,3}}---\left(9\right)$

由公式(9)可知，在满足K_ms1和k_cat一定的条件下，通过任意调整k_1,-2和k_1,3的值，使其满足的定值即可；

因此，由公式(1)至(9)可知，对于双底物反应，在得到米氏动力学常数k_cat、K_ms1、K_mb，能够求得k_1,1、k_1,-1、k_1,2、k_1,-2、k_1,3、k_1,-3、k_1,4和k_1,-4；同理，对于单底物或者三底物反应，当给定的动力学参数的个数少于需要的速率常数的个数时，能够按照公式(1)至(9)的方法，找到数据库参数和速率常数之间的联系，然后求得各个速率常数k，再完成步骤二的步骤；

步骤二，针对只含有辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的最小代谢网络系统进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应的浓度随时间的变化曲线图，图2-5为在最小代谢网络系统中，辅因子代谢中间物CI、底物以及产物所对应物质的量随时间的变化曲线图，如图2-5所示，得出辅因子代谢中间物CI在体内代谢反应中发挥着全局性的作用，而且辅因子代谢中间物CI在胞内的摩尔含量位于不太高的稳态，胞内代谢与胞外代谢相比的产物得率至少100-1000倍；具体如下：

(A)胞内代谢网络与基元反应式：

(B)胞外代谢网络与基元反应式：

其中，(A)胞内代谢网络及与它相关的基元反应中，B和Q为一组辅因子代谢物CI，他们在网络中不断消耗和产生，且不会耗尽也不会被排出网络，因此B+Q是一个含量很低的常数；(B)胞外代谢网络及与它相关的基元反应中，(1)中的B和S1为底物，Q和P1为相应的产物；(2)中的Q和S2为底物，B和P2为产物；并且(1)中产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)中产生的B也不能被(1)做底物使用；

为了让(A)胞内代谢网络和(B)胞外代谢网络具有可比性，将S1-P1和S2-P2的反应线路设计成完全相同的；即：S₁＝S₂，P₁＝P₂，E₁＝E₂，B＝Q，k_1，j＝k_2，j，k_1，-j＝k_2，-j，j＝1，2，3，4；因此对于胞内反应来说，根据步骤一中获得的动力学参数进行筛选，得出如表一中所呈现出的最小代谢网络的相关动力学参数，具体数据见下表：

表一最小代谢模型反应的相关动力学参数和初始条件

动力学参数/参数条件	慢反应	快反应
			k1，1＝k2，1(mMs)-1	105	105
k1，-1＝k2，-1(s-1)	6.67×103	6.67×103
			k1，2＝k2，2(mMs)-1	1.33×105	1.33×105
k1，-2＝k2，-2(s-1)	4.56×104	4.56×104
			k1，3＝k2，3(s-1)	133	1330
k1，-3＝k2，-3	0	0
			k1，4＝k2，4(s-1)	100	1000
k1，-4＝k2，-4	0	0
			S1＝S2(mM)	100或500	100或500
P1＝P2	0	0
			E1＝E2(mM)	0.013	0.013
酶反应中间体	0	0

在阐述胞内代谢网络相比于胞外代谢网络的优势之前，首先将引入四个定义：反应速率、基于CI的产物得率、基于CI的相对产物得率和相对反应速率；其中，反应速率分为产物反应速率和底物反应速率基于CI的产物得率为q_CI(s^-1)，胞内反应系统的基于CI的产物得率为胞外反应系统的基于CI的产物得率为基于CI的相对产物得率为R_q/q，R_q/q是客观衡量胞内反应相对于胞外反应的效率的标准；CI的相对反应速率为R_r/r，R_r/r是客观衡量胞内反应相对与胞外反应的速率的标准，具体计算公式如下：

$\begin{array}{ccc}{r}_{p_i}=\frac{{\mathrm{\Δp}}_i}{\mathrm{\Δ}t}m& r_{s_i}=\frac{{\mathrm{\Δs}}_i}{\mathrm{\Δ}t},& i=1,2;\end{array}$

$q_{CI}^{in-vivo}=\frac{{\mathrm{\Δp}}_i^{in-vivo}}{{\mathrm{\Δt}}^{in-vivo}\·b_{ss}^{in-vivo}};$

$q_{CI}^{in-vitro}=\frac{{\mathrm{\Δp}}_i^{in-vitro}}{{\mathrm{\Δt}}^{in-vitro}\·b_0^{in-vitro}};$

$R_{q/q}=\frac{q_{CI}^{in-vivo}}{q_{CI}^{in-vitro}};$

$R_{r/r}=\frac{r_p^{in-vivo}}{r_p^{in-vitro}};$

其中，in-vivo表示胞内反应，in-vitro表示胞外反应，Δt表示反应时间，Δp_i表示从产物积累的角度衡量反应的进程，Δs_i表示从底物消耗的角度衡量反应的进程，b_ss为B在胞内反应系统中稳态时的值，b₀为胞外反应中B的初始值，一般情况下应该保证加入的b₀与底物S1同时耗尽；

我们在多种不同的外界条件比较了相对产物得率包括：低底物摩尔含量S＝100mM和高底物摩尔含量S＝500mM，慢反应k_1，3＝133(s^-1)和k_1，4＝100(s^-1)，快反应k_2，3＝1330(s^-1)和k_2，4＝1000(s^-1)，在最小代谢网络中，和几乎相同，且Δt^{in vivo}和Δt^invitro几乎相同，当S₀＝100时，Rq/q＝133，S₀＝500时，Rq/q＝666，具体数值如表二；

表二最小胞内代谢网络和相应的胞外代谢网络计算的初始条件和结果

根据表二中的数值以及图1中的反应物、产物、辅因子代谢中间物CI与时间的变化曲线进行比较，得出如下结论：(1)A(b),B(b),C(b),D(b)表明胞内和胞外代谢网络的反应时间Δt、底物的消耗量ΔS和产物的生成量ΔP完全相同，因此胞内反应相比于胞外反应的基于CI的产物得率根据上述反应结果，表明反应速率中的快反应和慢反应，虽然会影响反应时间，但不会影响基于CI的相对产物得率Rq/q，而底物的初始值会对相对反应速率有影响；(2)根据A(a),B(a),C(a),D(a)曲线图，表明胞内和胞外代谢网络中B和Q随着S1和S2的消耗而不断的消耗，因此在这样的胞外系统中用B和Q的初始值来计算基于CI的产物得率更加准确合理；尽管这个最小代谢反应不是真实的，但是它展示了辅因子代谢中间物CI一定是发挥着全局的作用，而且他们在胞内位于低浓度的稳态，如表二和图2-5所示，当S₀＝100mM时，Rq/q＝133，快反应反应时间为13.6s,慢反应为136s，S₀＝500mM时，Rq/q＝666,快反应反应时间为68s,慢反应为680s；而且根据实际反应时间来看，底物浓度几乎不能在降低，但如果底物浓度S₀继续升高至1000mM，将会使得胞外反应所需要的b₀同时升高至1000mM升高，这将使得基于CI的产物得率反应Rq/q由666升高到1332。因此保守估计胞内代谢相比与胞外代谢的产物得率至少为100-1000倍；

步骤三，针对含有非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的代谢网络系统在零抑制、低抑制、中抑制和高抑制四种抑制水平下进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应浓度随时间的变化曲线图，如图6-8所示，图6为在含有辅因子代谢物的胞内代谢网络系统中，在高，中，低抑制水平下，CI的浓度对相对产物得率Rq/q和相对反应速率Rr/r的影响曲线图；图7为在含有辅因子代谢物的代谢网络系统中，在零抑制水平，胞内系统和胞外系统中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、B、Q、底物S1、S2和产物P1、P2的反应进程图；图8为在含有辅因子代谢物的代谢网络系统中，在低抑制水平，胞内系统和胞外系统中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、B、Q、底物S1、S2和产物P1、P2的反应进程图；

(C)含有NCI、无抑制胞内代谢网络反应过程为：

(D)含有NCI、无抑制胞外代谢网络反应过程为：

(C)和(D)中含有NCI、无抑制胞内和胞外反系统的基元反应为：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，B和Q代表辅因子代谢物CI，但是在胞外代谢网络(1)产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)产生的B也不能被(1)作为底物使用，因此胞外系统中B和Q，不具有辅因子代谢物CI的全局性作用，全局性是指(1)或(2)产生的B或Q都作为底物再次参加(2)或(1)的反应，即循环反应；

(E)含有NCI和产物抑制的胞内代谢网络的反应过程为：

(F)含有NCI和产物抑制的胞外代谢网络的反应过程为：

(E)和(F)中含有NCI和产物抑制的胞内和胞外代谢网络的基元反应为：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，Y₁抑制E₁，Y₂抑制E₂，Y₃抑制E₃，Y₄抑制E₅，Y₅抑制E₆，Y₆抑制E₇，B和Q代表辅因子代谢物CI，但是在胞外代谢网络(1)产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)产生的B也不能被(1)作为底物使用，因此胞外系统中B和Q，不具有辅因子代谢物CI的全局性作用，全局性是指(1)或(2)产生的B或Q都作为底物再次参加(2)或(1)的反应，即循环反应；

对于胞内和胞外网络反应来说，根据步骤一中获得的动力学参数进行筛选，得出如表三中所呈现出含有NCI的相关动力学参数及初始条件，具体数据见下表三：

表三含有NCI的相关动力学参数和初始条件

将步骤二中的最小代谢网络与步骤三中的代谢网络相比较，得知：在最小代谢网络中，由于没有NCI，总是有ΔP^invivo＝ΔP^invitro且Δt^invivo＝Δt^invitro，然而在目前复杂的模型中不能使ΔP^invivo＝ΔP^invitro且Δt^invivo＝Δt^invitro同时成立，否则此时胞内反应中B和Q的摩尔含量将高达30mM左右；在真实的细胞内，渗透压的原因以及细胞摩尔含量的可调性决定了CI的摩尔含量不会太高，大肠内CI的平均含量是1.5mM；因此我们采取了降低反应速度或者降低CI的摩尔含量的方法，从而延长反应时间的方法来评价R_q/q；

当s＝500mM时,使用表三中的动力学参数和初始条件，在高、中、低三个不同抑制水平的条件下绘制基于CI的相对产物得率和相对速率变化曲线，如图2-5所示；

根据图2-5可知，低抑制水平时，当B＝1mM、0.1mM和0.05mM时,Rq/q分别为：7.5×10²，6.1×10³和1.1×10⁴，而此时Rr/r分别为0.97，0.8，0.7；高抑制水平时，如果B＝1mM、0.1mM和0.05mM时,Rq/q分别为：3.5×10²，1.4×10³和2.1×10³，Rr/r分别为0.35，0.14，0.14；因此，得出产物抑制一方面减小了产物得率，另一方面也减小了反应的速度；然而，当减小辅因子代谢中间物CI在代谢网络中的含量时，基于CI的相对产物得率却明显上升，虽然这其中伴随着应速率的略微减小，但是这一损失对细胞来说是划算的；较低的CI摩尔含量提高了代谢的效率，增强了代谢流对代谢物摩尔含量对的敏感性，降低了反应速率从而保证其他每一个代谢中间物的摩尔含量都被控制在较低的水平；总的来说这一结果与我们在最小代谢网络中的结果完全一致，从而进一步巩固了CI对与细胞维持高效代谢活动的全局性作用；

进一步地，根据表三中的参数绘制在胞内以及胞外代谢网络中非辅因子代谢中间物NCI、反应物和产物的对应物质的量随时间的变化曲线图，如图6-10，图9为在含有辅因子代谢物的代谢网络系统中，在中等抑制水平，胞内系统和胞外系统中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、B、Q、底物S1、S2和产物P1、P2的反应进程图，图10为在含有辅因子代谢物的代谢网络系统中，在高抑制水平，胞内系统和胞外系统中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、B、Q、底物S1、S2和产物P1、P2的反应进程图；

步骤四，通过将步骤三条件下得出的多幅浓度随时间的变化曲线图进行比较，得出如下结论：(1)引入抑制后的胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持稳态，稳态水平的高低由抑制强度的高低决定；(2)辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物NCI能否维持稳态的不可或缺的因素；综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维持稳态的两个重要因素，两者缺一不可，具体解释如下；

根据图6和表三可知，在没有抑制的条件下，非辅因子代谢中间物NCI除了Y1和Y4没有维持稳态外，Y2、Y3、Y5和Y6都能维持稳态；但是当引入抑制后，根据图8-10所示，所有胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持的稳态；至于稳态水平的高低则由抑制强度的高低来决定；

比较图7-10中的胞内反应和胞外反应，虽然胞外反应与对应的胞内反应有相同的抑制机制、抑制水平，但是并不是所有的NCI都有稳态，图7-10胞外反应系统中Y1和Y4仍然没有稳态，考虑此时胞内网络和胞外反应唯一的区别是前者包含CI而后者虽然包含CI，但是不具有CI的性质，相当于胞外网络不具有CI，因此唯一的区别在于胞内含有CI，因此得出结论：辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物NCI能否维持稳态的不可或缺的因素，而且CI摩尔含量越低，NCI稳态时的摩尔含量水平越低，综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维持稳态的两个重要因素，两者缺一不可；

步骤五，在高、中、低三种抑制水平下，通过调整CI在系统中的摩尔含量，得出CI的浓度高低对NCI稳态水平的影响，得出CI浓度越低，NCI稳态时的水平越低；

在高、中、低三种抑制水平下以CI的浓度大小为自变量，得出CI浓度的改变对胞内系统中其他NCI稳态水平的影响，得出如下结论：NCI总体对CI的改变是很敏感的，当CI浓度很低时，NCI对CI的敏感度最强，因此能够通过降低CI的浓度，使得NCI水平降低，从而提高产物得率；

步骤六，针对步骤三的实验，通过调整该反应过程中酶的含量来模拟基因敲入、敲出实验，基因敲出实验能够通过设置酶量为零来模拟，得出酶量对非辅因子代谢中间物NCI的稳态摩尔含量和反应速率具有影响，而且能够定量的计算出代谢流对于不同酶的敏感程度，具体解释如下：

图11为在含有辅因子代谢物的胞内代谢网络系统中，在高，中和低抑制水平下，胞内系统中辅因子代谢物B、Q的浓度对非辅因子代谢物Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6稳态浓度的影响曲线图，图12为在含有辅因子代谢物的胞内代谢网络系统中，模拟基因敲入实验中逐渐增大E2和E3的含量对NCI、B、Q稳态水平的影响曲线图，图13为在含有辅因子代谢物的胞内代谢网络系统中，模拟基因敲入实验，逐渐增大E2和E3的含量对流过2条代谢途径的代谢流的影响曲线图；

绘制Y1单底物和Y2双底物酶反应中酶含量对胞内网络中非辅因子代谢中间物NCI的摩尔含量随着时间的变化曲线图，如图11所示；根据图11可知，在胞内网络中，酶量的影响是全局性的，而人们之前基本认为酶量的作用是局部性的；增加E2的量使得Y2、Y3、Y4、Y5、Y6和Q的稳态浓度上升，而Y1和B的稳态浓度下降；根据图12所示，增加E3的量使得Y3、Y4、Y5、Y6和Q的稳态浓度上升，而Y1、Y2和B的稳态浓度下降；因此得出增加酶量会使得前面的非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度下降，后面的非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度上升；同时由于B+Q是常数，降低B会使Q升高，从而将酶量的影响由局部扩大到全局；根据图13可知，酶量对反应速率会产生影响，酶量越大，反应速率越大，但是反应速率对不同酶的敏感程度不一样，反应速率对E2比E3更敏感；计算代谢流控制系数fluxcontrolcoefficients，简称FCC，可知：当e_2,0＝0.006和0.012mM时，FCC分别为0.295和0.151,当e_3,0＝0.06和0.12mM，FCC分别为0.106和0.073；因此，酶量不管是反应速率还是对非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度的影响都是全局性的；而且证明通过计算机模拟基因敲入或敲出是可行的，这一做法必将极大的提高基因工程湿实验的效率；

步骤七，根据步骤二、步骤四至步骤六得出的结论，得出与胞内反应相一致的胞外代谢反应系统，具体如下：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，B和Q代表辅因子代谢物CI，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，Y₁抑制E₁，Y₂抑制E₂，Y₃抑制E₃，Y₄抑制E₅，Y₅抑制E₆，Y₆抑制E₇；

步骤八，根据步骤七中得出的胞外代谢反应系统，将数据库内的相关体内代谢的动力学参数代入胞外代谢反应系统内，在计算机上进行大量的干反应，最终得出一组非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的加入量，使其性能最好，然后在实验室进行湿实验，对胞外代谢反应系统进行微调，得出最优的非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的加入量值，即为最优的胞外代谢反应系统。

本发明是一项既有着深刻的理论影响又有着新颖的实用意义的创造性工作，提出了一种在合成生物学和代谢网络方面的全新的思维模式，从而独创性的构建了一个可以复制并放大的的体外再现体内反应的系统而且本发明必将在基因工程，代谢工程和合成生物学等领域中发挥着重要作用，帮助人类解决日益面临的能源和环境问题，弥补了行业内的空白，具有重要的理论和实践意义。

本发明通过数值模拟显示了(a)：CI类代谢物全内循环式代谢流的全局性效应，(b)：NCI类代谢物等各种反馈抑制的局域性效应，(c)：低CI水平更有利于提高胞内代谢反应的产物的得率；这些结果同时验证了本发明的正确性。

本发明还通过数值模拟显示了酶是如何全局性地影响代谢系统中所有代谢物和代谢通量的，为计算机模拟基因工程操作提高一个非常有效的方法。

应用本发明可以构建出完整的细胞代谢系统，通过调试或更改系统，具体为小规模或大规模的基因变更，来寻求最优目标条件或目标产品，为使用活细胞实验室工作的开展节约了大量的时间，降低了劳动量，节约了成本，使实验的安排更加科学。

本发明适用于计算机应用模拟基因或基因组变更以及合成生物学研究等领域，应用领域广泛，提高湿实验的效率，更高效的得到改良的菌种，人类需要的各种生物制品，以解决人类面临的各种能源、疾病和环境等问题；在合成in-silico细胞基础上，与基因组，转录组等网络相匹配，最终达到合成人类所需的某些特定的生命体或类生命体，具有更加广泛的适用性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点.本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内.本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.体外再现体内反应的系统，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，打开计算机，调取数据库内存储的相关酶反应动力学参数，然后根据体内反应机理，在计算机中实现体内代谢网络反应；

步骤二，针对只含有辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的最小代谢网络系统进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应的浓度随时间的变化曲线图，得出辅因子代谢中间物CI在体内代谢反应中发挥着全局性的作用，而且辅因子代谢中间物CI在胞内的摩尔含量位于不太高的稳态，胞内代谢与胞外代谢相比的产物得率至少100-1000倍；

步骤三，针对含有非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的代谢网络系统在零抑制、低抑制、中抑制和高抑制四种抑制水平下进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应浓度随时间的变化曲线图；

步骤四，通过将步骤三条件下得出的多幅浓度随时间的变化曲线图进行比较，得出如下结论：(1)引入抑制后的胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持稳态，稳态水平的高低由抑制强度的高低决定；(2)辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物NCI能否维持稳态的不可或缺的因素；综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维持稳态的两个重要因素，两者缺一不可；

步骤五，在高、中、低三种抑制水平下，通过调整CI在系统中的摩尔含量，得出CI的浓度高低对NCI稳态水平的影响，得出CI浓度越低，NCI稳态时的水平越低；

步骤六，针对所述步骤三的实验，通过调整该反应过程中酶的含量来模拟基因敲入、敲出实验，基因敲出实验能够通过设置酶量为零来模拟，得出酶量对非辅因子代谢中间物NCI的稳态摩尔含量和反应速率具有影响，而且能够定量的计算出代谢流对于不同酶的敏感程度；

步骤七，根据所述步骤二、步骤四至步骤六得出的结论，得出与胞内反应相一致的胞外代谢反应系统，具体如下：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，B和Q代表辅因子代谢物CI，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，Y₁抑制E₁，Y₂抑制E₂，Y₃抑制E₃，Y₄抑制E₅，Y₅抑制E₆，Y₆抑制E₇。

2.根据权利要求1所述的体外再现体内反应的系统，其特征在于，所述步骤一的具体步骤为：

已知在体内代谢网络中，双底物反应的比例为70-80％，第一、第二底物都过量，那么在体内代谢网络的反应中能够得到2个底物对酶的亲和性常数Km、1个酶的催化常数kcat以及最大反应速度Vmax；

Vmax＝e_1,0×kcat；

双底物的不可逆反应式为：S₁+B→P₁+Q，该反应中包含的基元反应为：

其中，k_1,1,k_1,-1,k_1,2,k_1,-2,k_1,3,k_1,-3k_1,4，k_1,-4均为酶反应的速率常数，S₁和B表示反应的底物，P₁和Q表示反应的产物，E₁表示酶，E₁B、E₁BS₁、E₁Q表示酶复合物；

根据酶定量守恒定量，总酶量e_1,0满足如下公式：

e_1,0＝e₁+e₁b+e₁bs₁+e₁q

其中，e₁代表E₁的摩尔量，e₁b代表E₁B的摩尔量，e₁bs₁代表E₁BS₁的摩尔量，e₁q代表E₁Q的摩尔量；

由于上述双底物反应式中和为不可逆反应，因此，k_1,-3＝k_1,-4＝0；

P1的生成速率的具体计算公式为：

其中，代表P₁的生成速率，s₁代表底物S₁的摩尔量，b代表底物B的摩尔量，由公式(1)可知，除了由底物B和S₁确定外，还由k_1,1,k_1,-1,k_1,2,k_1,-2,k_1,3,k_1,4和e_1,0确定；

其中，K_mb表示底物B对酶的亲和性常数，并且K_mb越大，代表底物B对酶的亲和性越低；

其中，k_cat表示酶的催化常数，并且k_cat越大，代表没得催化效率越高；

其中，K_ms1表示底物S₁对酶的亲和性常数，并且K_ms1越大，代表底物S₁对酶的亲和性越低；

首先，假设s₁＞＞b，同时将公式(2)和(3)代入公式公式(1)中，得出：

然后，将公式(3)除以公式(2)，得出k_1,1，具体如下：

由公式(6)可知，k_1,1为固定值；

进一步地，假设b＞＞s₁，同时将公式(2)和(3)代入公式公式(1)中，得出：

进一步地，将公式(2)、(3)和(4)代入公式(1)中，得出：

由公式(8)可知，除了由底物B和S₁确定外，还由总酶量e_1,0、酶的催化常数k_cat、底物对酶的亲和性常数K_ms1、K_mb以及酶反应的速率常数k_1,-1确定；因此，在给定底物浓度s₁、b以及产物的生成速率时，能够得出e_1,0,k_cat,K_ms1,K_mb,andk_1,-1的关系式，进而从计算机的数据库内提取出满足e_1,0,k_cat,K_ms1,K_mb,andk_1,-1的关系式酶反应动力学参数；

由公式(3)可知，在k_cat求得后，通过任意调整k_1,3和k_1,4的值，使其满足的定值即可；

将公式(4)除以公式(3)，得出：

由公式(9)可知，在满足K_ms1和k_cat一定的条件下，通过任意调整k_1,-2和k_1,3的值，使其满足的定值即可；

因此，由公式(1)至(9)可知，对于双底物反应，在得到米氏动力学常数k_cat、K_ms1、K_mb，能够求得k_1,1、k_1,-1、k_1,2、k_1,-2、k_1,3、k_1,-3、k_1,4和k_1,-4；同理，对于单底物或者三底物反应，当给定的动力学参数的个数少于需要的速率常数的个数时，能够按照公式(1)至(9)的方法，找到数据库参数和速率常数之间的联系，然后求得各个速率常数k，再完成所述步骤二的步骤。

3.根据权利要求1所述的体外再现体内反应的系统，其特征在于，所述步骤二的具体步骤为：

(A)胞内代谢网络与基元反应式：

(B)胞外代谢网络与基元反应式：

其中，(A)胞内代谢网络及与它相关的基元反应中，B和Q为一组辅因子代谢物CI，他们在网络中不断消耗和产生，且不会耗尽也不会被排出网络，因此B+Q是一个含量很低的常数；(B)胞外代谢网络及与它相关的基元反应中，(1)中的B和S1为底物，Q和P1为相应的产物；(2)中的Q和S2为底物，B和P2为产物；并且(1)中产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)中产生的B也不能被(1)做底物使用；

为了让(A)胞内代谢网络和(B)胞外代谢网络具有可比性，将S1-P1和S2-P2的反应线路设计成完全相同的；即：S₁＝S₂，P₁＝P₂，E₁＝E₂，B＝Q，k_1，j＝k_2，j，k_1，-j＝k_2，-j，j＝1，2，3，4；因此对于胞内反应来说，根据步骤一中获得的动力学参数进行筛选，得出最小代谢网络的相关动力学参数表格；

在阐述胞内代谢网络相比于胞外代谢网络的优势之前，首先将引入四个定义：反应速率、产物得率、相对产物得率和相对反应速率；其中，反应速率分为产物反应速率和底物反应速率基于CI的产物得率为q_CI(s^-1)，胞内反应系统的基于CI的产物得率为胞外反应系统的基于CI的产物得率为基于CI的相对产物得率为R_q/q，R_q/q是客观衡量胞内反应相对于胞外反应的效率的标准；CI的相对反应速率为R_r/r，R_r/r是客观衡量胞内反应相对与胞外反应的速率的标准，具体计算公式如下：

其中，in-vivo表示胞内反应，in-vitro表示胞外反应，Δt表示反应时间，Δp_i表示从产物积累的角度衡量反应的进程，Δs_i表示从底物消耗的角度衡量反应的进程，b_ss是B在稳态时的值，b₀表示B与S1同时耗尽；

根据所述最小代谢网络的相关动力学参数表格中的数值以及反应物、产物、辅因子代谢中间物CI与时间的变化曲线进行比较，得出如下结论：(1)胞内和胞外代谢网络的反应时间Δt、底物的消耗量ΔS和产物的生成量ΔP完全相同，因此胞内反应相比于胞外反应的基于CI的产物得率根据上述反应结果，表明反应速率中的快反应和慢反应，虽然会影响反应时间，但不会影响基于CI的相对产物得率Rq/q，而底物的初始值会对相对反应速率有影响；(2)胞内和胞外代谢网络中B和Q随着S1和S2的消耗而不断的消耗，因此在这样的胞外系统中用B和Q的初始值来计算基于CI的产物得率更加准确合理；尽管这个最小代谢反应不是真实的，但是它展示了辅因子代谢中间物CI一定是发挥着全局和局部的作用，而且他们在胞内位于低浓度的稳态，胞内代谢相比与胞外代谢的产物得率至少为100-1000倍。

4.根据权利要求1所述的体外再现体内反应的系统，其特征在于，所述步骤三的具体步骤为：

(C)含有NCI、无抑制胞内代谢网络反应过程为：

(D)含有NCI、无抑制胞外代谢网络反应过程为：

(C)和(D)中含有NCI、无抑制胞内和胞外代谢网络的基元反应式：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，B和Q代表辅因子代谢物CI，但是在胞外代谢网络(1)产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)产生的B也不能被(1)作为底物使用，因此在胞外代谢网络中B和Q仅仅作为中间物出现，不影响S₁、S₂、P₁、P₂的反应和性质，不具有辅因子代谢物CI的全局性作用；

(E)含有NCI和产物抑制的胞内代谢网络的反应过程为：

(F)含有NCI和产物抑制的胞外代谢网络的反应过程为：

(E)和(F)中含有NCI和产物抑制的胞内和胞外代谢网络的基元反应为：

其中，S₁、S₂代表底物，P₁、P₂代谢产物，Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆代表非辅因子代谢物NCI，E₁、E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈为相应的酶，Y₁抑制E₁，Y₂抑制E₂，Y₃抑制E₃，Y₄抑制E₅，Y₅抑制E₆，Y₆抑制E_7，B和Q代表辅因子代谢物CI，但是在胞外代谢网络(1)产生的Q不能被(2)作为底物使用，(2)产生的B也不能被(1)作为底物使用，因此胞外系统中B和Q，不具有辅因子代谢物CI的全局性作用；

对于胞内反应来说，根据步骤一中获得的动力学参数进行筛选，得出含有NCI的相关动力学参数表格；

将所述步骤二的最小代谢网络与步骤三中的代谢网络相比较，得知：在最小代谢网络中，由于没有NCI，总是有ΔP^invivo＝ΔP^invitro且Δt^invivo＝Δt^invitro，然而在目前复杂的模型中不能使ΔP^invivo＝ΔP^invitro且Δt^invivo＝Δt^invitro同时成立，否则此时胞内反应中B和Q的摩尔含量将高达30mM左右；在真实的细胞内，渗透压的原因以及细胞摩尔含量的可调性决定了CI的摩尔含量不会太高，大肠内CI的平均含量是1.5mM；因此我们采取了降低反应速度或者降低CI的摩尔含量的方法，从而延长反应时间的方法来评价R_q/q；

由含有NCI的相关动力学参数表格得出，产物抑制一方面减小了产物得率，另一方面也减小了反应的速度；然而，当减小辅因子代谢中间物CI在代谢网络中的含量时，基于CI的相对产物得率却明显上升，虽然这其中伴随值反应速率的略微减小，但是这一损失对细胞来说是划算的；较低的CI摩尔含量提高了代谢的效率，增强了代谢物摩尔含量对代谢流的敏感性，降低了反应速率从而保证其他每一个代谢中间物的摩尔含量都被控制在较低的水平；总的来说这一结果与我们在最小代谢网络中的结果完全一致，从而进一步巩固了CI对与细胞维持高效代谢活动的全局性作用；

进一步地，根据参数绘制在胞内以及胞外代谢网络中非辅因子代谢中间物NCI、反应物和产物的对应物质的量随时间的变化曲线图。

5.根据权利要求1所述的体外再现体内反应的系统，其特征在于，所述步骤四的具体步骤为：

在没有抑制的条件下，非辅因子代谢中间物NCI有的维持稳态，有的没有维持稳态；但是当引入抑制后，所有胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持稳态；稳态水平的高低则由抑制强度的高低来决定；

比较胞内反应和胞外反应，虽然胞外反应与对应的胞内反应有相同的抑制机制、抑制水平，但是并不是所有的NCI都有稳态，考虑此时胞内网络和胞外反应唯一的区别是前者包含CI而后者虽然包含CI，但是不具有CI的性质，相当于胞外网络不具有CI，因此唯一的区别在于胞内含有CI，因此得出结论：辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物NCI能否维持稳态的不可或缺的因素，而且CI摩尔含量越低，NCI稳态时的摩尔含量水平越低，综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维持稳态的两个重要因素，两者缺一不可。

6.根据权利要求1所述的体外再现体内反应的系统，其特征在于，所述步骤五的具体步骤为：在高、中、低三种抑制水平下以CI的浓度大小为自变量，得出CI浓度的改变对胞内系统中其他NCI稳态水平的影响；得出如下结论：NCI总体对CI的改变是很敏感的，当CI浓度很低时，NCI对CI的敏感度最强，因此能够通过降低CI的浓度，使得NCI水平降低，从而提高产物得率。

7.根据权利要求1所述的体外再现体内反应的系统，其特征在于，所述步骤六的具体步骤为：

绘制单底物和双底物中酶反应的酶含量对胞内网络中非辅因子代谢中间物NCI的摩尔含量随着时间的变化曲线图，得出在胞内网路中，酶量的影响是全局性的；增加酶量会使得前面的非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度下降，后面的非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度上升；同时由于B+Q是常数，降低B会使Q升高，从而将酶量的影响由局部扩大到全局；

酶量对反应速率会产生影响，酶量越大，反应速率越大，但是反应速率对不同酶的敏感程度不一样，因此，酶量不管是反应速率还是对非辅因子代谢中间物NCI的稳态浓度的影响都是全局性的。

8.根据权利要求1所述的体外再现体内反应的系统，其特征在于，还包括：步骤八，根据所述步骤七中得出的胞外代谢反应系统，将数据库内的相关体内代谢的动力学参数代入胞外代谢反应系统内，在计算机上进行大量的干反应，最终得出一组非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的加入量，使其性能最好，然后在实验室进行湿实验，对胞外代谢反应系统进行微调，得出最优的非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的加入量值，即为最优的胞外代谢反应系统。