CN105567596A - 一种放线菌及其应用 - Google Patents

一种放线菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105567596A
CN105567596A CN201610024254.6A CN201610024254A CN105567596A CN 105567596 A CN105567596 A CN 105567596A CN 201610024254 A CN201610024254 A CN 201610024254A CN 105567596 A CN105567596 A CN 105567596A
Authority
CN
China
Prior art keywords
16rdna
utilization
sequence
test strains
actinomycetes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610024254.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105567596B (zh
Inventor
冯国忠
吴丽娟
陈国庆
方洋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Qiandao Lake hehe Ecological Agricultural Technology Co.,Ltd.
Original Assignee
China National Rice Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China National Rice Research Institute filed Critical China National Rice Research Institute
Priority to CN201610024254.6A priority Critical patent/CN105567596B/zh
Publication of CN105567596A publication Critical patent/CN105567596A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105567596B publication Critical patent/CN105567596B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种放线菌(Actinomycetes)，其为富阳链霉菌(Streptomyces？fuyangensis)。本发明的放线菌对防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病和水稻立枯病病具有防治作用。

Description

一种放线菌及其应用
技术领域
本发明涉及放线菌领域，特别涉及一种新的放线菌。
背景技术
水稻是世界主要粮食作物，也是我国的主粮之一。水稻稻瘟病、纹枯病和白叶枯病并称水稻的三大病害，其中稻瘟病是三大病害之首。稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)所引起的，由于该病菌在环境中极易生存，从而使其在各种生物胁迫中，成为对水稻危害最为严重的病害，每年给水稻生产带来严重的经济损失。据估计，各个国家每年因稻瘟病而损失10％－30％的水稻产量，损失达数十亿美元(Kunovaetal.,2013)。
稻瘟病的发病机制是由于M.oryzae真菌在水稻叶片表面通过接触植物和在植物体上萌发无性的分生孢子而引起的。常在水稻叶片上形成梭形病斑，最外面是黄色，稍内为红褐色，中央灰白色，病斑两端有纵向伸展的褐色坏死线。稻瘟病可危害叶片、茎节、穗颈、秧苗、枝梗和籽粒，分别称为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和粒瘟。
目前农业上用于防治稻瘟病主要是化学农药，但是大量和长期使用化学农药，既增加生产成本，也容易导致病原菌产生抗性，同时还造成严重的环境污染，给人类健康和环境安全带来威胁。育种学家们采用培育新的抗病品种来抵抗稻瘟病，尽管具有一定的效果，但是由于稻瘟病菌极易变异和致病多样性的特点，常常使得刚培育出的品种在推广数年内失去抗性。因此，我们希望通过生物防治特别是生物农药来控制和解决稻瘟病。
生防菌的种类繁多，目前生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌和病毒等。对稻瘟病防治有效的抗生素主要有灭瘟素(blasticidinS)、春雷霉素/春日霉素(kasugamycin)、庆丰霉素(qingfengmycin)(文等，2004)。BlasticidinS是1958年日本研究者在变构菌素产生菌(Streptomycesgriseochromogenes)中分离到的，用于替代有机汞农药防治水稻稻瘟病。BlasticidinS曾大规模使用，但后来发现BlasticidinS对哺乳动物具有毒性，限制了其大量使用。
因而，筛选更多不同的能够抑制稻瘟菌生长的生防菌株成为开发生物农药防治水稻稻瘟菌病害的首要工作。
发明内容
因此，本发明之一提供了一种放线菌(Actinomycetes)，其为富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)。
在一个具体实施例中，所述放线菌为于2015年10月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.11482的富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)BS014的菌株。
本发明之二提供了一种组合物，其包括富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)以及农药上可接受的载体；特别是包括于2015年10月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.11482的富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)BS014以及农药上可接受的载体。
农药上可接受的载体也就是农药助剂，在农药制剂的加工或使用中，用于改善药剂理化性质的辅助物，能提高药效，便于运输、贮藏等等。如润湿剂、乳化剂、分散剂、粘着剂、稳定剂、增效剂。
本发明之三提供了包括富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)和农药上可接受的载体的组合物在防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病和水稻立枯病中的至少一种中的应用。其中，水稻稻瘟病的病原菌为稻瘟菌(Magnaportheoryzae)，水稻恶苗病的病原为串珠镰孢(Fusariummoniliforme)，水稻立枯病的病原菌为禾谷镰孢菌(FusariumgraminearumSchw.)。
在一个具体实施例中，包括于2015年10月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.11482的富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)BS014，和农药上可接受的载体的组合物在防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病和水稻立枯病中的至少一种中的应用。其中，水稻稻瘟病的病原菌为稻瘟菌(Magnaportheoryzae)，水稻恶苗病的病原为串珠镰孢(Fusariummoniliforme)，水稻立枯病的病原菌为禾谷镰孢菌(FusariumgraminearumSchw.)。
本发明之四提供了富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)在防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病和水稻立枯病中的至少一种中的应用。
在一个具体实施例中，于2015年10月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.11482的富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)BS014在防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病和水稻立枯病中的至少一种中的应用。其中，水稻稻瘟病的病原菌为稻瘟菌(Magnaportheoryzae)，水稻恶苗病的病原为串珠镰孢(Fusariummoniliforme)，水稻立枯病的病原菌为禾谷镰孢菌(FusariumgraminearumSchw.)。
本法之五提供了一种鉴定富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)的方法，包括对待测菌株进行16rDNA序列或16rDNA的部分序列测序，并且所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列与如SEQIDNo:1的序列的一致性在95％以上，优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列与如SEQIDNo:1的序列的一致性在97％以上，更优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列与如SEQIDNo:1的序列的一致性在99％以上，最优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列与如SEQIDNo:1的序列的一致性在99.5％以上，则鉴定所述待测菌株为富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)。
在一个具体实施例中，所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1300bp；优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1350bp；更优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1400bp；特别优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1450bp；最优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1500bp。
在一个具体实施例中，使用如SEQIDNo:2和SEQIDNo:3作为引物对进行PCR扩增以获得的所述16rDNA的部分序列，并将所述16rDNA的部分序列进行测序来与如SEQIDNo:1的序列比较以鉴定所述待测菌株。
在一个具体实施例中，所述方法还包括将结合待测菌株的生长形态和/或生理生化特性与富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)的生长形态和/或生理生化特性的比较以对所述待测菌株进行鉴定。
一般来讲，利用微生物的16rDNA序列或16rDNA的部分序列对微生物进行鉴定具有例如如下优点：对未知样品进行快速种属分析；为生化鉴定提供指导信息；对于难以获得纯培养的细菌，如寄生菌等，使用16SrDNA鉴定是唯一可用的鉴定手段。
但是有的微生物由于种间差异小，单独依靠16rDNA鉴定不能鉴定到种。需要其它鉴定方法补充，例如微生物的生长形态和/或生理生化特性。当待测菌株与已知菌株间的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的一致性在上述水平时，且同时满足待测菌株与已知菌株在相同的培养基上的生长形态相同时，可以更为准确地判断待测菌株与已知菌株同种，否则可以判断待测菌株为不同的物种或者是新的物种；或者，当待测菌株与已知菌株间的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的一致性在上述水平时，且同时满足待测菌株与已知菌株间的生理生化特性相同时，可以更为准确地判断待测菌株与已知菌株同种，否则可以判断待测菌株为不同的物种或者是新的物种；或者，将待测菌株与已知菌株间的16rDNA序列或16rDNA的部分序列一致性、生长形态和生理生化特性均进行比较，当待测菌株与已知菌株间的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的一致性在上述水平时，且同时满足待测菌株与已知菌株在相同的培养基上的生长形态相同，以及进一步满足待测菌株与已知菌株间的生理生化特性相同时，可以更为准确地判断待测菌株与已知菌株同种，否则可以判断待测菌株为不同的物种或者是新的物种。
其中，在待测菌株与已知菌株进行形态比较时，可以选用一种或多种培养基，例如对于放线菌来说，可以选用ISP2、ISP3、ISP4和ISP5中的至少一种。
在一个具体实施例中，所述生长形态包括气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色、色素、产孢情况和生长状态中的至少一种；所述生理生化特性包括对碳源的利用、阿拉伯糖的利用、海藻糖的利用、甘露糖的利用、葡萄糖的利用、木糖的利用、半乳糖的利用、肌醇的利用、山梨糖的利用、棉籽糖的利用、鼠李糖的利用、果糖的利用、蔗糖的利用、尿素的利用、硝酸铵的利用、甘氨酸的利用、L－脯氨酸的利用、L－精氨酸的利用、L－天冬酰胺的利用和L－天冬氨酸的利用，以及明胶液化、纤维素分解、硫化氢的产生、黑色素的产生、淀粉水解和唯一氮源的情况中的至少一种。
附图说明
图1显示的是对峙培养法筛选抑制水稻稻瘟病的放线菌。
图2显示的是放线菌BS014的16rDNA构建的系统发育树。
菌种保藏
富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)BS014菌株于2015年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11482。
具体实施方式
高氏一号固体培养基：可溶性淀粉20.0g、NaCl0.5g、KNO31.0g、MgSO47H2O0.5g、K2HPO40.5g、FeSO47H2O0.01g、琼脂20.0g和蒸馏水1L，pH7.4-7.6，在121℃下灭菌20min。
ISP2固体培养基：酵母粉4.0g、麦芽浸提粉10.0g、葡萄糖4.0g、琼脂20.0g和蒸馏水1L，pH7.2-7.4，在121℃下灭菌20min。
ISP3固体培养基：燕麦粉20.0g，加适量蒸馏水煮1-2h，后用纱布过滤，滤液定容至1L，即为燕麦浸提液，每1L燕麦浸提液加微量盐溶液1.0ml，琼脂20.0g，pH7.2，在121℃下灭菌20min。
微量盐溶液配方：FeSO40.01％、MnCl2.4H2O0.01％、ZnSO4.5H2O0.01％和蒸馏水100ml。
ISP4固体培养基：可溶性淀粉10.0g、MgCO31.0g、K2HPO40.3g、NaCl0.1g、(NH4)2SO42.0g、琼脂20.0g和蒸馏水1L，pH7.2，在121℃下灭菌20min。
ISP5固体培养基：天冬氨酸1.0g、甘油12.5g、MgSO4.7H2O0.5g、CuSO4.5H2O0.001g、ZnSO4.5H2O0.001g、MnSO4.H2O0.001g、NaCl1.0g、Fe2(SO4)3.6H2O0.01g、K2HPO41.0g、琼脂20.0g和蒸馏水1L，pH7.2，在121℃下灭菌20min。
相对抑菌率(％)＝[(对照菌落半径－处理菌落半径)/对照菌落半径。
实施例
本发明对水稻稻瘟病菌有抑制作用的放线菌筛选方法如下：
1、土壤样品的采集
从云南丽江涛源山区随机采取土样。去除表面土壤，采集5-20cm深处的土样约300g，分装标记后带回实验室。
2、放线菌的分离和纯化
2.1放线菌的分离
采用土壤稀释法分离，称取10g土壤倒入装有玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡10min，该样品作为10－1的稀释液；向10－1的稀释液中吸取10ml至新的装有90ml无菌水的三角瓶中，振荡混匀，该样品为10-2的稀释液；按此方法继续稀释至10-3、10-4、10-5和10-6的稀释液。吸取100μl的10-4、10-5和10-6的稀释液样品分别加入到高氏一号培养基平板上，涂布均匀，倒置于28摄氏度培养箱中培养。每个样品重复2次。
2.2放线菌的纯化
将平板上出现的表面干燥，与培养基结合紧密的菌落挑取做进一步的纯化。经过分离纯化，初步得到10株放线菌，并分别为它们编号。
3、对稻瘟病菌具有拮抗作用的放线菌的筛选
采用平板对峙法，将稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)在PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，在121℃下灭菌20min。)上活化后，用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼，备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌(即稻瘟病菌)等距离(2.5cm)处划线接入本发明中纯化的不同编号的放线菌(划线长度3cm)，并且每个编号的放线菌接种三个平板作为3个重复，同时以不接种放线菌只接稻瘟病菌的平板为对照。28摄氏度进行对峙培养，5天后观察、记录。对拮抗作用显著的放线菌进行保存。
从10株分离得到的放线菌对稻瘟病菌的平板对峙生长试验结果看，发现编号为BS014的放线菌对稻瘟病菌的生长具有明显的拮抗作用(见图1)。测量受BS014拮抗生长的稻瘟病菌的生长半径分别为1.2cm，1.4cm和1.2cm，对照稻瘟病菌的生长半径为2.3cm，2.6cm和2.5cm，三次重复取平均值后根据上述公式计算得到BS014对稻瘟病菌的相对抑菌率为48.6％。
4、拮抗放线菌BS014对水稻立枯病菌的抑菌效果
采用平板对峙法，将引起水稻立枯病的禾谷镰孢菌(FusariumgraminearumSchw.)活化后，用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌(禾谷镰孢菌)等距离(2.5cm)处划线接入放线菌BS014(划线长度3cm)，并且接种三个平板作为3个重复，同时以不接种放线菌只接指示菌的平板为对照。5天后如上述标题3中的那样观察并记录。
从10株分离得到的放线菌对水稻立枯病菌的平板对峙生长试验结果看，发现编号为BS014的放线菌对水稻立枯病菌的生长具有明显的拮抗作用。测量受BS014拮抗生长的水稻立枯病菌的生长半径分别为2.5cm，2.8cm和2.7cm，对照水稻立枯病菌的生长半径为4.2cm，4.0cm和4.1cm，三次重复取平均值后根据上述公式计算得到BS014对水稻立枯病菌的相对抑菌率为35.0％。
5、拮抗放线菌BS014对水稻恶苗病的抑菌效果
采用平板对峙法，将引起水稻恶苗病的串珠镰孢(Fusariummoniliforme)活化后，用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌(串珠镰孢)等距离(2.5cm)处划线接入放线菌BS014(划线长度3cm)，并且接种三个平板作为3个重复，同时以不接种放线菌只接指示菌的平板为对照。5天后如上述标题3中的那样观察并记录。
从10株分离得到的放线菌对水稻恶苗病的平板对峙生长试验结果看，发现编号为BS014的放线菌对水稻恶苗病的生长具有明显的拮抗作用。测量受BS014拮抗生长的水稻恶苗病的生长半径分别为2.4cm，2.5cm和2.4cm，对照水稻恶苗病的生长半径为3.0cm，3.2cm和3.0cm，三次重复取平均值后根据上述公式计算得到BS014对水稻恶苗病的相对抑菌率为20.6％。
6、拮抗放线菌BS014对水稻纹枯病菌的抑菌效果
采用平板对峙法，将引起水稻纹枯病的立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)活化后，用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌(立枯丝核菌)等距离(2.5cm)处划线接入放线菌BS014(划线长度3cm)，并且接种三个平板作为3个重复，同时以不接种放线菌只接指示菌的平板为对照。5天后如上述标题3中的那样观察并记录。
结果发现，本发明的放线菌BS014对水稻纹枯病的效果不明显。
7、拮抗放线菌BS014对水稻稻曲病的抑菌效果
采用平板对峙法，将引起水稻稻曲病的病原菌稻绿核菌(Ustilaginoideaoryzae)活化后，用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌(稻绿核菌)等距离(2.5cm)处划线接入放线菌BS014(划线长度3cm)，并且接种三个平板作为3个重复，同时以不接种放线菌只接指示菌的平板为对照。5天后如上述标题3中的那样观察并记录。
结果发现，本发明的放线菌BS014对水稻稻曲病的效果不明显。
8、拮抗菌的鉴定
(1)16rDNA测序及序列分析
参照Kieseretal.,(2000)中所述方法提取放线菌BS014的基因组DNA。用细菌16rDNA通用引物：27F：5’－agagtttgatcctggctcag-3’和1492R：5’-cggttaccttgttacgactt-3’扩增放线菌BS014的16rDNA序列。50μl的反应体系包括：10×PCRbuffer5μl，dNTP(2.5mM)4μl，27F(20μM)1μl，1492R(20μM)1μl，TaqDNA聚合酶(5IU)0.25μl，DNA模板(50ng/μl)1μl，ddH2O补充至50μl。PCR扩增条件：94℃3min预变性，94℃45sec，58℃45sec，72℃90sec，共30个循环，72℃10min终延伸。得到的1500bp左右多片段，经试Axygen胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)纯化进行TA克隆，克隆到pMD-18T(Takara)上，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)并进行常规的培养，得到的转化子，经过对得到的转化子的菌液PCR验证正确后，送北京擎科新业生物技术有限公司测序，所得序列为1485bp(详见SEQIDNo:1所示)。所测序列提交EzBioCloud网站(www.ezbiocloud.net)进行同源性比较，比较结果显示BS014与藤黄灰链霉菌(Streptomycesluteogriseus)NBRC13402T最为相似(公布的16rRNA基因片段长度为1435bp)，相似性为99.23％。并使用MEGA6.0软件，构建最大似然(MaximumLikelihood)系统发育树(图2)。
16rDNA基因是细菌进化的标尺，对一个未知的种，一般首先考察其16rDNArRNA基因的系统发育关系，本发明中的BS014在其16rRNA基因的系统发育树中独立成一个分支，EzBioCloud网站(www.ezbiocloud.net)对16rRNA基因的相似性比较结果显示BS014是与藤黄灰链霉菌(S.luteogriseus)NBRC13402T最相似。
(2)培养形态特征
在高氏一号培养基上，放线菌BS014菌落圆形，孢子灰白色有液珠，菌落与培养基结合紧密难挑取，菌落背面淡黄色，无可溶性色素产生。BS014和藤黄灰链霉菌(S.luteogriseus)NBRC13402T在ISP2、ISP3、ISP4和ISP5培养基上的形态特征见表1。可以看出，两株菌在同种培养上形态特征存在明显差异。BS014在ISP3培养基上菌落边缘不规则，菌落表面皱褶，气生菌丝橘黄色，基内菌丝橘黄色，无可溶性色素产生，不产孢；BS014在ISP3培养基上气生菌丝灰色，基内菌丝淡黄色，生长良好，第七天观察已产孢，孢子灰绿色，第21天菌落周围产生橘红色色素；BS014在ISP4培养基上气生菌丝灰色，基内菌丝灰色，无可溶性色素产生，生长较好，第七天观察已产孢，孢子灰白色；BS014在ISP5培养基上气生菌丝灰色，基内菌丝灰白色，无可溶性色素产生，生长良好，第七天观察已产孢，孢子灰色。根据在不同培养基上的生长情况，可以将ISP3确定为BS014的最适培养基。
表1BS014和其近缘种藤黄灰链霉菌(Streptomycesluteogriseus)NBRC13402T)生长形态描述的比较
(3)生理生化实验
具体参考《链霉菌鉴定手册》对放线菌BS014和藤黄灰链霉菌(S.luteogriseus)NBRC13402T进行明胶液化、黑色素产生、淀粉水解、纤维素水解、硫化氢产生和碳氮源利用等试验。试验结果见表2。可以看出两株菌在氮源利用，明胶液化，淀粉水解，黑色素产生和硫化氢产生方面存在明显差异。
表2BS014和近缘种藤黄灰链霉菌(Streptomycesluteogriseus)NBRC13402T生理生化特性的比较
在16rDNA序列比较分析之后，进一步根据BS014和藤黄灰链霉菌(S.luteogriseus)NBRC13402T的表型性状比较，我们可以判定BS014为不同于藤黄灰链霉菌(S.luteogriseus)NBRC13402T的一个新种，并将该新种的物种名称定为富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)，该菌株的名称为BS014，该菌株已于2015年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11482。
虽然本发明已经参照优选的具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物、方法、或方法步骤。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种放线菌(Actinomycetes)，其为富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)。
2.根据权利要求1所述放线菌，其特征在于，所述放线菌为于2015年10月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.11482的富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)BS014菌株。
3.根据权利要求1或2所述的放线菌在防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病和水稻立枯病中的至少一种中的应用。
4.一种组合物，其包括如权利要求1或2所述放线菌以及农药上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的组合物在防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病和水稻立枯病中的至少一种中的应用。
6.一种鉴定富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)的方法，包括对待测菌株进行16rDNA序列或16rDNA的部分序列测序，并且所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列与如SEQIDNo:1的序列的一致性在95％以上，优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列与如SEQIDNo:1的序列的一致性在97％以上，更优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列与如SEQIDNo:1的序列的一致性在99％以上，最优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列与如SEQIDNo:1的序列的一致性在99.5％以上，则鉴定所述待测菌株为富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1300bp；优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1350bp；更优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1400bp；特别优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1450bp；最优选所述待测菌株的16rDNA序列或16rDNA的部分序列的长度大于或等于1500bp。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，使用如SEQIDNo:2和SEQIDNo:3作为引物对进行PCR扩增以获得的所述16rDNA的部分序列，并将所述16rDNA的部分序列进行测序来与如SEQIDNo:1的序列比较以鉴定所述待测菌株。
9.根据权利要求6-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括结合将待测菌株的生长形态和/或生理生化特性与富阳链霉菌(Streptomycesfuyangensis)的生长形态和/或生理生化特性的比较以对所述待测菌株进行鉴定。
10.根据权利要求6-9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述生长形态包括气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色、色素、产孢情况和生长状态中的至少一种；所述生理生化特性包括对碳源的利用、阿拉伯糖的利用、海藻糖的利用、甘露糖的利用、葡萄糖的利用、木糖的利用、半乳糖的利用、肌醇的利用、山梨糖的利用、棉籽糖的利用、鼠李糖的利用、果糖的利用、蔗糖的利用、尿素的利用、硝酸铵的利用、甘氨酸的利用、L－脯氨酸的利用、L－精氨酸的利用、L－天冬酰胺的利用和L－天冬氨酸的利用，以及明胶液化、纤维素分解、硫化氢的产生、黑色素的产生、淀粉水解和唯一氮源的情况中的至少一种。
CN201610024254.6A 2016-01-14 2016-01-14 一种放线菌及其应用 Active CN105567596B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610024254.6A CN105567596B (zh) 2016-01-14 2016-01-14 一种放线菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610024254.6A CN105567596B (zh) 2016-01-14 2016-01-14 一种放线菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105567596A true CN105567596A (zh) 2016-05-11
CN105567596B CN105567596B (zh) 2019-01-18

Family

ID=55878230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610024254.6A Active CN105567596B (zh) 2016-01-14 2016-01-14 一种放线菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567596B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834194A (zh) * 2017-03-28 2017-06-13 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法
CN106942301A (zh) * 2017-03-28 2017-07-14 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101781626A (zh) * 2007-08-07 2010-07-21 吉林省农业科学院 对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌及其制备方法
CN101984044A (zh) * 2010-01-19 2011-03-09 四川农业大学 防治水稻纹枯病和稻瘟病的链霉菌菌株
CN103992967A (zh) * 2014-04-16 2014-08-20 中国中化股份有限公司 微黄白链霉菌及其在植物病害防治中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101781626A (zh) * 2007-08-07 2010-07-21 吉林省农业科学院 对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌及其制备方法
CN101984044A (zh) * 2010-01-19 2011-03-09 四川农业大学 防治水稻纹枯病和稻瘟病的链霉菌菌株
CN103992967A (zh) * 2014-04-16 2014-08-20 中国中化股份有限公司 微黄白链霉菌及其在植物病害防治中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张丽华，孙红霞主编: "《微生物药物学》", 30 December 2007 *
徐威主编: "《微生物学实验》", 30 December 2004 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834194A (zh) * 2017-03-28 2017-06-13 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法
CN106942301A (zh) * 2017-03-28 2017-07-14 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法
CN106834194B (zh) * 2017-03-28 2018-02-23 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105567596B (zh) 2019-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cui et al. Isolation and identification of an endophytic bacteria Bacillus velezensis 8-4 exhibiting biocontrol activity against potato scab
Solanki et al. Isolation and characterization of siderophore producing antagonistic rhizobacteria against Rhizoctonia solani
Campbell Biological control of microbial plant pathogens
CN111100806B (zh) 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制备的槟榔根腐病杀菌剂
RU2705286C2 (ru) Штамм mycosphaerella sp., композиции и способы для борьбы с фузариозом
CN117604062A (zh) 用于开发土传植物病原体抑制微生物菌群的平台
CN102433281B (zh) 卡特拉链霉菌nb20及其培养方法和应用
WO2015114552A1 (en) Plant growth promoting rhizobacterial strains and their uses
CN102433282A (zh) 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用
Sun et al. An investigation of Panax ginseng Meyer growth promotion and the biocontrol potential of antagonistic bacteria against ginseng black spot
CN106867934A (zh) 一株暹罗芽孢杆菌及其在防治植物白粉病中的应用
CN106591157A (zh) 一株防病促生的塔宾曲霉及其代谢产物的制备和应用
CN105746503A (zh) 一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用
CN111040976A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN110982724A (zh) 一种拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌及其应用
CN108220211B (zh) 一株嗜油不动杆菌nmb17及其在植物病害防治中的应用
CN101942403B (zh) 短小芽孢杆菌及其培养方法和用途
CN100512651C (zh) 一种防治植物真菌病害的生防菌及其制备方法
CN107699526A (zh) 一株防治灰霉病的放线菌菌株及其应用
CN105567596A (zh) 一种放线菌及其应用
CN113755389A (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
Khoury et al. The microbiome of the Lebanese wild apple, Malus trilobata, is a rich source of potential biocontrol agents for fungal post-harvest pathogens of apples
CN115927038A (zh) 链霉菌菌株及其在植物病原真菌防治中的应用
CN111321094B (zh) 一种防治玉米茎基腐病的微生物菌剂m1及其应用
Chemitei Bio–control of net-blotch and scald pathogens of barley using paenibacillus polymyxa KAI245 Isolated from sorghum rhizosphere in Western Kenya

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211202

Address after: 311799 room 206-2, building 6, No. 668, Gangkou Road, Qiandaohu Town, Chun'an County, Hangzhou City, Zhejiang Province

Patentee after: Hangzhou Qiandao Lake hehe Ecological Agricultural Technology Co.,Ltd.

Address before: 311404 No. 28, daodaosuo Road, Fuyang Xinqiao, Hangzhou, Zhejiang

Patentee before: CHINA NATIONAL RICE Research Institute

TR01 Transfer of patent right