CN105556287A - 用于确定植物营养状态的方法和装置 - Google Patents

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简斯·弗莱登凡格
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Abstract

提供了用于确定相对于一种或多种营养素而言一个植物的营养状态的方法和仪器。该方法包括以下步骤：使用一个荧光计装置记录该植物的一个组织样品的一个荧光诱导信号的一个时间序列以获得信号数据，其中该时间序列至少包括在该荧光诱导信号的上升部分内的信号数据；并且由应用到该信号数据的一个经验模型确定该营养状态，其中该经验模型是基于预先记录的参考数据并且将营养状态与该荧光诱导信号的进展中的形状相关特征相关联。

Description

用于确定植物营养状态的方法和装置
本发明在一个方面中涉及一种确定植物营养状态的方法。根据另一个方面，本发明涉及一种用于确定植物营养状态的仪器。
发明背景
光合作用是对于植物的功能至关重要的一个生理过程。因此，一个植物的光合作用性能的测量是用于确定该植物的生理状态的一个宝贵的信息来源。光合作用将吸收的光能转化成可被植物使用的化学能，并且通过复杂的过程进行，叶绿素在其中发挥着重要作用。虽然被植物吸收的大部分光能进入光合作用，但是一些光能经历非光化学猝灭(大部分通过热耗散)或通过叶绿素重新发射为荧光。由于光合作用、非光化学淬灭和叶绿素荧光这三种机制是通过相同的能量源供应的，所以这些过程中的一个的性能由于生物或非生物因素造成的变化将通过其他过程中的至少一个的变化反映出来。然而，测量这些过程的完全能量平衡在实践上是不可能的。尽管如此，荧光信号含有大量信息。然而，破解这个信息并且从荧光研究得到关于植物生理状态的信息是一项非常具有挑战性的任务，相对于特定参数(诸如一种特定营养素或营养素组的缺乏)的影响而言该信息是特异性的。
光合作用过程受特定的动力学支配，其反映在叶绿素a荧光的时间依赖性上。在用光化性光激发之后，叶绿素a荧光在数毫秒至最高约一秒钟的时标上从背景荧光强度F0增加最多至最大荧光强度Fm，并且随后在数分钟的时标上下降。这种现象被称为荧光诱导，并且对于最初已进行暗适应以便允许光合作用性能的最大可能增加的叶片可最清楚地观察到此现象。荧光诱导曲线的上升部分展现出一系列平台，通常由字母O-J-I-P表示，并且可因此称为OJIP-上升。由于在叶绿素a荧光瞬变与光合作用过程之间的联系，分析这些瞬变，尤其是OJIP-上升，可用于提供给定植物的总体性能的基准测试。然而，分离具体参数对于一个给定植物的荧光诱导瞬变的特定影响并且得到有关该植物的状态的任何特定信息(例如，相对于一种特定营养素而言)通常是非常困难的。例外的是，已证明可以将最大强度与最小强度之间的差(Fv)与最大强度(Fm)的比率与锰的营养状态直接联系起来-因为锰在光合作用中发挥着非常直接的作用(赫斯特德(Husted)等人，植物生理学(PlantPhysiology)，2009，825-833页)。其他方法提出了对光合作用过程中涉及的物理机制的详细的理论分析，以便从荧光诱导瞬变的分析中获取有关植物总体健康的信息(斯蒂尔贝特(Stirbet)等人，光化学和光生物学杂志B辑：生物学(JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology)，2011，第236-257页)。虽然在旨在理解光合作用过程的细节的科学研究中是合理的，但是此类物理模型至今尚不可用于在目标为确定植物的营养素特异性营养状态的仪器中实现。除了上述关于锰的方法之外，可用方法通常不适于在田地中至少在一定程度上区分不同营养素对植物早期发育的影响，并且现场给出结果。此类信息将是合乎需要的，例如，用于促进施肥的微观管理以改善农作物同时避免过量使用。如果在早期可获得，那么此类信息将允许在造成永久性的作物损害之前进行纠正措施。
因此，需要一种确定相对于一种或多种营养素而言一个植物的营养状态的方法，该方法解决或克服了至少一些上述挑战。该方法应至少在一定程度上能够在不同营养素的影响之间做出区分。优选地，该方法应适于在适于田地使用的一种移动测量仪器中实现。
发明概述
本发明的第一方面涉及一种确定相对于一种或多种营养素而言一个植物的营养状态的方法，该方法包括以下步骤：
-使用一个荧光计装置记录该植物的一个组织样品的一个荧光诱导信号的一个时间序列以获得信号数据，其中该时间序列至少包括在该荧光诱导信号的上升部分OJIP内的信号数据，并且
-由应用到该信号数据的一个经验模型确定该营养状态，其中该经验模型是基于预先记录的参考数据并且将参考营养状态与该荧光诱导信号的时间依赖性进展中的形状相关特征相关联。
在本申请的上下文中，术语“营养素”是指被认为对于植物完成全生命周期所必需的化学元素。因此术语“营养素”包括以下元素：氧(O)、氢(H)、碳(C)、氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、硫(S)、镁(Mg)、硼(B)、氯(Cl)、锰(Mn)、铁(Fe)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)以及镍(Ni)。
当一个植物含有足量的这些营养素以便正常工作时，相对于一种或多种营养素而言的该植物的该营养状态可被描述为健康的。如果该植物仅含有不足量的一种或多种营养素，那么营养素的缺乏影响该植物的健康，并且该营养状态被描述为缺乏的。根据本发明的方法通过记录荧光瞬变并且将荧光瞬变曲线形状的变化与植物营养素浓度的变化相关联来监测光合作用过程的运行。因此，该方法检测营养素浓度的“生物活性”部分，该部分是对植物的功能(在这种情况下是光合作用)具有影响的部分。当生物活性浓度不足以使处于任何给定年龄的一个植物正常工作时，该植物是缺乏营养素的。这样，此方法能够检测相对于一种或多种营养素而言的缺乏营养状态。
可使用一种连续激发荧光计，诸如商业上可得自汉莎科学仪器公司(HansatechInstruments)的“HandyPEA”；或提供时间分辨荧光诱导曲线的任何荧光诱导测量装置获得时间分辨荧光诱导数据，其中时间分辨荧光诱导曲线的时间分辨率足以分辨荧光诱导瞬变上升部分中的O-J-I-P特征的形状。在这样一种仪器中，通过光化性光照射一个组织样品，诸如叶片，光化性光激活该组织样品的光系统II并使其饱和。然后通过一个检测器收集产生的荧光，该检测器能够测量由该组织样品发射的作为时间函数的荧光强度。在该“HandyPEA”仪器中，通过在约650nm波长和3000微摩尔光子/(m2*s)强度下具有光谱最大值的一个LED源提供光化性光，并且使用滤光器阻挡该LED源，使用一个PIN光电二极管作为检测器在650nm以上的波长下收集叶绿素a荧光。检测的光谱范围应包括叶绿素a荧光发射的光谱范围的很大一部分以便提供诱导动力学的可靠表示。叶绿素a荧光在约680nm的波长下具有一个明显的最大值，因此检测的一个典型范围应包括这个最大值，诸如最高700nm，或甚至最高800nm。
光化性光的开启限定时间轴的原点，并且来自组织样品的荧光响应被记录为关于这个原点的时间函数。典型地，以随着时间增加的间隔记录荧光，以将表现出快速上升和缓慢下降的荧光瞬变曲线的对数性质考虑在内。在随后的荧光测量之间的典型时间间隔是在从开始时的10μs(微秒)至在瞬变最大值处的约10ms(毫秒)范围内，并且可随着瞬变的缓慢下降以对数方式进一步增加。
该方法依赖于预先记录的参考数据。参考数据是从被制备具有相对于一种或多种营养素而言的多种参考营养状态的植物获得的一组荧光瞬变。参考状态应反映有待测试的营养状态的范围。通过设计，参考数据因此含有关于植物的不同营养状态如何影响荧光诱导信号的信息。如上所述，叶绿素a荧光可同时受到许多生物和非生物因素的影响并且荧光信号所包含的大量信息倾向于隐藏关于一种特定营养素的影响的任何特定信息。本发明通过以下方式解决这个问题：鉴定出信号数据的时间依赖性进展中的形状相关特征的差异与不同营养状态相关联，并且利用一个经验模型来解释这些差异。术语“形状相关”是指时间依赖性荧光诱导信号的进展中的结构；“形状相关特征”是这样的结构：携带相关信息-在此处于荧光诱导瞬变的形状变化的形式，其作为不同营养状态的函数出现。经验模型是基于针对各种参考营养状态获得的预先记录的参考数据，并且使用例如多变量分析技术由参考数据构建。基于这种经验模型，可以由信号数据预测相对于营养素而言植物的营养状态。
本发明的重要优点之一是，可分析荧光诱导瞬变的形状相关特征(尤其是在快速OJIP-上升过程中)，以产生有关相对于一种特定营养素或营养素组而言植物的营养状态的信息。本发明的另一个优点是，通过分析荧光诱导瞬变的形状，有关植物营养状态的这类信息甚至可以是与基因型和植物物种无关的。因此，来自一种基因型或物种的参考数据可被验证为另一种不同的基因型或物种的植物的信号数据的参考。本发明的仍然另一个优点是，荧光诱导瞬变中的形状相关特征的分析产生关于植物在非常早期的潜在营养胁迫的营养素特异性信息，从而允许植物的营养素特异性治疗。与其他方法相比，进行营养素缺乏的早期检测，之后进行适当的特定治疗使得能够在作物损害以及因此产率损失最小的情况下进行纠正。本发明的仍然另一个优点是，可实现生物活性水平的营养素特异性定量分析。
对于一些营养素，经验模型可允许以高度可靠性直接和唯一鉴定相对于一种特定营养素而言的营养状态。此类营养素的例子是磷(P)、铜(Cu)、锰(Mn)、以及硫(S)。对于其他营养素，该经验模型可至少提供一个植物缺乏一种营养素的一个预测，其中该营养素可以是一组营养素中的一种。此类营养素的例子是氮(N)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、以及铁(Fe)。尽管如此，对于这些其他营养素，该预测提供有关植物营养状态的信息，并且减少鉴定相关营养素的不明确性。可通过提供另外的信息来解除剩余的不明确性。此类另外的信息可事先获得，并且允许消除该组中的一些其他营养素。可替代地，可在补充性分析中寻找此类另外的信息。
该方法允许由一种可在植物上直接进行的非破坏性/非侵入性光学测量来提供一个快速、可靠且准确的测试结果。优选地，经验模型是“预先构建的”并且在测试时(即确定待测植物的营养状态时)易于获得。在这种情况下，仅需要存储经验模型的参数而不是全范围的参考数据以用于测试。当经验模型需要被重新验证/重新构建时，仅需再次访问参考数据。这进一步减少对于处理能力和数据存储能力的需要，并且因此特别有利于在移动装置中实现且有利于提供一个快速测试结果。
进一步根据一个实施例，该方法进一步包括预处理信号数据以增强其非线性成分的步骤，其中经验模型由相应地预处理的参考数据构建。
通过去除低阶成分的背景来增强信号数据的时间依赖性进展中的非线性特征，从而使用线性多变量分析技术增强在这些非线性特征中的样本之间的营养素依赖性差异的建模。在分析之前，将与构建经验模型时应用到参考数据的时间依赖性荧光诱导瞬变的相同预处理应用到信号数据的时间依赖性荧光诱导瞬变上。该方法依赖于包含在非线性特征中的信息来分析形状相关特征。植物中营养素生物活性水平的变化，以及因此植物营养状态的改变，被检测为相应的荧光诱导瞬变的非线性成分的变化。由此实现“形状相关特征”的大大改善的分析。
进一步根据该方法的一个实施例，预处理包括归一化，诸如多重散射校正(MSC)或标准正态变量(SNV)转化和/或微分。通过抑制低阶成分来增强荧光诱导信号的时间依赖性进展中的非线性成分。例如，这可以通过相对于时间归一化或微分以抑制线性和亚线性成分来实现。一阶导数去除一个常数背景。二阶导数去除任何线性背景。由此荧光诱导信号的时间依赖性进展中的任何非线性成分更加突出，即，增强。类似的MSC和SNV倾向于抑制时间序列之间的低阶成分的差异。因此，非线性成分变得更加突出，即它们被增强。
进一步根据该方法的一个实施例，确定营养状态包括在经验模型的基础上相对于一种或多种营养素在分类方案中将样本分类。由此，该方法适于提供一个待测植物关于其营养状态的一个分类作为一个输出。这种输出特别有利于微观管理农业，例如以便检测任何不健康的状态、鉴定所关注的特定营养素或营养素组，并且基于该输出决定有待采取的纠正措施。
该分类方案可包括不同的具体程度，例如，取决于经验模型关于特定营养素或营养素组的预测能力。通过确定一组营养素中的至少一种营养素的缺乏，一个分类可能是特异于一种特定营养素的，并且/或者包含剩余的不明确性。可根据定量或半定量信息进行该分类，这些信息诸如代表预测可靠性的数字或缺乏类别(例如，略微/中等/严重缺乏)，其中可针对预先记录的参考数据校准该分类方案，例如，通过多变量分析技术。
进一步根据该方法的一个实施例，确定营养状态包括在经验模型的基础上提供代表植物中的一种或多种营养素的生物活性浓度的定量预测。由此，该方法适于提供关于待测植物的营养状态的一个定量输出。用植物中一种或多种营养素的已知/测量的生物活性浓度针对在参考组织样品上获得的预先记录的参考数据来校准定量预测。可使用任何适当的技术，诸如通过多变量分析技术进行校准。该定量输出可被整合成代表一种或多种营养素的生物活性水平的一个值。一个定量输出是有利的，以便提供该植物关于其营养状态的详细诊断。此外，一个定量输出具有以下优点：可调节纠正的任何测量以避免营养素的过量供应，以及可监测植物对可获得营养素的摄取。
进一步根据该方法的一个实施例，使用选自偏最小二乘法回归(PLS)、或主成分分析(PCA)的组的一个多变量分析技术由参考数据构建经验模型。在一个变体中，该偏最小二乘法回归可以是偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。
进一步根据该方法的一个实施例，通过使用参考数据作为训练集训练一个人工神经网络来构建经验模型。可训练该人工神经网络以便识别存在于参考数据中的任何模式，这些模式将形状相关特征的改变与相对于一种特定营养素或营养素组而言的营养状态的改变相关联。
进一步根据一个实施例，该方法进一步包括从一个或多个时间间隔中选择所记录的参考数据和信号数据的一个子集的步骤。通过从一个或多个时间间隔中选择参考数据和信号数据的一个子集可相对于一种特定营养素或一个特定营养素组优化该方法。关于被期待携带有关相对于一种特定营养素或营养素组而言植物的营养状态的信息的时间依赖性荧光诱导信号中的形状相关特征，或关于事先已被鉴定(例如通过研究参考数据中的荧光诱导瞬变的形状，该参考数据是关于针对这种特定营养素或营养素组的营养状态的变化)携带此类信息的形状相关特征来选择该子集。优选地，进行该选择，以便增强针对这种特定营养素或营养素组的形状相关特征对经验模型的影响。由此，经验模型被配置用于通过选择数据的一个子集来确定针对一种特定营养素或一个特定营养素组的营养状态。
鉴定荧光诱导曲线的时间序列中的形状相关特征的一种方式是记录组织样品(被培养成含有不同生物活性浓度的一种或多种营养素(目标营养素))上的一组参考数据，并且通过比较来自具有不同生物活性浓度的组织样品的迹线来鉴定形状的改变。可通过预处理增强形状相关改变，以提高特征的突出性，例如在比较之前进行微分。然后从其中这些形状相关特征突出的特定时间间隔中选择子集。
进一步根据该方法的一个实施例，参考数据和信号数据被选择处于在10ms与1s之间、可替代地在15ms与100ms之间、或在20ms与50ms之间的范围内。
根据一个有利的实施例，信号数据和相应的参考数据选自在0s与10s之间的时间间隔，涵盖完整的OJIP上升和P处的峰，包括缓慢下降的起点。
根据另一个有利的实施例，信号数据和相应的参考数据选自在0s与3s之间的时间间隔，涵盖完整OJIP上升。
根据一个有利的实施例，信号数据和相应的参考数据选自涵盖荧光诱导瞬变的OJIP上升中的所谓的“I相(I-step)”的时间范围。I相是包含有关相对于许多营养素而言的营养状态的信息的形状相关特征。例如，对于潜在的磷缺乏，观察到这种特征的形状的显著改变。涵盖I相的适合的时间间隔例如处于在10ms与1s之间、可替代地在15ms与100ms之间、或在20ms与50ms之间的范围内。
对于一些营养素，诸如磷(P)、铜(Cu)以及硫(S)，特别是在I相周围观察到高度可靠性的营养状态的预测。因此由这种形状相关特征所携带的信息允许直接和唯一地确定相对于这些营养素而言的营养状态-包括基于相同数据定量预测这些营养素的生物活性浓度。
进一步根据该方法的一个实施例，一种或多种营养素选自下组：氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、硫(S)、镁(Mg)、硼(B)、锰(Mn)、铁(Fe)、锌(Zn)、以及铜(Cu)。
进一步根据该方法的一个实施例，一种或多种营养素选自下组：磷(P)、铜(Cu)、锰(Mn)、以及硫(S)。令人惊讶的是，对于这些营养素，观察到营养素特异性预测的高度可靠性，因此使得与其他营养素混淆的风险较低。
本发明的第二方面涉及一种被配置用于进行根据上述实施例中任一个所述的方法的仪器。用于确定相对于一种或多种营养素而言一个植物的营养状态的仪器的另外实施例引用于下文。实现了以上相对于用于确定营养状态的该方法所述的相同优点。具体地说，该仪器允许由一种可在该植物上直接进行的非破坏性/非侵入性光学测量来提供一个快速、可靠且准确的测试结果。此外，该仪器可以是一种适于在田地中使用的移动装置。
根据本发明的另一个方面，一种用于确定相对于一种或多种营养素而言一个植物的营养状态的仪器包括：
-一个荧光计装置，该荧光计装置被配置用于记录该植物的一个组织样品的一个荧光诱导信号的一个时间序列以获得信号数据，其中该时间序列至少包括在该荧光诱导信号的上升部分内的信号数据，以及
-一个分析装置，该分析装置被配置用于通过将一个经验模型应用到该信号数据来确定该植物的该营养状态，其中该经验模型是基于预先记录的参考数据并且将参考营养状态与该荧光诱导信号的时间依赖性进展中的形状相关特征相关联。
进一步根据该仪器的一个实施例，该分析装置生成代表该植物的该营养状态的一个输出。该输出可直接显示以便向使用者呈现关于该待测植物的该营养状态的数据。该输出可用于得到该植物的一个健康指标，其中该健康指标可以是营养素特异性的或营养素组特异性的。该仪器可在供一个后续装置使用的一个界面上提供该输出，该后续装置诸如一种用于诊断和/或治疗该待测植物的装置。对于临界阈值水平，即，如果确定该植物的一个临界状态，那么该仪器可生成被该输出触发的一个警报。
进一步根据该仪器的一个实施例，该营养素特异性输出是根据基于该经验模型的一个分类方案的一个分类。
进一步根据该仪器的一个实施例，该输出是在该经验模型的基础上代表该植物中一种或多种营养素的生物活性浓度的一个定量预测。
进一步根据该仪器的一个实施例，一种或多种营养素选自下组：氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、硫(S)、镁(Mg)、硼(B)、锰(Mn)、铁(Fe)、锌(Zn)、以及铜(Cu)。
有利地根据该仪器的另一个实施例，一种或多种营养素选自下组：磷(P)、铜(Cu)、锰(Mn)、以及硫(S)。
附图简要说明
在下文中，通过举例和参考附图进一步解释本发明。附图在以下示出
图1从具有不同磷营养状态的四个组织样品记录的荧光诱导信号的时间序列，
图2通过在时间窗口A-F中的每一个中逐部分微分进行预处理以增强形状相关特征之后的图1的数据，
图3从具有特定的营养素缺乏的多个组织样品以及健康对照植株记录的荧光诱导信号的中值时间序列。
图4通过在时间窗口A-E中的每一个中逐部分微分进行预处理以增强形状相关特征之后的图3的数据，
图5针对独立测量磷浓度(ppm)的磷浓度(ppm)的PLS预测，
图6基于I相周围的MSC预处理数据的PCA模型的前两种主成分PC1和PC2的PCA得分图。
详细说明/实例
荧光诱导瞬变的记录
在所有实例中，使用商业上可获得的汉莎科学仪器“HandyPEA”进行叶绿素a荧光瞬变测量。使用配合这种仪器的暗适应夹具，将有待分析的组织样品初始暗适应至少20分钟，从而有效地停止所有光合作用活动并且最大化OJIP-上升的强度增大。在测量时，将HandyPEA的传感器单元放置在暗适应夹具上，从而允许组织样品暴露于传感器和二极管而不让光进入。最初，通过使用非光化性光的短闪光并测量来自组织样品的响应来确定背景水平，并且相应地调节检测器的增益。
在这种初始调节之后，通过使用被光过滤至650nm的最大波长的三盏红色LED照射暴露叶片来进行实际测量。在测量的持续期间使这种光持续亮着，并且以至少3000μmolm-2s-1的光子通量辐照组织样品以便在测量过程中用光化性光使组织样品有效饱和。
接通光化性光诱导一个叶绿素a荧光诱导信号，该信号具有荧光强度的一个快速上升，之后是一个缓慢下降。荧光信号在光化性光的波长以上的波长处出现。使用一个PIN光电二极管作为检测器来记录荧光瞬变的强度。光过滤用于确保仅记录较长波长(>650nm)的荧光信号，从而避免源于到达该检测器的光化性光的假象。该PIN检测器对在到达该检测器的全光谱范围上的所诱导的荧光信号的强度进行积分。
以作为演化的总时间的函数的在连续测量之间的增加的间隔记录荧光强度测量的时间序列，其中总时间轴的原点被定义为光化性光接通时的点。以下给出在接通光化性光之后在演化的总时间的不同时间窗口中针对一组信号数据记录的数据点数量，以及连续数据点之间的间隔的概述。时间间隔的选择分布是时间间隔随总时间演化而在一定程度上对数增加的一个例子。然而，其他分布可容易地被技术人员想到以便相对于作为演化的总时间的函数的荧光强度的进展的总体对数性质调整所记录的信号数据的时间分辨率。
数据点数量 间隔/s 总时间/s 时间窗口
1-30 10×10-6 (0,0–0,30)×10-3 A
31-57 0,10×10-3 (0,40-3,0)×10-3 B
58-84 1,0×10-3 (4,0-30)×10-3 C
85-111 10×10-3 0,04-0,30 D
112-138 0,10 0,40-3,0 E
139-145 1,0 4,0-10 F
出于本发明实例的目的，因此各荧光诱导数据集由145个单独测量组成，并且提供使用对数时标最佳可视化的一个时间依赖性荧光曲线。这些数据集涵盖前10秒的荧光诱导瞬变，包括快速荧光上升、峰值强度、以及缓慢下降的起点。当仅仅研究最高至且包括强度峰的荧光上升时，仅记录大约前3秒，其中仅记录第一秒可能就足够了。
参考营养状态
进行两个实验，这两个实验提供两组参考营养状态，各自涵盖具有不同水平的磷缺乏的春大麦(Quench品种)的一系列生理状态。在两种情况下，大麦植株水培生长，从而允许清楚控制每个植株可获得的营养素水平。将植株分成在两个实验之间略有不同的四个不同的处理，但是在两种情况下，它们均由一个对照处理(P0)、以及具有减小的P浓度的三个P处理(P1-P3)组成。
在两个实验中，在具有18/15℃的最低日/夜温度和每天16小时光照(最低250-300μmol光子m-2s-1)的温室中，将春大麦(Quench品种)在浸泡的Sorbix蛭石中发芽八天，并且随后在4L不透明培养单元中水培生长。这些生长单元中的营养液是基于具有以下各项的标准对照处理：200μMKH2PO4、200μMK2SO4、300μMMgSO4·7H2O、100μMNaCl、300μMMg(NO3)2·6H2O、900μMCa(NO3)2·4H2O、600μMKNO3、50μMFe(III)-EDTA-Na、0.8μMNa2MoO4·2H2O、1μMMnCl2·4H2O、0.7μMZnCl2、0.8μMCuSO4·5H2O、2μMH3BO3。然而，为了避免EDTA中毒，在转移到培养单元后的第一生长周中将微量营养素的浓度减半。
向每个培养单元中连续充入过滤后的空气并且每周更换营养液以确保所有必需营养素的最佳营养素利用度，其中诱导磷缺乏的植物的磷除外。使用超纯HCl将pH保持恒定在6.0±0.3下。
在整个实验过程中，对照处理具有足量的所有营养素，并且向P1、P2、以及P3处理供应减小量的P。在两个实验中，P1水平的意图在于估计P水平，使得P1恰好满足植物的P需求，同时避免在对照植株中存在过度摄取。基于先前经验，P1单元中的磷浓度被设定为89μM(即，89μMKH2PO4)。两个实验中的P2水平被设定为P1水平的50％，并且实验1和2中的P3水平分别被设定为P1水平的10％和25％。特别地，对于实验2，在减小KH2PO4浓度时去除的钾替换成添加另外的KCl-从而在整个实验中在所有四个处理中保持恒定的钾含量。
实验1-气候室
将发芽植株转移到32个培养单元中，每个单元含有10个植株，并且将它们分成两组(A和B)，每组具有16个单元(第1天)。在整个实验过程中，将A组在正常光线设置(400μmol光子m-2s-1)和20℃的恒温下的气候室中培养。将B组在具有与A相同的初始设置的气候室中培养，然而，当诱导降低的P水平时，将设置变成高光强度(750μmol光子m-2s-1)和15℃的恒温。每周两次将单元的位置在每个室内随机改变。
将每个气候室中的16个单元分成四个不同的P处理(对照、P1、P2、以及P3)。对于前10天，向P1、P2、以及P3单元均供应营养液P1，以避免在预先培养阶段中过度摄取P，但允许产生健康的生物质。10天后，对上述三种限制P水平进行诱导。在第21天，用一种不含磷的营养液替换全部三种限制P的处理。
在实验期间在每个气候室中对植物采样两次。在第21天进行第一次采样并且在第28天进行最后一次采样，此时P1-3植株已有七天完全得不到磷。每次采样时，使用HandyPEA分析来自每个培养单元中的五个不同植株(随后被收获)的最嫩完全展开叶，并且随后将来自每个独立培养单元的叶片汇集在一起作为一个样本并使用感应耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)进行分析。这样，获得来自每个培养单元的最嫩完全成熟叶的平均磷含量，并且使用此平均磷含量作为该培养单元中的个体植株的五个叶绿素a荧光测量中的每一个的参考值。
实验2-温室
将发芽植株转移到16个培养单元中，每个培养单元含有四个植株(第一天)，并且在与发芽期相同的温室条件下培养。将16个培养单元分成四个不同的磷处理(对照、P1、P2、以及P3)，并且每周两次随机改变它们的位置。
在前十天的过程中，所有四个不同的处理均被给予控制水平的营养素供应。在第10天，使用各自的营养液诱导P1、P2和P3水平。在第21天，将磷从P1-3处理中完全移除。在第28天，向全部培养单元供应控制水平的营养素浓度以观察磷再供给的潜在影响。
在实验期间，在第21天、第23天、第28天以及第30天对植株进行四次采样。收获来自每个培养单元的一个植株，并且在最嫩完全展开叶和第二嫩完全展开叶二者上进行叶绿素a测量。不同于实验1，随后使用ICP-OES单独分析每个叶片，从而给出每个叶绿素a荧光测量的特定参考值。
数据处理
本发明的核心优点之一在于洞悉荧光诱导瞬变进展且尤其是上升部分中的形状相关特征的适当分析产生关于相对于特定营养素而言的缺乏状态的营养素特异性信息。为此，检测并分析相对于特定营养素而言与无胁迫状态相比形状相关特征的改变。根据本发明，通过构建一个经验模型并且将这个经验模型应用到从待测植物获得的信号数据上来由这些改变确定营养状态，该经验模型在参考数据的基础上将特定参考营养状态与荧光诱导瞬变中的形状相关特征相关联。参考数据是从参考植物(即，被制备成相对于如上所述的特定营养素处于特定营养状态的植物)获得的预先记录的荧光诱导时间序列。信号数据是从待测植物获得的荧光诱导时间序列。使用多变量分析技术构建经验模型。
预处理
将预处理应用到荧光诱导数据以便增强形状相关特征。为了一个给定分析，使用相同的预处理技术对用于构建经验模型的信号数据和相应的参考数据进行预处理。可采用许多不同的预处理技术。在此呈现这些预处理技术中的两种。在一个分析中，将与通常用于红外光谱的多重散射校正相同的算法应用到选自I相周围的时间范围(在2.6ms与100ms之间)的时间依赖性荧光诱导数据的一个子集上。对于增强荧光诱导数据的进展中的形状相关特征的目的，多重散射校正算法作为预处理的效果出人意料得好。在另一个分析中，通过取得两个后续数据点的荧光信号的差异来应用数值微分。对于上述时间窗口A-F中的每一个，逐部分进行微分。
图1和图2示出通过特定营养素(此处为磷)的不同生物活性浓度的微分造成的形状相关特征的增强。图1示出具有对数/线性标度上的不同磷浓度的四个组织样品的作为时间函数的所记录的荧光诱导信号。该数据涵盖在0s–10s之间的时间间隔中的OJIP上升和随后下降的起点。图2示出通过应用到时间窗口A-F中的每一个中的荧光诱导信号上的逐部分微分预处理之后的相应数据。注意例如与健康状态(处理P0)相比，磷缺乏的植株(处理P1-P3)在约50ms处的I相周围的形状相关特征的显著改变。
图3和图4示出通过不同营养素物类的微分造成的形状相关特征的增强。图3示出来自具有对数/线性标度上的营养素特异性缺乏的组织样品的作为时间函数的荧光诱导信号。该数据涵盖在0s–3s之间的时间间隔中的OJIP上升，最高至且包括“P”处的峰。示出的荧光诱导迹线中的三个来自分别相对于磷、硫以及铜而言处于营养素缺乏状态的多个组织样品。第四个荧光诱导迹线来自健康组织样品。图4示出通过应用到时间窗口A-E中的每一个中的荧光诱导信号的逐部分微分预处理之后的相应数据。对于不同的组织样品，在形状中观察到清晰的营养素特异性差异。
经验模型
在一个分析中，由对于实验1和实验2的该组参考营养状态在0s–10s之间的时间范围中记录、通过微分预处理的荧光诱导瞬变构建一个经验模型。如上所述逐部分获得微分。通过偏最小二乘法回归构建该经验模型。约3000ppm–4000ppm的磷浓度是当植物被认为是“健康”时常用于实际农业的阈值。因此更高的磷浓度在植物中是非“生物活性的”，并且这种“过度摄取”将替代地被存储作为潜在后期需要的储备。因此针对具有低于4000ppm的独立测量磷浓度的所有那些植物构建经验模型。图5示出实验1和实验2的针对测量磷浓度(ppm)交叉验证的预测磷浓度(ppm)的图。对角线表示完美预测所希望的1:1关系。使用四个随机选择的子集进行交叉验证，并且选择潜变量的数量以最小化校正(RMSEC)的均方根误差与交叉验证(RMSECV)的RMSE之间的差异。基于霍特林的T2对残差图移除异常值。预测的可靠性的特征在于约0.8的R2值，该值表明在测量磷浓度与预测磷浓度之间的良好相关性。此外，可见3000ppm(测量的)以上的磷浓度是稍微低于预测的。与通过独立方法测量的植物中的总磷浓度相比，在荧光诱导数据的基础上预测的磷浓度的这种“截止值”与以下事实一致：荧光诱导对于包含在植物中的营养素的生物活性分数敏感，而不是对总浓度敏感。由于大麦的阈值在3000-4000ppm之间，这与以下理论完全一致：当磷浓度在3000ppm以上时，样本应倾向于被低估。
在另一个分析中，由针对实验1和实验2相对于磷而言的参考营养状态组所记录的荧光诱导瞬变的一个集合，并且由针对相对于多个营养素而言的缺乏营养状态所记录的荧光诱导瞬变的一个库构建一个经验模型，这些营养素选自下组：磷(P)、猛(Mn)、硼(B)、氮(N)、钾(K)、钙(Ca)、硫(S)、镁(Mg)、铁(Fe)、锌(Zn)、以及铜(Cu)。通过仅考虑在2.6ms与100ms之间的时间间隔中的I相周围的荧光诱导信号来选择该集合中的数据的一个子集。使用主成分分析(PCA)构建该经验模型。在进行PCA并构建经验模型之前，通过应用常用于红外光谱的预处理的多重散射校正(MSC)算法对荧光诱导瞬变进行预处理。这样的一种算法是商业上可获得的，例如在特征向量研究公司(EigenvectorResearch)的用于Matlab的PLS_toolbox7.3.1软件中。该算法出人意料地良好地起到以下作用：通过抑制时间依赖性荧光诱导信号中的低阶假象来增强荧光诱导瞬变的形状相关特征。PCA是一种无监督的多变量分析方法。因此在数据中检测到的任何模式可给出在数据中存在系统依赖性的可靠指示。图6示出前两种主成分PC1和PC2的PCA得分图，其中PC1解释上述数据集合中的74.5％方差，而PC2解释此数据中的18.7％方差。PC1和PC2一起解释该数据中的多于90％的方差。该图示出该集合中的大量单独荧光诱导瞬变，每个荧光诱导瞬变由一个点表示，其中PC1和PC2系数分别作为x和y坐标。因此每个点表示相对于一种特定营养素而言的一个特定营养状态。不同符号表示不同营养素的荧光诱导瞬变。在图的右下部分中观察到磷缺乏状态的一个清晰的集群(空心三角形)。此外，硫缺乏状态集群在图顶部的一个区域中(空心正方形)，并且铜缺乏状态似乎向左边聚集(空心圆)。这个图强调了根据本发明的方法至少对于一些营养素唯一鉴定一种营养缺乏状态，并且甚至可能定量缺乏程度的能力。
在仍然另一个分析中，在与用于以上PCA的相同的荧光诱导瞬变库上进行偏最小二乘判别分析(PLSDA)回归。然而与以上不同的是，通过逐部分微分对0s–3s的时间间隔中的整个荧光诱导瞬变进行预处理。由于PLSDA是一种不同于PCA的有监督的方法，因此通过将数据分成十个随机子集对结果进行交叉验证。在移除异常值后，使用9个潜变量制备一个PLSDA模型；给出表2中所示的混淆矩阵，以及表3中所示的混淆表。这些结果进一步确证了该方法基于荧光诱导瞬变中的形状相关特征来提供营养素特异性预测的能力。
表2
表2示出PLSDA模型(9个潜变量)的交叉验证混淆矩阵，示出对于每种类别/营养素的真阳性(TP)、假阳性(FP)、真阴性(TN)和假阴性(FN)的相对数量。就特异性而言有希望的营养素以粗体突出显示。
表3
表3：示出交叉验证的最可能的预测类别相对于参考类别的混淆表。就特异性而言有希望的营养素突出显示。PLSDA进一步支持根据本发明的方法提供有关植物营养状态的营养素特异性信息的能力，至少对于一些营养素，该方法可甚至是与缺乏状态有关的一种或多种营养素的具有高度可靠性的唯一鉴定。

Claims (15)

1.确定相对于一种或多种营养素而言一个植物的营养状态的方法，该方法包括以下步骤：
-使用一个荧光计装置记录该植物的一个组织样品的一个荧光诱导信号的一个时间序列以获得信号数据，其中该时间序列至少包括在该荧光诱导信号的上升部分内的信号数据，并且
-由应用到该信号数据的一个经验模型确定该营养状态，其中该经验模型是基于预先记录的参考数据并且将营养状态与该荧光诱导信号的时间依赖性进展中的形状相关特征相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括预处理该信号数据以增强其非线性特征的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中预处理包括归一化和/或微分。
4.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中确定该营养状态包括在该经验模型的基础上相对于该一种或多种营养素在一个分类方案中将该样品分类。
5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中确定该营养状态包括在该经验模型的基础上提供代表该植物中该一种或多种营养素的一个生物活性浓度的一个定量预测。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中使用选自偏最小二乘法回归(PLS)、或主成分分析(PCA)的组的一种多变量分析技术由该参考数据构建该经验模型。
7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，进一步包括从一个或多个时间间隔中选择所记录的参考数据和信号数据的一个子集的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该参考数据和该信号数据在以下范围中选择：在10ms与1s之间、可替代地在15ms与100ms之间、或在20ms与50ms之间。
9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该一种或多种营养素选自下组：氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、硫(S)、镁(Mg)、硼(B)、锰(Mn)、铁(Fe)、锌(Zn)、铜(Cu)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该一种或多种营养素选自下组：磷(P)、铜(Cu)、锰(Mn)以及硫(S)。
11.用于确定相对于一种或多种营养素而言一个植物的营养状态的仪器，该仪器包括：
-一个荧光计装置，该荧光计装置被配置用于记录该植物的一个组织样品的一个荧光诱导信号的一个时间序列以获得信号数据，其中该时间序列至少包括在该荧光诱导信号的上升部分内的信号数据，以及
-一个分析装置，该分析装置被配置用于通过将一个经验模型应用到该信号数据来确定该植物的该营养状态，其中该经验模型是基于预先记录的参考数据并且将营养状态与该荧光诱导信号的时间依赖性进展中的形状相关特征相关联。
12.根据权利要求11所述的仪器，其中该分析装置生成代表该植物的该营养状态的一个输出。
13.根据权利要求12所述的仪器，其中该输出是根据一个分类方案的一个分类，其中该分类是基于该经验模型。
14.根据权利要求12所述的仪器，其中该输出是在该经验模型的基础上代表该植物中该一种或多种营养素的一个生物活性浓度的一个定量预测。
15.根据权利要求12–14中任一项所述的仪器，其中该一种或多种营养素选自下组：氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、硫(S)、镁(Mg)、硼(B)、锰(Mn)、铁(Fe)、锌(Zn)、以及铜(Cu)。
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