CN105520891A - 以外源性线粒体为有效成份的组合物、其用途及修复细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭露一种以外源性线粒体为有效成份的组合物、其用途及修复细胞的方法，其中，该组合物包含有外源性线粒体，以及至少一药学上或美容上可接受的载体。更包含有一辅剂，而该辅剂选自由血清、血浆、补体及至少上述二成份的组合所组成的群。所述外源性线粒体通过离心纯化的方法自细胞中获得。该组合物具有高度安全性，而通过投予有效量的该组合物至一个体，将外源性线粒体完整地送至细胞内，达到修复受损细胞、改善或预防细胞老化的功效。

Description

以外源性线粒体为有效成份的组合物、其用途及修复细胞的方法

技术领域

本发明有关于抗老化及修复线粒体受损细胞的方法，特别指一种以外源性线粒体为有效成份的组合物、其用途及修复细胞的方法。

背景技术

线粒体为细胞内负责提供细胞能量，产生三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)。线粒体会因为细胞内能量需求或细胞压力的不同，而进行动态变化，并非一直处于单一线粒体状态。具体来说，当细胞能量需求增加时，线粒体会持续地分裂(fission)，以快速地产生三磷酸腺苷；相反地，当细胞处于饥饿状态时，线粒体会进行融合(fusion)，以降低能量的生产及利用，维持细胞正常生理功能。此外，线粒体在遭遇如膜电位降低、线粒体DNA突变(mtDNA)等受损时，也会进行融合反应，通过同源性重组(homologousrecombination)的方式，置换受损的线粒体DNA，而当线粒体内突变的DNA累积过多，以致无法进行修复时，线粒体会被自噬体(autophagosome)清除，仅留下正常的线粒体(LambCAetal.,2013)。是以，当细胞内同时具有过多受损的线粒体而无法被清除时，会使细胞走向细胞凋亡(MukhopadhyaySetal.,2014)。

线粒体的缺损与功能不全与许多疾病相关，例如：Leber遗传性视神经萎缩症(Leber'shereditaryopticneuropathy)类中风发作症候群(MitochondrialEnephalomyopathy，LacticAcidosis,andStrokelikeEpisodes，MELAS)、肌抽跃癫痫合并红色褴褛肌纤维症(MyoclonicEpilepsyAssociatedWithRagged-RedFibers，MERRF)等。另外，神经退化性疾病，例如亨丁顿舞蹈症、阿兹海默症、帕金森氏症等疾病也与线粒体分裂融合的能力失调相关(GhavamiSetal.,2014)。此外，老化现象或年纪增长会使线粒体中突变DNA增长并且累积，而导致相关疾病的产生，例如老年黄斑部病变(age-relatedmaculardegeneration，AMD)(BrennanLAetal.,2014；JarrettSGetal.,2010)与皮肤老化等(BlattTetal.,2005；MakrantonakiEetal.,2007)。

为能延缓皮肤老化，人们会使用许多美容保养产品，例如玻尿酸、维生素A与维生素C、抗氧化剂、防晒剂等，或是寻求医学美容诊所改善老化现象，例如雷射、肉毒杆菌、电波拉皮等。但是，目前现有的美容方法皆无法自根本改善或延缓皮肤老化现象的发生。另有研究证实，注射间质干细胞能有效地改善皮肤皱纹等老化现象，而使干细胞疗法被认为是延缓皮肤老化的契机。然而实际上，干细胞取得不容易，大量培养须耗费过多时间与金钱，并且，干细胞移植具有突变产生肿瘤或是产生排斥反应等风险。因此，目前仍未有一种安全性高且能确实有效地改善皮肤老化现象的方法。

在1989年的研究指出，给予外源性线粒体与细胞共同培养，必须通过直接注射或膜融合后，线粒体始能进入细胞内，使带有基因缺陷的线粒体的细胞恢复正常功能(KingMPetal.,1988；KingMPetal.,1989)。许多研究也证实，单纯将细胞与线粒体共培养，无法使线粒体进入细胞内(ChangJCetal.,2013；SpeesJLetal.,1989)，因而也无法得知直接给予外源性线粒体是否能进入细胞。而由先前技术的内容可知，不同细胞对于摄入外来线粒体的能力可能不同，因此，在线粒体进入细胞的途径不明前，研究人员无法通过调整实验条件，使与线粒体相关的实验加以重复实施。

再者，虽然细胞通过吞噬作用(phagocytosis)摄入外源物质，如细菌等，但是，经吞噬途径被摄入的外源物质会与溶酶体(lysosome)形成吞噬溶解小体(phagolysosome)，而使外源物质降解。因此，一般认为，外源线粒体无法通过吞噬作用，而保留在细胞内，并修复内生性线粒体。而近期研究利用如美国专利第8648034号所揭细胞穿膜胜肽，或如美国专利公开第20130022666号所揭微脂体包覆线粒体，用以帮助线粒体与细胞膜融合而易于进入细胞内，提高细胞的氧化呼吸作用。但是，上述方法虽然可以促进线粒体送入细胞中，但其所使用的载体，如穿膜胜肽与微脂体，可能会引起线粒体与细胞膜破裂，造成线粒体的损伤与目标细胞的毒性。

发明内容

本发明的主要目的即在于提供一种组合物，其包含有效量的外源性线粒体。

本发明的次一目的在于提供该组合物的用途，其用以修复受损线粒体或改善细胞老化。

本发明的另一目的在于提供一种修复细胞的方法，其将有效量的外源性线粒体投予至一个体中，使该外源性线粒体完整地被送至细胞内，据以达成修复受损细胞、改善或预防细胞老化的功效。

为能达成上述目的，本发明的一实施例所揭一种组合物，其包含有一外源性线粒体，以及至少一药学上或美容上可接受的载体。

较佳地，该组合物更包含有一辅剂，而该辅剂为血清、血浆、补体或至少上述二成份的组合所组成的群。

较佳地，所述外源性线粒体由细胞中萃取而得。

较佳地，所述外源性线粒体通过离心纯化的方法自细胞中获得。

在本发明的另一实施例中，上述医药组合物的用途用以改善皮肤细胞的老化现象。

在本发明的又一实施例中，上述组合物的用途用以修复受损细胞。

本发明的一实施例中所揭一种修复细胞的方法，其将一有效量的外源性线粒体投予至一个体，使所述外源性线粒体进入细胞中，取代受损或老化的线粒体。

较佳地，所述外源性线粒体在投予至该个体前，以由血清、血浆及补体所组成的群中至少一成分进行前处理。

本发明的有益效果为：

其一、使用外源性线粒体能克服已知技术中，以异体细胞移植所引发的排斥；

其二、外源性线粒体由一般细胞株或活体取得，来源广泛，并且不会对人体健康有所危害，例如，已知的细胞移植技术，可能会导致癌症或肿瘤的发生；

其三、外源性线粒体能直接进入细胞，与内生性线粒体融合，取代老化细胞或受损细胞中的受损线粒体，达到减低细胞的氧化压力以及恢复细胞正常功能的功效，并且能够提供细胞长久直接的保护；

其四、外源性线粒体以血清或补体处理后，能够完整地进入细胞，并且避免以如穿膜胜肽或微脂体(liposome)处理所引起的细胞毒性；

其五、外源性线粒体能根本性地改善皱纹及皮肤老化的现象，并且有效地促使胶原蛋白合成增加。

据此，本发明所揭医药组合物具有高度安全性，而通过投予有效量的医药组合物至一个体，通过外源性线粒体进入细胞中，而能达到修复线粒体受损细胞及改善老化现象的功能。

附图说明

图1为具有红色荧光标定的线粒体与经绿色荧光lysotracker染色的BHK细胞，共同培养一小时后，摄入的线粒体与细胞内溶酶体(lysosome)相对位置的结果。

图2为具有红色荧光标定的线粒体与BHK细胞共同培养四小时后，摄入的线粒体与细胞内溶酶体相对位置的结果。

图3A及图3B为以扫描式电子显微镜观察外源性线粒体被细胞吞噬的情形，其中，图3A中的方框表示，低倍率下正被吞噬的线粒体；图3B中的箭号指出，高倍率下正被细胞伪足吞噬的线粒体。

图4为具有红色荧光标定的线粒体与以鬼笔环肽(phalloidin)-FITC染色的BHK细胞共同培养四小时后，观察线粒体进入BHK细胞的结果，其中，白色横条标示10μm。

图5为以抗生素actinomycinD(ActD)处理BHK细胞后，红色线粒体进入BHK细胞的结果。白色横条标示10μm。

图6为图4与图5，处理或不处理AcD的BHK细胞，具有外源性线粒体的细胞比例的统计结果。

图7A为未经补体处理的外源性红色线粒体与带有绿色荧光线粒体的BHK细胞共同培养四小时后，摄入的线粒体与细胞内线粒体相对位置的结果，其中，箭头标示黄色荧光，代表外源性与内生性线粒体在细胞内位置重叠。

图7B为以经C3补体10μg/mL处理的外源性线粒体与带有绿色荧光线粒体的BHK细胞共同培养四小时后，摄入的线粒体与细胞内线粒体相对位置的结果，其中，箭头标示黄色荧光，代表外源性与内生性线粒体在细胞内位置重叠。

图7C为以共轭焦显微镜观察并分析图7B中的红色线性区域，表示外源性线粒体的红色荧光及代表内生性线粒体的绿色荧光信号重叠的情形。

图8A为以电子显微镜观察未经处理的线粒体的外观。

图8B为以电子显微镜观察经血清处理的线粒体的外观。

图8C为以电子显微镜观察经C3补体处理的线粒体的外观。

图8D为以电子显微镜观察经Pep-1穿膜胜肽处理的线粒体的外观。

图9A为外源性线粒体与HUVEC细胞共同培养后，该线粒体进入HUVEC细胞的结果。

图9B至图9D分别为经不同处理的各组HUVEC细胞进行SAβ-gal染色后的结果。

图10为以共轭焦显微镜观察带有红色荧光蛋白的外源性线粒体进入小鼠真皮层纤维母细胞的情形。

图11A至图11D分别为以显微镜观察，经外源性线粒体处理后，第一至四组裸鼠的皮肤表面的影像。

图12为经外源性线粒体处理后，各组裸鼠的表皮皱纹的粗糙度分析结果。

图13A至图13D为各组裸鼠的皮肤组织切片以梅生三色(Masson’strichome)染色后的结果。

具体实施方式

除非另有定义，在本发明的说明书及权利要求所使用的技术及科学名词的意义，其与本发明所属技术领域且具通常知识者的一般理解相同。若有矛盾的情形，以本发明内容为准。

所谓“有效量”一词指要产生所求特定效果所需化合物或活性成份的量，以其在组合物中所占重量百分比表示。如同本发明所属技术领域中具有通常知识者所了解，该有效量会因为要引起特定效果的投予途径而有所不同。一般来说，活性成分或化合物在组合物中的量可占该组合物重量的约1％至约100％，较佳者为约30％至约100％。

所谓“药学或美容产品上能接受的载体”一词包含任何标准在医药或美容产品上所使用的载体，而该载体依据组合物的形态，为固态、半固态或液态。举例来说，载体包含，但不限于，明胶、乳化剂、烃类混合物、水、甘油、生理食盐水、缓冲生理盐水、羊毛脂、石蜡、蜂蜡、二甲基硅油、乙醇。

所谓“组合物”一词包含一有效量的要产生特定效果的所需化合物或活性成份，以及至少一载体。而如同本发明所属技术领域中具有通常知识者所了解，组合物的形态随着要引起特定效果的投予途径有所不同，如锭剂、粉剂、针剂等，并且，该载体也随着组合物的形态而为固态、半固态或液态。

所谓“投予”一词指将一物递送至一个体特定部位、特定细胞、特定靶点的方式，或其与个体接触作用的途径，一般来说，投予途径包含有，但不限于，口服、涂抹、喷洒、吸入、注射等。

以下，为能更进一步说明本发明的功效，将举若干实施例作详细说明，但是，该实施例为用以解说的例示，其中所使用的任何词汇并不限制本发明说明书及权利要求的范围及意义。

实施例一：荧光标定线粒体

将带有线粒体信号肽(mitochondriasignalpeptide)的红色荧光蛋白DsRed或是绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein)转染至幼仓鼠肾脏纤维母细胞(babyhamsterkidneyfibroblastcells，BHK-21cells，以下简称BHK细胞)中，通过G418抗生素及流式细胞分选仪的筛选，得到能够持续表现红色荧光蛋白的RedM-BHK细胞或GFP-BHK细胞。

实施例二：自BHK细胞分离线粒体

当BHK细胞的细胞数养至2×10⁸时，细胞培养皿加入SEH缓冲液(0.25M的蔗糖、0.5mM的EGTA及3mM的HEPES-NaOH，pH值7.2)清洗，并且以1000xg离心3分钟，移去上清液后，加入2毫升的SEH缓冲液，在Dounce均质器中研磨约15次，并在冰上操作，以降低对于细胞及线粒体的伤害。研磨完成后，将均质液进行离心，以1000xg离心15分钟，除去沉淀物，再以9000xg离心10分钟，最后沉淀物以50μL的SEH缓冲液溶解后，加入蛋白质分解酵素的抑制剂，在4℃保存。

实施例三：确定线粒体进入细胞内的途径

在本实施例中，为追踪线粒体进入细胞内的移动路径，将通过加入外源性线粒体，在不同时间观察线粒体移动的位置与溶酶体的关系。

首先，以红色荧光蛋白DsRed标定线粒体，并且，以带有绿色荧光的溶酶体染剂(LysoTracker)转染BHK细胞，用以确定细胞内溶酶体的位置。给予5μg的标定红色荧光蛋白的外源线粒体，与已处理溶酶体染剂的BHK细胞在室温下共同培养，在培养一小时及四小时时，在共轭焦显微镜观察外源性线粒体进入BHK细胞的情形以及其与溶酶体的相对位置，结果如图1及图2所示。

由图1可知，带有红色荧光的外源性线粒体在培养一小时后，其分布于BHK细胞外围。而由图2可知，在培养四小时后，部份带有红色荧光的外源性线粒体与绿色荧光的溶酶体染剂信号重叠。通过上述结果可知，外源性线粒体进入细胞后会与溶酶体位于细胞内的同一位置，推知外源性线粒体通过吞噬作用进入细胞内。

更进一步地以扫描式电子显微镜观察外源性线粒体进入BHK细胞的情形，如图3A及B所示，其中，图3A为在低倍率下的观察结果，而由其内方框显示正在被细胞吞噬的线粒体；而图3B为在高倍率下观察的结果，图中箭头指出正在被细胞伪足吞噬的线粒体。因此，由图3A及图3B的结果显示BHK细胞通过伸出伪足(pseudopodia)包覆外来线粒体，证实外源性线粒体进入细胞的路径为吞噬作用。

再者，将BHK细胞以鬼笔环肽(phalloidin)-FITC染色，用以标定细胞内的肌动蛋白，以及显示细胞形态。将上述已染色的BHK细胞与以红色荧光标定的外源性线粒体在37℃下培养4小时后，可发现大量线粒体体入细胞内，如图4所示。然而，以20μM的抗生素actinomycinD(简称ActD)处理BHK细胞，使BHK细胞的吞噬作用被抑制，则可发现外源性线粒体完全无法进入细胞内，如图5所示。而将外源性线粒体进入上述依据不同处理后的细胞内的数目加以统计，结果如图6所示。

由上述结果可知，当单纯将外源性线粒体给予细胞，细胞会通过吞噬作用摄入线粒体，使线粒体得以进入细胞内。

实施例四：血清有助于线粒体进入细胞

取稀释后的市售胎牛血清(GIBCO)将以标定红色蛋白的外源性线粒体与血清混合一小时，经离心去除上清液中的血清，再将沉淀后的线粒体以SEH缓冲液回溶至原本的体积。将BHK细胞以鬼笔环肽(phalloidin)-FITC染色，通过该染剂与F-肌动蛋白的特异性结合，界定出细胞膜的界线。

将BHK细胞分为四组，其中，第一组为空白组；第二组为混合稀释1000倍的血清；第三组为混合稀释500倍的血清；第四组为混合稀释100倍的血清。再自上述SEH溶液中抽取其中的线粒体，将之与各组的BHK细胞在37℃下共同培养4小时，以雷射共轭焦显微镜观察带有红色荧光的线粒体进入细胞的情形，并且分析单一细胞内含有红色线粒体的数量，结果如下表一所示，其中，表一为以one-wayANOVA检验的统计方法进行分析。星号表示p值小于0.05，代表与第一组控制组间具有统计上的显著差异。

表一：各组BHK细胞内所含有的外源性线粒体比例及平均数量

由上表一的结果可知，在血清存在的条件下，具有外源性线粒体的细胞数量以及其进入单个细胞内的数量分别较未经血清处理时显著增加。由此可知，通过血清处理外源性线粒体或细胞有助于提升外源性线粒体进入细胞的效率。

实施例五：补体有助于线粒体进入细胞

将经红色荧光蛋白标定的外源性线粒体与一预定浓度的C3补体混合一小时，经离心去除上清液中的C3补体，将沉淀后的该外源性线粒体的SEH缓冲液回溶至原本体积。

第一组为未处理组。第二组至第五组分别以浓度为0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL及20μg/mL的C3补体(Sigma-Aldrich)处理的外来线粒体5μg，在37℃下共同培养4小时后，以雷射共轭焦显微镜分别观察各该组细胞中的红色荧光，并且通过流式细胞仪计算出各该组细胞中含有该外源性线粒体的比例，并且进一步进行量化统计。外来线粒体进入细胞后，与内生性线粒体融合的情形如图7A至图7C所示。

请参图7A及图7B中，各该图中箭头所指处为黄色荧光，表示外源性线粒体与内生性线粒体在细胞内重叠，并且，由图7C可知红色荧光信号与绿色荧光信号彼此重叠。因此，由图7的结果可知，无论有无处理补体，被细胞摄入的该外源性线粒体与细胞内原本的线粒体位于细胞内同一位置，显示外源性线粒体与内源性线粒体彼此间有融合的现象，并且能够逃脱吞噬溶解小体(phagolysosome)而进入细胞质当中。

再者，通过流式细胞仪分析的结果可知，在未经C3补体处理的第一组中，平均约有26.16±4.75﹪的细胞被侦测到具有红色荧光；第二组中为平均约有43.43±3.5﹪的细胞被侦测到具有红色荧光；在第三组的细胞中，平均约有65.13±7.5﹪的细胞被侦测到具有红色荧光；在第四组的细胞中，平均约有78.97±13.35﹪的细胞被侦测到具有红色荧光；在第五组的细胞中，则约有80﹪的细胞被侦测到具有红色荧光；并且，第二至五组为分别与第一组间具有显著差异(p<0.05)。

由上述结果证实，通过给予补体至外源性线粒体，可显著提升该外源性线粒体进入细胞的比例，并且，被摄入的外源性线粒体得与内源性线粒体融合，此外，随着给予补体的浓度增加，也使进入细胞内的外源性线粒体数量增加。

实施例六：血清或补体不会破坏分离出的线粒体

将分离出的外源性线粒体分为四组，各组5μg。其中，第一组为空白组，第二组为以100倍稀释的胎牛血清处理该外源性线粒体，第三组为以浓度10μg/mL的C3补体处理该外源性线粒体，第四组为以100nM的穿膜胜肽(cellpenetratingpeptide)Pep-1处理该外源性线粒体。将各组在37℃下培养4小时，以穿透式电子显微镜分别观察各组外源性线粒体的外观，结果如图8A至图8D所示。

由图8A至图8D的结果可知，第二组及第三组的线粒体的外观分别类似于未经任何处理的第一组线粒体的外观。而相较于第一组，第四组中经穿膜胜肽处理的外源性线粒体则明显肿大，并且具有破裂的情形。因此，相较于穿膜胜肽，血清或是补体的毒性较低，并且不会破坏线粒体的外观，而能维持线粒体进入细胞后的完整性。

实施例七：培养人类脐带内皮细胞

人类脐带内皮细胞(humanumbilicalvascularendothelialcells，下称HUVEC细胞)购自新竹食品工业发展研究所。HUVEC细胞培养在M199培养基，并加入10％的胎牛血清、0.1％的肝素以及0.03％的内皮细胞生长因子(endothelialcellgrowthsupplement)。HUVEC细胞可在0.1重量百分比的明胶被覆(gelatin-coated)的培养皿上生长。

实施例八：线粒体可延缓细胞老化

先自人类纤维母细胞HS68抽出线粒体，用以作为外源性线粒体的来源。各组5μg。再将该线粒体以补体处理后，以红色荧光的线粒体追踪染剂(Mitotracker)将该线粒体染色。

另，以过氧化氢处理初代培养的HUVEC细胞，使其老化。培养到第8代的该HUVEC细胞(8×10⁵cell/well)以100μM过氧化氢在37℃处理2小时，以磷酸盐缓冲液清洗，除去过氧化氢，并以正常细胞培养液培养一天后，分为三组，其中，第一组为未加入线粒体的空白组，第二组为加入未经补体处理的该线粒体，第三组为加入经补体处理的该线粒体。而各该组细胞分别培养4小时后，分别进行SAβ-gal(Senescence-associatedβ-galatosidase)染色，以及Ki67及BrdU的染色分析。

而Ki67及BrdU的染色流程为本发明所属技术领域且具通常知识者的一般周知技术，故在此不加以赘述。

SAβ-gal染色的流程如下：细胞先以磷酸盐缓冲液清洗，以2％的多聚甲醛(paraformaldehyde)、0.2％的戊二醛(glutaraldehyde)固定5分钟，再以染色液在37℃下作用12小时，其中，该染色液包含有1mg/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，BCIG或X-gal)、40mM的柠檬酸磷酸盐缓冲液(citricacid/phosphatebuffer)(pH6.0)、5mM的铁氰化钾(potassiumferricyanide)、5mM的铁氰化钠(sodiumferricyanide)、150mM的氯化钠及2mM的二氯化镁。而后，以0.5﹪的伊红(Eosin)将细胞染色，在显微镜下进行观察。

以SAβ-gal染色后的结果如图9A至图9D所示。由图9A可知外源性线粒体能进入HUVEC细胞。由图9B至图9D可知，第一组的HUVEC细胞有明显染上SAβ-gal。第二组的HUVEC细胞虽然有被SAβ-gal染色，但是相较于第一组，第二组中被染色的HUVEC细胞数量明显下降。而相较于第一组或第二组，第三组中的HUVEC细胞则几乎未染上SAβ-gal。更进一步地将染色结果进行统计分析，得知第一组细胞中约有85±12.3％的细胞被染色，第二组细胞中约有60.1±6.8％的细胞被染色，而第三组细胞中有25±6.2％的细胞被染色。

再者，将Ki67及BrdU的染色结果进行计数后可知，第一组的HUVEC细胞中染上Ki67及BrdU的比例为13.3％及13％。相较于第一组，第二组的HUVEC细胞中染上Ki67及BrdU的比例增加，分别为35％及33％。而第三组中的HUVEC细胞染上Ki67及BrdU的比例为最高，分别为71％及59.6％。并且，当所投予的线粒体以胎牛血清处理时，也能达到与以补体处理时的一样功效。

由上述结果可知，外源性线粒体进入细胞能有效降低细胞老化的程度、增加细胞生长以及提高细胞复制的效率，并且，随着外源性线粒体进入细胞的数量增加而能更显著地降低细胞老化的程度，使处于分裂状态的细胞增加，以增加细胞复制与生长。据此，通过投予本发明所揭含有外源性线粒体的医药组合物至一个体，能有效改善或延缓其细胞老化的程度，并且当该医药组合物中具有促进线粒体进入细胞的成份时，如血清、血浆或补体，更能显著提升其功效。

实施例九：动物实验(一)

自RedM-BHK细胞抽取带有红色荧光的线粒体，并且以100倍稀释的胎牛血清或10μg/mLC3补体加以处理。取48周龄的自然老化裸鼠，将该线粒体注射至该裸鼠的皮下组织，待一小时后，取该裸鼠的全皮，以4％多聚甲醛固定5分钟后，静置于0.1M的磷酸盐缓冲液至该样品沉下，再以冷冻包埋剂(O.C.T)浸润及包埋样品，进行冷冻切片，而切片的厚度约为12μm。封片后以共轭焦显微镜观察，结果如图10所示。

图10为线粒体移植后，在裸鼠的真皮层区域。蓝色荧光为经DAPI染色的纤维母细胞细胞核，红色荧光为自RedM-BHK细胞所分离出的线粒体，由图10的结果显示，移植后该线粒体能进入真皮内的纤维母细胞中。

实施例十：自肝脏细胞分离线粒体

首先，将小鼠深度麻醉后牺牲，以生理食盐灌流该小鼠全身，待其肝脏中的血液去除干净。取出约1立方公分的肝组织，加入约6毫升的SEH缓冲液，经过组织研磨机研磨后，离心1000xg，离心15分钟，再取其上清液。并且，同时在离心管中依次加入浓度为55％、40％、30％的蔗糖液，获得一30～55％蔗糖梯度离心管。将经离心步骤所获得的该上清液加到该梯度离心管的上层，经过35000rpm离心30分钟，在40％与55％的分层间形成一透白层。吸取该透白层出来约有1毫升而收集在15毫升的离心管中，再加入5毫升的SEH缓冲液，离心13000xg，离心3分钟后，去除上清液，并且，重复上述离心步骤三次，最后，以200μL的SEH缓冲液回溶线粒体沉淀物，再加入蛋白质分解酵素的抑制剂，在4℃保存。

实施例十一：动物实验(二)

取32只48周龄的自然老化裸鼠，分为4组，每组8只，分别以不同条件处理12周，其中，第一组为无治疗组，第二组为每周注射1000μg的肝脏线粒体至各该小鼠，第三组为每周注射1000μg经补体处理的肝脏线粒体至各该小鼠，第四组为每周注射1000μg经血清处理的肝脏线粒体至各该小鼠。而第二组至第四组小鼠的皮下注射方式为将约5000μg/mL的肝脏线粒体平均注射在各该裸鼠背部上的20个点，在每个点注射0.01毫升，总注射量为0.2毫升。为除去单纯补体与血清对皱纹的影响，施打补体与血清处理的线粒体前，实验以高速离心两次的方式去除残留在上清液中的补体与血清。

试验完成后，如实施例九中所述流程将取自各该组裸鼠的全皮进行照相、组织冷冻切片及染色。皮肤照相结果如图11A至图11D所示，并且，更进一步分析各该组裸鼠的表皮皱纹粗糙度，结果如图12所示，其中，*表示与第一组间具有显著差异。另以梅生三色染色法(Masson’strichrome)将各该组裸鼠的皮肤组织进行切片染色，用以显示其真皮胶原蛋白层的含量，结果如图13A至图13D所示。

由图12的结果可知，有注射外源性线粒体的第二组至第四组所观察到的皱纹皆较无处理的第一组明显降低，其中，第三组及第四组裸鼠皮肤上的皱纹分别较第二组更为轻微。再者，由图13的结果可知，第一组表皮层厚度最厚，而第二组至第四组的表皮层厚度皆较第一组下降，并且，其胶原蛋白层的染色分别较第一组变深。

综合图11至图13的结果可知，投予本发明所揭外源线粒体能进入活体细胞，并能有效降低皱纹的产生，以及提升表皮纤维母细胞内产生胶原蛋白的能力，并且，由于血清或补体能促使外源线粒体进入细胞中，是以，经血清或补体处理过的外源线粒体具有更加抗老化的能力。由此可知，本发明所揭含有外源性线粒体的医药组合物确实能达到延缓或改善皮肤老化的功效。

由上述实施例结果可知，本发明所揭外源性线粒体及以其为活性成份的医药组合物具有以下优点：

其一、使用外源性线粒体能克服已知技术中，以异体细胞移植所引发的排斥；

其二、外源性线粒体由一般细胞株或活体取得，来源广泛，并且不会对人体健康有所危害，例如，已知的细胞移植技术，可能会导致癌症或肿瘤的发生；

其三、外源性线粒体能直接进入细胞，与内生性线粒体融合，取代老化细胞或受损细胞中的受损线粒体，达到减低细胞的氧化压力以及恢复细胞正常功能的功效，并且能够提供细胞长久直接的保护；

其四、外源性线粒体以血清或补体处理后，能够完整地进入细胞，并且避免以如穿膜胜肽或微脂体(liposome)处理所引起的细胞毒性；

其五、外源性线粒体能根本性地改善皱纹及皮肤老化的现象，并且有效地促使胶原蛋白合成增加。

据此，本发明所揭医药组合物具有高度安全性，而通过投予有效量的医药组合物至一个体，通过外源性线粒体进入细胞中，而能达到修复线粒体受损细胞及改善老化现象的功能。

以上仅是通过各该实施例详细说明本发明，熟知该技术领域者在不脱离本发明精神下，而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化，均应为本案权利要求所涵盖。

参考文献

LambCA,YoshimoriT,ToozeSA(2013)Theautophagosome:originsunknown,biogenesiscomplex.NatRevMolCellBiol14:759-774.

MukhopadhyayS,PandaPK,SinhaN,DasDN,BhutiaSK(2014)Autophagyandapoptosis:wheredotheymeet？Apoptosis19:555-566.

GhavamiS,ShojaeiS,YeganehB,AndeSR,JangamreddyJR,etal.(2014)Autophagyandapoptosisdysfunctioninneurodegenerativedisorders.ProgNeurobiol112:24-49.

BrennanLA,KantorowM(2009)Mitochondrialfunctionandredoxcontrolintheagingeye:roleofMsrAandotherrepairsystemsincataractandmaculardegenerations.ExpEyeRes88:195-203.

JarrettSG,LewinAS,BoultonME(2010)Theimportanceofmitochondriainage-relatedandinheritedeyedisorders.OphthalmicRes44:179-190.

BlattT,LenzH,KoopU,JaspersS,WeberT,etal.(2005)Stimulationofskin'senergymetabolismprovidesmultiplebenefitsformaturehumanskin.Biofactors25:179-185.

MakrantonakiE,ZouboulisCC(2007)Molecularmechanismsofskinaging:stateoftheart.AnnNYAcadSci1119:40-50.

KingMP,AttardiG(1988)InjectionofmitochondriaintohumancellsleadstoarapidreplacementoftheendogenousmitochondrialDNA.Cell52:811-819.

KingMP,AttardiG(1989)HumancellslackingmtDNA:repopulationwithexogenousmitochondriabycomplementation.Science246:500-503.

ChangJC,LiuKH,LiYC,KouSJ,WeiYH,etal.(2013)FunctionalrecoveryofhumancellsharbouringthemitochondrialDNAmutationMERRFA8344Gviapeptide-mediatedmitochondrialdelivery.Neurosignals21:160-173.

SpeesJL,OlsonSD,WhitneyMJ,ProckopDJ(2006)Mitochondrialtransferbetweencellscanrescueaerobicrespiration.ProcNatlAcadSciUSA103:1283-1288.

Claims (8)

1.一种组合物，其特征在于，包含有外源性线粒体，以及至少一药学上或美容上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，更包含有一辅剂，而该辅剂选自由血清、血浆、补体及至少上述二成份的组合所组成的群。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述外源性线粒体由细胞中萃取而得。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述外源性线粒体通过离心纯化的方法自细胞中获得。

5.一种如权利要求1所述的组合物的用途，其特征在于，在制备改善或预防皮肤细胞的老化现象的药物中的应用。

6.一种如权利要求1所述的组合物的用途，其特征在于，在制备修复线粒体受损细胞的药物中的应用。

7.一种修复细胞的方法，其特征在于，将一有效量的外源性线粒体投予至一个体，使所述外源性线粒体进入细胞中，取代受损或老化的线粒体。

8.如权利要求7所述的抗细胞老化的方法，其特征在于，所述外源性线粒体在投予至该个体前，以由血清、血浆及补体所组成的群中至少一成分进行前处理。