CN105489466B - 配备磁力固定的弹簧钢板的maldi载板 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在飞行时间质谱仪中通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)来分析有机样本的样本载板结构，样本载板的表面必须具有高度的平面性以获得高的质量精确度。本发明在于，作为样本载板的低成本弹簧钢板设置在尺寸稳定和精确成形的基础结构上，基础结构例如用铝合金制造并使用内嵌磁铁，从而弹簧钢板是可以拆卸的，例如通过使所形成的主体具有商品化微量滴定板的尺寸，来使得该主体在整体上适于用在机器人中。放置样品的表面的平面性在近处区域内由弹簧钢板本身提供，在远处区域中在整个弹簧钢板上由基础结构提供。弹簧钢板是一次性使用的，以满足例如IVD诊断性产品的法规要求。弹簧钢板可设置有标识码、样本点记号和用于各种分析任务的预涂层。

Description

配备磁力固定的弹簧钢板的MALDI载板

技术领域

本发明涉及用于在飞行时间质谱仪中分析有机样本的样本载板的结构，该质谱仪通过基质辅助激光解吸电离被分析物，目前对质量精确度的要求意味着样本载板的表面必须具有高度的平面性。

根据本发明，使用内嵌式磁铁来将作为样本载板的非常平的、薄的、弹性的且成本低廉的弹簧钢板固定在具有精确形状和空间稳定的基础结构上，该基础结构可由例如铝合金加工而成，这样可制备一块复合样本载板，该复合样本载板可以放入离子源中，但是例如通过给定复合样本载板商业化的微量滴定板的尺寸，还可以将该复合样本载板用于样品制备机器人。放置样品的表面的平面性在近处区域内是由弹簧钢板本身提供的，在远处区域中表面的平面性在整个弹簧钢板上由基础结构提供。该弹簧钢板是一次性使用的，以满足IVD诊断性产品的法规要求。其可设置有标识码、样本点标记和用于各种分析任务的预涂层。

背景技术

通过基质辅助激光解吸(MALDI)电离的质谱仪已成为生物分子分析的一种标准方法。通常使用飞行时间质谱仪。其通过测量离子从样本载板的表面至离子检测器的飞行时间来确定离子质量。

为满足当今对质量测量精确度的要求，样本载板上所有样品中的离子必须通过长度精确已知的飞行路径。如果假定飞行路径为2米长，这在商业化质谱仪中是常见的，这就意味着飞行距离仅1微米的偏差会导致飞行时间偏差千万分之五，由此计算出的质量也会偏差百万分之一(1ppm)。但目前的质量测量希望获得的偏差仅为千万分之几。这意味着，不同样品间的飞行路径长度的偏差必须控制在1/10微米的范围内。

由于样本载板通常会以精确的x-y运动单元移动，以使每个待分析的样品处于轨迹的轴线上，所以样本载板的平面性发挥非常重要的作用。可以通过测量在整个样本载板上分布的质量参比样本图案来考虑在大面积上的平面度偏差或样本载板的轻微倾斜，因为这些测量可给出参比样本与离子检测器之间的精确距离的图案。但是，当通过飞行时间计算质量时，必须能够对位于质量参比样本之间的分析样本的进行非常精确的插值。因此样本载板必须没有波浪形。

现代的飞行时间质谱仪使用的移动装置可以通过测量质量参比样本来机械地消除样本载板的任何倾斜。这种机械校正与线性数学插值等效，但线性插值要求样本载板的平面性在大面积上没有任何曲面。

对于在样本载板上制备样品来说，存在制备具有埋入的分析物分子且厚度仅为约1微米的薄基质层的许多方法，这些方法还提供相对较好的厚度重现性。

根据等同文件DE 101 40 499 B4、GB 2 378 755 B和US 6,670,609 B2(J.Franzen，2001)已知一种复合板，其包括位于基础结构上的约3至4毫米厚的不锈钢板，基础结构通过注射成型或甚至采用塑料材料制备，这种复合板的形状精度低。远处和近处区域的平面性仅由不锈钢板来提供。但是，已经发现，机加工(切割和铣削)会使这种厚度的不锈钢板变形，所产生的内应力使得不锈钢板无法提供目前所要求的平面性。

等同文件DE 102 30 328 B4、GB 2 391 066 B和US 6,825,465 B2(M.Schürenberg，2002)描述了弹性导电的薄塑料板如何通过边缘夹紧固定在实心的基础结构上，其平面性差不多仅由基础结构来提供。这同样不能满足目前对平面性的要求。

文件WO 2005/037434 A1(McCarthy et al.，“MALDI Plate with RemovableMagnetic Insert”)解释了具有至少一个磁性部件的样本载板如何通过磁铁固定在框架中。这里，平面性必须仅由样本载板提供。

因此，需要一种能够提供所需的平面性的样本载板，其生产成本低廉，同时如可能的话，能够满足其他要求，例如IVD方法的一次性使用要求以及可以在移液机器人中使用。

发明内容

本发明提出以下设计，通过内嵌在基础结构中的以图案布置的磁铁，将弹簧钢板可拆卸地固定在尺寸非常精确的基础结构上，弹簧钢板生产成本低廉，仅约0.1至0.8毫米厚。经验表明，弹簧钢板是极其平坦的(但具有感觉不到的弯曲度)。基础结构可以采用例如铝合金制造，铝合金可以非常精确地加工而不产生任何应力，并且内嵌磁铁。从而，利用基础结构和弹簧钢板形成主体形状，例如通过使主体形状具有商业化微量滴定板的标准尺寸，来使主体形状适用于被引入离子源内并适用于移液机器人或其他机器人。

如果正确制造，那么弹性的弹簧钢板具有反射的、非常平坦且无波浪形的表面，虽然整体上可以是具有感觉不到的弯曲度的。这里可排除球形曲面；实际上仅有圆柱形曲面。可通过磁铁完全消除圆柱形曲面，磁铁将载板强力拉至具有适宜精度的基础结构支撑面上。这样，样品的表面的平面性在近处区域中由弹簧钢板提供，在远处区域中在整个弹簧钢板上由基础结构提供。很明显，根据WO 2005/037434 A1，不可能通过单个磁铁来消除圆柱形曲面。

可采用大的弹簧钢板(例如轧制板)通过非常柔和的切割方法(例如水喷射切割或特别是皮秒激光切割)制造弹簧钢板。这样可以大批量高精度生产，基本上无毛刺、无应力且价格低廉。仅需少量机械抛光。

弹簧钢板设计成一次性使用的，以便还能满足IVD诊断性产品的法规要求。弹簧钢板可设计成带有标识码、样本点记号和用于各种分析任务的预涂层。

附图说明

图1示出整体结构，该整体结构包括基础结构1、基础结构1的底部边缘3和形成框架的顶部边缘2，弹簧钢板4嵌入并用磁铁固定在顶部边缘2中。弹簧钢板4通过封闭圈和条形码标签8固定样本点5、6、7。

图2举例示出不带弹簧钢板的基础结构的平面图，即底部边缘3、用于嵌入钢板的顶部边缘2、用于弹簧钢板的精密支撑面12、容纳任何可能的毛刺的沟槽11、磁铁9和减重切割部分10。

图3示出基础结构的横截面。图3的上部示出位于基础结构上方的夸大地弯曲的弹簧钢板4。在图3的下部，通过磁铁(未显示)将弹簧钢板4拉至基础结构的支撑面12上，从而弹簧钢板4不再存在弯曲。

图4示出具有插槽14和一些插入的弹簧钢板4的贮存盒(不带盖)。

具体实施方式

例如，如图1所示，本发明提供一种方案，其中，利用以一定图案布置的多个内嵌磁铁将一块非常平的、高度弹性和低成本的厚度仅为约0.1至0.8毫米(优选0.2至0.5毫米)的弹簧钢板4固定在尺寸非常精确和稳定的基础结构1上，并且允许去除弹簧钢板4。这些磁铁将弹簧钢板拉至精密平坦的支撑表面上，并且消除弹簧钢板可能存在的任何弯曲。图2是带有以示例图案布置的磁铁9和精确成形的支撑面12的基础结构的平面图。在各边缘处，弹簧钢板4被嵌入基础结构的框架2中。有利的是，弹簧钢板4被稍微预加应力以便呈凹形或凸形弯曲。在框架2的各个内部边缘处铣出的沟槽11可确保可能存在的任何毛刺不会造成任何不利的弯曲。

基础结构可以采用镁铝合金制造，例如AW-5083[Al Mg4.5Mn0.7]，其可在无任何应力的情况下非常精确的加工制造，并内嵌磁铁9。例如，可使用直径5mm和厚度3mm的商用钕铁硼盘状永久磁铁。为了减轻重量，基础结构的内部的大部分可被铣去，留下具有保持强度的网格结构。这还允许通过铣制开口10之一从下方将弹簧钢板从基础结构中推出。其目的是：生产一种包括基础结构和弹簧钢板的复合结构，例如通过使该复合结构具有商用微量滴定板(96孔板)的尺寸，来使这种复合结构适用于移液机器人和其它样品制备机器人。图1以示例方式显示微量滴定板形式的复合结构，图2是大部分被铣去以减轻重量的相关基础结构。样品制备机器人通常无法搬运非常沉重的载板，因此轻型设计是有利的。根据ANSI(美国国家标准研究所)标准，微量滴定板的规格为127.76mm x 85.48mm x 14.35mm。

基础结构也可以用其他金属或非金属材料制造，只要该材料可提供所需的尺寸稳定性即可。例如，在由碳纤维强化塑料组成的情况下，板可以被加工成非常精确的形状。

商业化的MALDI质谱仪配有的离子源可接受微量滴定板形式的样本载板。微量滴定板形式的复合样本载板还允许将样本载板堆叠起来而不接触样品。用于这种形式的复合样本载板的薄弹簧钢板的尺寸约为80mm×120mm。适合这种弹簧钢板的材料例如是符合EN10088-2标准的不锈但仍具磁性的铬钢1.4016。其他磁性弹簧钢板也是适用的，并可根据分析应用的要求来进行选择。

插入的弹簧钢板4的底面位于基础结构的形状精确的支撑面12上。但是，要求弹簧钢板4的上表面具有所述的平面性。因此，在远处区域中表面的平面性会受到钢板材料厚度差异的负面影响。但是，如果弹簧钢板是从大块的机器轧制的半成品切出来的，那么在整个钢板上厚度的差异非常小。在实际操作中，当使用合适的生产方法制作半成品时，厚度差异可以忽略不计。

不同批次半成品之间的差异可能会较大，即使它们的额定厚度是一样的。可通过为每个样本载板进行一次测量和补偿样品分离来轻松控制这种变化。这可通过机械、电学或优选通过在质谱仪中测量质量参比物质来完成。

现代质谱仪可配备各种装置，这些装置不仅在与光束形成垂直的两个空间方向上移动样本载板，而且还通过测量质量参比物质的反馈倾斜对齐样本载板，从而使从载板表面至离子检测器的离子路径几乎全都是一样的，误差仅为十分之几微米。在数学上，该方法与自倾斜载板的距离的线性插值等同，但同样要求样品应用的表面非常平坦，没有弯曲或波浪形。

在其他质谱仪的离子源中，样本载板可采用其他尺寸，例如样本载板尺寸仅为一块微量滴定板的四分之一。同样，可使用具有磁性固定的钢板的合适的基础结构，从而制造合适尺寸的复合样本载板。较小样本载板所用的钢板会相应地较小一些，并且会薄一些，例如厚度为0.1至0.3毫米。

具有非常平坦的表面的高弹性弹簧钢板目前已有商品化产品。使用这类板材制造的弹簧钢板虽然经千分尺测量整体呈曲面，但裸眼几乎看不出来。经验表明，不会发生在2个空间方向上弯曲的球形弯曲；实际上，仅会发生在1个空间方向上弯曲的圆柱形弯曲；当采用合适的切割方法时，也不会产生波浪形。如图3中借助夸大地弯曲的弹簧钢板4所示，可通过磁铁完全消除轻微的圆柱形曲面，其中磁铁将弹簧钢板4稳定地拉至以所需精度制造的基础结构的支撑面12上。如图2和图3所示，如果基础结构未经铣削，那么基础结构的整个面积可作为支撑面12；但也可以存在位于周围区域之外的支撑面。在样品的近处区域，所述近处区域至少延伸至相邻的、隔一个相邻的或隔两个相邻的下一个样品，放置样品的弹簧钢板表面的平面性由弹簧钢板本身4决定，而在样品的远处区域，放置样品的弹簧钢板表面的平面性则由基础结构的支撑面12在整个弹簧钢板上的精度决定。

对于质谱分析，弹簧钢板具有的优势在于，其可导电并从而能够产生均匀电场以使离子加速。

可采用非常柔和的切割方法(例如水喷射切割或特别是皮秒UV激光切割)用大型轧制板来生产弹簧钢板，以实现大批量、高精度、成本低且基本上无毛刺和应力。皮秒激光切割弹簧钢板不会导致弹簧钢板被加热，因此不会产生卷边，由于无法补偿这类卷边，因此卷边是非常不利的。因此，在实际操作中按这样的方法制成的钢板无需机械抛光。为了避免形成的残余毛刺带来的不利影响，可在基础结构的边缘中铣出沟槽11，任何残余的毛刺可以伸到沟槽11中。

这种弹簧钢板非常适合一次性使用，从而也可满足IVD诊断性产品法规、或者消除任何物质的残留物(“遗留物”)，但基础结构可重复使用多次。可通过传统方法去除弹簧钢板制造过程中的任何残余物，例如分离剂或润滑剂，直至达到分析任务所需的清洁度为止。如此清洁过的弹簧钢板会用带有侧面引导件的滑入式盒运输，并且在使用后贮存在盒中，与样品放在一起用于后续质控。图4示出不带盖的运输和贮存盒，其中插有数个弹簧钢板4。盒具有侧面引导件14，并且可设有干燥剂。具有20片弹簧钢板的盒的重量约为1公斤，其中每片弹簧钢板0.5毫米厚，用于微量滴定板形式的基础结构；如果使用仅0.3毫米厚的弹簧钢板，则盒的重量约为0.5公斤。用来装20片弹簧钢板的盒的尺寸约为50mm x 90mm x130mm。

对于非关键性分析方法，弹簧钢板可以多次使用，但是需要彻底清洁。

可提供无任何表面处理的干净的弹簧钢板，如图4的盒中的弹簧钢板所示；例如，样品制备机器人可确定这些弹簧钢板上的样本点，并进行标记。如图1所示，也可以在弹簧钢板上设置标识号或字母、一维或二维条形码、样本点标记和用于不同类型的分析任务的预涂层。

如图3所示，为实现平面性的可重复性，有利的是将弹簧钢板轻微地预弯曲，这样可将其放置成凹形侧接触基础结构，而将样品置于其凸形侧。在这种情况下，标记要始终设置在凸形侧上。

例如，还可以设置可见环来标记样本点。可使用打印、蚀刻或激光雕刻等方法设置这些环。在制作这些环时，还可以添加标识号以及一维或二维条形码标记。除了具有9.0毫米间隔的96环配置外，例如，优选4.5毫米间隔的3毫米直径环；这样可有384个样本点。特别地，对于机器人控制的涂层，也可使用1536个直径为1.5毫米、间隔为2.25毫米的环。

如果例如使用非接触式喷墨打印机打印的方法设置环，那么需要特别注意所使用的墨水。选择的墨水的成分必须在数月至数年内不会漏出并渗至样本点的表面上。优选使用不会被样品液体润湿的材料制作环，这样环可作为障碍物，防止施加的液体形式的样品蔓延出来。作为使用环的替代方案，还可在整个表面上在样本点之间打印不会被润湿的材料。在等同专利DE 197 54 987 C2、GB 2 332 273 B和US 6,287,872 B1(M.Schürenberget al.)中已公开了使用亲水-疏水表面结构。

还可使用本身已知的方法在样本点上预涂基质材料。优选预涂均一厚度的薄层基质材料。例如，目前已知的是，如果表面已有微小的极细石墨颗粒，基质材料CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)在金属底物上会以非常细小和浓密的方式结晶，其晶体大小约为1微米(参考J.Gorka et al.:“Graphite supported preparation of alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid(CHCA)for matrix-assisted laser desorption/Ionizationmass spectrometry”，J Am Soc Mass Spectr 23:1949-1954)。还可以通过基质材料升华来预涂非常精细的薄层，例如通过使用模板来仅涂覆样本点。根据喷墨打印机使用的原理，通过非接触式液滴撞击来预涂薄层也是已知的。

还可以简单地将样本点预涂微核，以帮助基质材料在薄层中结晶。例如，可通过毛毡摩擦涂抹来用石墨颗粒预涂样本点，石墨颗粒会牢固地粘附。然后CHCA会在这些样本点处在薄层中从样品溶液中结晶，从而将分析物分子结合到晶体结构中。其他基质材料可使用其他结晶微核。

一旦弹簧钢板上的样本点已涂抹有纯的基质材料薄层，例如，可利用上方的特殊微量滴定板进行轻压来施加适当制备好的样品液体。这些微量滴定板配备有多孔过滤器底面和样品制备孔。经过一段较短时间后，分析物分子会牢固地粘附在微晶表面上，然后可用移液器吸去或用滤纸吸去溶液。干燥后，可按已知方式向样品中加入少量溶剂，以使分析物分子通过重结晶的方式结合到晶体中。

根据本发明的弹簧钢板还可用于通过质谱仪对氨基酸链进行反应高通量定性，如文件DE 10 2013 006 132 A1所述。为此，这些板材需要镀金。目前，技术上已可以将含硫化合物，例如硫醇、硫醚等通过硫/金相互作用结合至镀金表面上，从而以自构方式形成单分子层分子。这些分子可具有反应中心，使用定义的小型区域靶向激光辐射，其它的分子可通过光化学方法共价结合到这些反应中心上。如果共价结合的分子呈适宜的构型，那么可通过光化学方法，再次将这些共价结合的分子与任何其他分子共价结合。因此，例如，在一块弹簧钢板上，可获得包含960,000个小型样品区域的样品阵列，每一样品区域尺寸为100x100微米并且涂覆有与20个氨基酸相同的长度的不同多肽。例如，这些多肽可以是来自人类蛋白质组的具有相应长度的肽链，也可以具有重叠的序列。例如，这些多肽可以特别制成与反应物反应，反应物例如是酶或化学物质(修改阵列)，或可制作配体与之结合(相互作用阵列)，从而确定哪些反应物在哪些位置上与哪些多肽序列反应，或者哪些配体与哪些肽链结合。

为将本发明拓展至非磁性弹簧钢板，还需一点小小的努力。在这种情况下，必须在磁铁区内在样本载板的背面放置磁性材料，从而产生吸引力。例如，可使用利用粘接剂固定就位的小铁片。如果样本载板在近处区域内具有平面性和所需弹性，那么也适用所述的基本原则。

本发明的嵌入有弹簧钢板的复合样本载板为多项分析应用提供了起点，虽然本文中不可能对此全部详细描述，但它们均包括在本发明保护范围内。

Claims (12)

1.用于利用基质辅助激光解吸电离进行的样品质谱分析的复合样本载板，所述复合样本载板具有尺寸稳定且精确成形的基础结构，弹簧钢板利用磁性固定在所述复合样本载板上，所述弹簧钢板的背向所述基础结构的表面保持样品，

其中，

所述弹簧钢板的厚度为0.1至0.8毫米，并且

在所述基础结构上分布有多个磁铁，所述多个磁铁嵌入在从所述基础结构的周围区域稍微伸出的支撑表面内并且将所述弹簧钢板拉到靠在所述基础结构上，从而消除所述弹簧钢板上的任何弯曲，并且

所述基础结构在邻近所述弹簧钢板的每个角的地方都有一个磁铁，并在邻近所述弹簧钢板的中心的地方有至少一个磁铁。

2.根据权利要求1所述的复合样本载板，其中所述弹簧钢板为轻度预弯的。

3.根据权利要求2所述的复合样本载板，其中所述轻度预弯的弹簧钢板的凹面侧置于所述基础结构上，而凸面侧上放置样品。

4.根据权利要求1至3中之一所述的复合样本载板，其中所述弹簧钢板的厚度为0.2至0.5毫米。

5.根据权利要求1至3中之一所述的复合样本载板，其中所述弹簧钢板设置有字母、数字和/或条形码形式的识别标记。

6.根据权利要求1至3中之一所述的复合样本载板，其中所述弹簧钢板设置有可见环以标记样本点。

7.根据权利要求6所述的复合样本载板，其中所述可见环打印在所述弹簧钢板上。

8.根据权利要求7所述的复合样本载板，其中所述打印的可见环包括不会被所用的样品液体润湿的材料。

9.根据权利要求6所述的复合样本载板，其中所述弹簧钢板上的样本点以外的区域涂覆有不会被样品液体润湿的材料。

10.根据权利要求6所述的复合样本载板，其中所述弹簧钢板上的样本点涂覆有基质层。

11.根据权利要求6所述的复合样本载板，其中所述弹簧钢板上的样本点涂覆有结晶微核，以使基质材料能够结晶。

12.根据权利要求11所述的复合样本载板，其中在所述弹簧钢板上使用石墨颗粒作为基质材料α-氰基-4-羟基肉桂酸的结晶微核。