CN105483172A - α-猪胰淀粉酶在催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物中的应用及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α-猪胰淀粉酶在催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物中的应用及方法。该方法以烯酮和溴代硝基甲烷为底物，α-猪胰淀粉酶作为催化剂，以甲醇/水作为溶剂，在含有布朗斯特碱氮甲基吗啉存在的条件下，25℃搅拌反应120h即可获得产物。本发明采用α-猪胰淀粉酶作催化剂通过一锅法在合适的碱存在下催化α,β-不饱和酮和溴代硝基甲烷的不对称共轭加成，构建具有三个连续手性中心的硝基环丙烷类化合物。在氮甲基吗啉存在的条件下多种环状烯酮能够很好地适应α-猪胰淀粉酶催化反应，获得较好的收率和一定量的选择性。这种合成方法扩展了酶催化的应用，同时为合成硝基化合物提供了一种可持续的合成途径。

Description

α-猪胰淀粉酶在催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物中的应用及方法

技术领域

本发明属于化学领域，具体涉及α-猪胰淀粉酶在催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物中的应用及方法。

背景技术

生物催化方法因其具有可在温和条件下实施的特点和具有构建一个或多个手性中心的能力被认为是一种高效绿色的现代有机合成手段。酶作为一种生物催化剂，含有能够被整个酶分子精确控制的氨基酸残基和辅因子，主要通过氢键、疏水、静电等作用共同调节反应活化能。许多酶不仅可以高效催化特定的化学转化，还能催化多种类型的其他化学反应，酶的这种行为被称为酶催化非专一性，比如利用酶的这种催化特性进行碳-碳键的构建反应等。尽管酶催化非天然反应的例子不断被报道，但到目前为止在有机合成中酶催化多功能性的运用并没有一种通用的化学方法，只能通过逐一的筛选确定是否能被酶催化合成。因此选用酶来催化不同类型的反应特别是串联反应是极具挑战性的。

环丙烷基团存在于多种植物和微生物提取的天然产物中，该类基团具有三个手性碳原子，并能够通过化学转化构建复杂的中间体从而合成其他具有生物活性的化合物。不仅如此，含有手性硝基环丙烷的天然产物本身具有生物活性，另外，生物活性多肽中也存在环丙烷氨基酸的结构，含有环丙烷结构的拟除虫菊酯类化合物还是有效的杀虫剂。基于手性环丙烷化合物的上述活性特性，这类化合物的合成具有显著潜在的应用价值，探究一种更环保更友好且可持续的合成方法为当今有机合成所需。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种α-猪胰淀粉酶在催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物中的应用及方法。

本发明采取的技术方案如下：

1、α-猪胰淀粉酶在催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物中的应用，反应通式如下：

其中，n＝0,1或2，R为3-甲基、4-甲基、4,4-二甲基或3,5,5-三甲基。

优选的，所述反应以甲醇作为溶剂，还含有布朗斯特碱，反应温度为15～60℃。

优选的，所述反应溶剂还含有水，甲醇与水的体积比为9:1；所述布朗斯特碱为氮甲基吗啉，反应温度为25℃。

优选的，所述反应底物a和b的摩尔比为2:1。

优选的，所述反应时间为96-120h。

优选的，所述反应以不过量的溴代硝基甲烷为准，每0.25mmol溴代硝基甲烷需要1mL的甲醇/水混合溶剂，氮甲基吗啉与溴代硝基甲烷的摩尔比为1:1。

2、α-猪胰淀粉酶催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物的方法，反应通式如下：

其中，n＝0,1或2，R为3-甲基、4-甲基、4,4-二甲基或3,5,5-三甲基，甲醇与水作为反应溶剂，体积比为甲醇：水＝9:1；

反应以溴代硝基甲烷为准，烯酮与溴代硝基甲烷的摩尔比为2:1，氮甲基吗啉与溴代硝基甲烷的摩尔比为1:1；每0.25mmol溴代硝基甲烷需要1mL的甲醇/水混合溶剂，α-猪胰淀粉酶3.89kU；

将烯酮、溴代硝基甲烷、α-猪胰淀粉酶、氮甲基吗啉加入到甲醇/水混合溶剂中，25℃下搅拌反应，并用TLC监测反应，待反应无明显变化时停止搅拌，过滤除去酶并用乙酸乙酯洗涤滤饼；将获得的滤液旋转蒸发除去溶剂得粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，石油醚和乙酸乙酯体积比为4:1-10:1作为淋洗剂，得到纯化产物。

反应中，酶不溶于所用溶剂，而是悬浮在混合溶剂中，反应是一个非均相的催化反应。反应以不过量的溴代硝基甲烷为准，每0.25mmol溴代硝基甲烷需要1mL的甲醇/水混合溶剂。在1mL的甲醇/水混合溶剂中，0.25mmol的溴代硝基甲烷对应的酶的最佳用量为3.89kU。

本发明的有益效果在于：本发明采用α-猪胰淀粉酶做催化剂通过一锅法在合适的碱存在下催化α,β-不饱和酮和溴代硝基甲烷的不对称共轭加成，构建具有三个连续手性中心的硝基环丙烷类化合物。在氮甲基吗啉存在的条件下多种环状烯酮能够很好地适应α-猪胰淀粉酶催化反应，获得较好的收率和一定量的选择性。这种合成方法扩展了酶催化的应用。另外，现有的合成方法主要是采用小分子作为催化剂，这些催化剂通常要经过多步合成，合成过程中往往会用到有毒有害的试剂、溶剂，操作繁琐，条件苛刻。本方法采用天然酶作为生物催化剂，酶来源于生物体，属于可再生资源，并且可生物降解，对环境没有毒害，酶催化反应条件温和，酶催化符合绿色化学和可持续发展的要求。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1酶量对反应结果的影响；

图2水含量对α-淀粉酶催化合成硝基环丙烷类化合物的影响；

图3温度对α-淀粉酶催化合成硝基环丙烷类化合物的影响；

图4α-淀粉酶催化合成硝基环丙烷化合物的时间进程曲线。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

主要仪器和试剂：

主要仪器：核磁共振仪：型号BrukerAVANCEDMX300及BrukerAVANCEDMX600,溶剂为氘代氯仿，四甲基硅烷为内标；LC-20AT型液相色谱仪(日本岛津公司)；大赛璐手性柱AD-H；UV-2600紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。

主要试剂：α-猪胰淀粉酶[10080,Lot#BCBK7223V,粉末状,48.6U/mg],淀粉葡糖苷酶来源于黑曲霉[10115,Lot#BCBF3497V,粉末状,62.4U/mg],α-淀粉酶来源于米曲霉[10065,Lot#BCBD1451V,粉末状,35.4U/mg],蛋白酶来源于佐氏曲霉[P2143,Lot#074K0727V,粉末状,1U/mg],蛋白酶来源于根霉菌[P4032,Lot#SLBF8373V,粉末状,0.5U/mg],蛋白酶来源于灰色链霉菌[P1574,Lot#SLBL3111V,粉末状,5.8U/mg],固定化脂肪酶来源于洋葱假单胞菌[52583,Lot#BCBB5644,粉末状,0.942U/mg],和固定化脂肪酶B来源于南极假丝酵母[54327,Lot#1388464V,粉末状,3.766U/mg]以上的酶均从Sigma-Aldrich试剂公司购得。1c根据文献合成[(a)A.Beckwith；G.Phillipou,Aust.J.Chem.1976,29,1277-1294；(b)A.L.Draper；W.J.Heilman；W.E.Schaefer；H.J.Shine；J.N.Shoolery,J.Org.Chem.1962,27,2727-2729.]。除特别注明外，其它所用试剂全部来自商业渠道并且未经进一步纯化。

一、合成硝基环丙烷酶催化剂的筛选

首先选择环己烯酮和溴代硝基甲烷作为模型反应在25℃等当量的氮甲基吗啉(NMM)存在条件下筛选酶催化剂(表1，序号1-9)，溶剂选用乙腈(MeCN)。用TLC监测反应，待反应无明显变化时停止搅拌，过滤除去酶并用乙酸乙酯洗涤滤饼。旋转蒸发除去溶剂得粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，石油醚和乙酸乙酯比例为4:1-10:1作为淋洗剂，得到纯化产物，称重计算收率。实验结果见表1。

表1合成硝基环丙烷酶催化剂的筛选^a

^a反应条件：环己烯酮(0.30mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，酶，NMM(0.25mmol)在乙腈(0.9mL)和去离子水(0.1mL)在25℃条件下反应120h。

^b硅胶柱层析分离产物获得收率。

^c高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。

^d1U相当于每分钟水解释放1umol麦芽糖(序号2和4)或葡萄糖(序号3)的酶量。

^e1U相当于水解血红蛋白(序号5)或酪蛋白(序号6和7)每分释放1umol(181ug)酪蛋白的酶量。

^f1U相当于每分钟水解释放1umol丁酸的酶量。

结果显示，在相同条件下，空白实验进行120h只得到9％的收率，且无选择性(表1，序号1)。通过对比不同来源的淀粉酶，蛋白酶和脂肪酶的催化效果，最优的结果是当使用α-猪胰淀粉酶做催化剂时得到了53％收率和13％的选择性。通过对比已知的手性的高效液相分析确定3a的绝对构型。

二、反应溶剂及碱的类型筛选

以环己烯酮和溴代硝基甲烷作为模型反应在25℃条件下由α-猪胰淀粉酶做催化剂测试几种不同的反应溶剂及碱对反应的影响，结果见表2。

表2溶剂和碱对α-猪胰淀粉酶催化合成硝基环丙烷的影响^a

^a反应条件：环己烯酮(0.30mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，α-淀粉酶(3.89kU)，NMM(0.25mmol)溶剂(0.9mL)和去离子水(0.1mL)在25℃条件下反应120h。

^b硅胶柱层析分离产物获得收率。

^c高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。

通过溶剂对反应的影响的考察发现，溶剂类型对反应产率和选择性有较大的影响(表2，序号1-19)。其中甲醇，乙醇和乙二醇等极性溶剂对反应产率起着促进作用，在甲醇中得到84％的最优产率(表2，序号1,2和3)。然而当水作为极性溶剂时，由于溶解性较差得到的结果并不令人满意(表2，序号8)；当二氯甲烷作溶剂时得到21％的选择性；在其它溶剂并未得到更好的结果(表2，序号4)。因此为了得到较好的收率，甲醇被选为最佳溶剂。接下来又对碱的类型进行了探究，得出布朗斯特碱的存在是获得高收率的关键(表2，序号19)。当NMM和α-猪胰淀粉酶同时存在时得到了84％的收率和17％的选择性(表2，序号1)，而当无碱或无酶的条件下都得到很低的收率和选择性，因此NMM和α-猪胰淀粉酶是该反应的所需的必要条件。

三、α-猪胰淀粉酶作为催化剂的必要性验证

由于α-猪胰淀粉酶是从Sigma-Aldrich购买的未被纯化的酶，因此有必要排除混合物中杂质催化的可能。因此，通过抑制和失活α-淀粉酶的天然和非天然的活性的控制实验来验证酶能够催化该特定的反应，结果见表3。

表3对照实验^a

^a反应条件：环己烯酮(0.30mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，α-淀粉酶(3.89kU)，NMM(0.25mmol)溶剂(0.9mL)和去离子水(0.1mL)在25℃条件下反应120h。

^b硅胶柱层析分离产物获得收率。

^c高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。

^d活力定义：1U相当于每分钟水解释放1umol麦芽糖的酶量。

^eα-淀粉酶(3.89kU)于0.25MAg⁺溶液中(42.5mgAgNO₃溶于1.0mL去离子水中)在25℃下搅拌24h，冻干。

^fα-淀粉酶(3.89kU)于0.25MCu²⁺溶液中(39.9mgCuSO₄溶于1.0mL去离子水中)在25℃下搅拌24h，冻干。

^gα-淀粉酶(3.89kU)于5M尿素溶液中(300mg尿素溶于1.0mL去离子水中)在25℃(序号7)下或100℃(序号8)搅拌24h，冻干。

^hα-淀粉酶(3.89kU)于1.85M羰基二咪唑溶液中(300mg羰基二咪唑溶于2.0mLCH₂Cl₂)在25℃下搅拌24h，除去CH₂Cl₂。

首先从表中可以看出，当无酶存在时只得到了9％的收率(表3，序号2)，而反应中酶存在时得到了84％的收率和17％的选择性(表3，序号1)，这表明α-淀粉酶在一定程度上催化了该串联反应。其次，众所周知，大多数蛋白中存在的巯基能够与重金属汞离子、铜离子、银离子等作用导致酶失活造成不可逆的破坏，不仅如此，这些重金属离子还能够与氨基酸残基作用扰乱酶的三维结构。我们用两种金属离子铜离子和银离子作为失活剂分别对α-淀粉酶进行预处理，结果仅得到痕量产物(表3，序号4和6)，同时酶的天然活力从27.4U/mg下降到1.3U/mg。两种金属离子的空白对照实验对反应无催化作用(表3，序号3和5)，这种结果表明酶的天然活性已被金属彻底破坏。接着，用尿素对酶进行预处理，在室温下处理酶收率和选择性无明显下降而高温条件下尿素处理酶时收率从84％下降到19％(表3，序号8)，酶的天然活力从27.4U/mg下降到2.2U/mg，该结果证明了在高温和尿素的共同作用下已导致酶三维结构的破坏和酶的严重失活。根据已知文献报道α-淀粉酶的活性位点中存在Asp197和Glu233残基，羰基二咪唑是一种能够与羧基形成不可逆的共价连接的物质，在此我们用羰基二咪唑作为一种不可逆的抑制剂处理α-淀粉酶，发现收率降低到8％，选择性降低到10％，天然活力从27.4U/mg下降到1.9U/mg(表2，序号9)。以上控制实验明确表明与酶催化天然活性相似，该串联反应可能发生在α-淀粉酶的活性位点。

四、α-猪胰淀粉酶作为催化剂的最佳用量确定

以环己烯酮和溴代硝基甲烷作为模型反应在25℃条件下由α-猪胰淀粉酶做催化剂，以甲醇为溶剂，NMM为碱确定反应中酶的最佳用量，反应条件：环己烯酮(0.30mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，α-淀粉酶(0.49-4.37kU)，NMM(0.25mmol)，甲醇(0.9mL)和去离子水(0.1mL)在25℃条件下反应120h。硅胶柱层析分离产物获得收率。高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。结果见图1。由结果可知，反应的收率和选择性均受酶量影响，当酶量从0.49kU增大到3.89kU时，产率从50％升高到84％，选择性从10％到17％也有少量提高。继续增大酶量未得到更好的结果，因此3.89kU作为最优酶量进行下一步研究。

五、反应中水含量的最佳用量确定

众所周知，在酶的生物学功能中水分子通过结合到蛋白质分子表面以及内部起着重要作用，在非水相有机溶剂中添加少量水能加速大多数酶催化反应速率。因此少量的水是必须的。本发明仍旧以环己烯酮和溴代硝基甲烷作为模型反应在25℃条件下由α-猪胰淀粉酶做催化剂，以甲醇为溶剂，NMM为碱确定反应中水的最佳用量，反应条件：环己烯酮(0.30mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，α-淀粉酶(3.89kU)，NMM(0.25mmol)，甲醇(1.0-0.4mL)和去离子水(0-0.6mL)在25℃条件下反应120h。硅胶柱层析分离产物获得收率。高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。结果见图2。结果表明，通过对含水量的考察很清楚地表明少量水的存在，从0增加到10％[水/(甲醇+水)，v/v]收率从74％提高到84％，选择性基本不变。继续增加水量，产率和选择性降低的较明显，收率从84％下降到70％，选择性从17％下降到7％。综合考虑，选择含水量为10％作为反应最优条件。

六、反应底物最佳用量确定

继续考察反应底物用量对反应收率和选择性的影响。结果见表4。

表4底物摩尔比对α-淀粉酶催化合成硝基环丙烷类化合物的影响^a

^a反应条件：环己烯酮，溴代硝基甲烷，α-淀粉酶(3.89kU)，NMM(0.25mmol)，甲醇(0.9mL)和去离子水(0.1mL)在25℃条件下反应120h。

^b硅胶柱层析分离产物获得收率。

^c高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。

由表4可知，先固定溴代硝基甲烷的量，扩大环己烯酮的量，产率从82％增大到93％，选择性基本不变；再固定环己烯酮的量，同等扩大溴代硝基甲烷的量，并未得到更好的结果。因此环己烯酮与溴代硝基甲烷摩尔比为2:1被选为最优摩尔比。

继续用等量的0.067M磷酸缓冲液代替去离子水考察pH(4.7-12.8)对串联反应的影响。通过对比缓冲液和与上述反应中用去离子水反应的结果，发现选用缓冲液代替去离子水并未得到更好的结果。继续又考察了氮甲基吗啉的量对模板反应的影响，等当量的碱中存在时得到了最好的结果，继续增加碱的量并没有得到更好的结果。因此，仍旧以甲醇和去离子水的混合溶剂作为最优溶剂，一当量的氮甲基吗啉(氮甲基吗啉与不过量的底物溴代硝基甲烷的摩尔比为1:1)作为后续反应的最优碱用量。

七、反应最佳温度确定

温度是影响酶稳定性、选择性以及酶催化反应速率的关键因素。为了进一步优化α-淀粉酶对该串联反应的条件，筛选了反应的最适温度。反应条件：环己烯酮(0.50mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，α-淀粉酶(3.89kU)，NMM(0.25mmol)，甲醇(0.9mL)和去离子水(0.1mL)反应120h。硅胶柱层析分离产物获得收率，高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。具体结果见图3。从图中看出在25℃时得到93％的最佳收率和18％的最优选择性。当温度升高到60℃时产率明显下降，在反应过程中观察到有副产物的生成，但未能分离出所产生的杂质。因此，25℃是该优化步骤中的最佳选择。

八、α-淀粉酶催化合成硝基环丙烷类化合物的时间进程

时间曲线更能够清晰地体现α-淀粉酶对该反应的催化进程。反应条件：环己烯酮(0.50mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，α-淀粉酶(3.89kU)，NMM(0.25mmol)，甲醇(0.9mL)和去离子水(0.1mL)在25℃条件下反应。硅胶柱层析分离产物获得收率，高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。结果见图4。从图中曲线我们可以看出前48h反应速率较为恒定产率明显上升，之后反应速率逐渐减慢，当120h时为该反应产率的峰值93％，继续延长反应时间到132h，出现副产物，导致产率略微降低，继续延长反应时间到144h产率保持在84％。从图中我们可以看出时间对选择性的影响并不大，选择性基本维持在18％ee值左右。

九、α-淀粉酶对串联反应的通用性和适用范围的研究

筛选出最优的反应条件后，继续探究α-淀粉酶对串联反应的通用性和适用范围。多种环状烯酮的扩展总结在表5中。其中五元环、六元环和七元环烯酮都能被催化得到较好的产率(表5，序号1-7)。其中环己烯酮和不同位置被甲基取代的环己烯酮得到了66％-93％的产率(表5，序号1-4)，遗憾的是，3,5,5-三甲基环己烯酮未能发生反应，这可能是由于空间位阻的影响导致。在环庚烯酮中得到了可喜的产率(表5，序号6)，环戊烯酮也能很好的参与反应得到中等产率(表5，序号7)。然而，令人不满意的是反应的选择性，这可能是由于酶对非天然反应的催化的选择性没有催化天然底物高。在此条件下，我们还对非环状的α,β-不饱和酮进行了探究，只得到了发生第一步Michael反应的产物并未发生合环反应。根据与已知文献的对比分析确定产物的绝对构型。

表5α-淀粉酶催化合成硝基环丙烷类化合物的底物扩展^a

^a反应条件：环己烯酮(0.50mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，α-淀粉酶(3.89kU)，NMM(0.25mmol)在甲醇(0.9mL)和去离子水(0.1mL)在25℃条件下反应。

^b硅胶柱层析分离产物获得收率。

^c高效液相色谱(HPLC)分析获得ee值。

α-猪胰淀粉酶含有496个氨基酸残基，其中Asp197和Glu233处在该酶的活性位点处，并且Asp197作为一个碱，Glu233作为一个酸。本文中的对照实验已显示该串联反应可能发生在α-淀粉酶的活性位点。于此，α-淀粉酶催化串联反应的可能的催化机理如下：首先溴代硝基甲烷在Glu233的协同下被Asp197夺去质子，形成中间体I；其次中间体I进攻被活化的环己烯酮发生分子间的Michael反应，形成中间体II；最后通过合环反应生成产物3a，氮甲基吗啉在该步骤接收HBr形成盐。

α-猪胰淀粉酶催化反应机理

最终本发明确定α-淀粉酶催化合成硝基环丙烷类化合物的步骤如下：

烯酮(0.50mmol)，溴代硝基甲烷(0.25mmol)，α-猪胰淀粉酶(3.89kU)，NMM(0.25mmol)加入到甲醇(0.9mL)和去离子水(0.1mL)的混合溶液中，在25℃下搅拌，并用TLC监测反应，待反应无明显变化时停止搅拌。过滤除去酶并用乙酸乙酯洗涤滤饼。旋转蒸发除去溶剂得粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，石油醚和乙酸乙酯比例为4:1-10:1作为淋洗剂，得到纯化产物，称重计算收率。

表5中3a-3g产物经核磁共振波谱法检测，数据如下：

化合物3a：(1R,6S,7R)-7-nitrobicyclo[4.1.0]heptan-2-one(3a)²Colorlessoil,¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ4.69(t,J＝2.8Hz,1H),2.82(dd,J＝9.6,2.4Hz,1H),2.68(d,J＝8.4Hz,1H),2.35(td,J＝18.0,4.5Hz,1H),2.24–2.11(m,2H),2.07–1.96(m,1H),1.95–1.82(m,1H),1.63–1.47(m,1H).¹³CNMR(75MHz,CDCl₃):δ201.32,60.51,37.28,35.26,26.84,19.62,18.17ppm.对映体过量值用HPLC测定，(大赛璐手性柱AD-H，己烷/异丙醇＝95:5，流速0.8mL/min，λ＝208nm)，tRmajor＝33.955min，tRminor＝29.702min。

化合物3b：(1R,6R,7R)-5,5-dimethyl-7-nitrobicyclo[4.1.0]heptan-2-one(3b)²Whitesolid,¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ4.68(d,1H),2.85(d,J＝8.4Hz,1H),2.42(d,J＝3.0Hz,1H),2.28(d,J＝2.9Hz,2H),1.49(m,J＝52.4,11.4Hz,2H),1.23(d,J＝5.5Hz,3H),1.21(s,3H).¹³CNMR(151MHz,CDCl₃):δ201.20,60.28,38.38,36.21,33.44,31.14,29.33,28.08,26.45ppm.对映体过量值用HPLC测定，(大赛璐手性柱AD-H，己烷/异丙醇＝99:1,流速0.6mL/min,λ＝208nm),tRmajor＝37.325min,tRminor＝40.883min。

化合物3c：(1R,5R,6S,7R)-5-methyl-7-nitrobicyclo[4.1.0]heptan-2-one(3c)²Colorlessoil,¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ4.68(t,J＝3.1Hz,1H),2.80(dd,J＝9.7,2.4Hz,1H),2.51(d,J＝9.7Hz,1H),2.41–2.35(m,1H),2.34–2.27(m,1H),2.19(dt,J＝18.4,5.5Hz,1H),1.76(ddd,J＝20.5,10.5,5.1Hz,1H),1.66–1.60(m,1H),1.23(d,J＝7.0Hz,3H).¹³CNMR(151MHz,CDCl₃):δ201.38,62.02,35.02,33.87,33.47,26.24,25.04,19.73ppm.对映体过量值用HPLC测定，(大赛璐手性柱AD-H，己烷/异丙醇＝95:5,流速0.8mL/min,λ＝208nm),tRmajor＝31.579min,tRminor＝35.254min。

化合物3d：(1R,6S,7S)-6-methyl-7-nitrobicyclo[4.1.0]heptan-2-one(3d)²Colorlessoil,¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ4.79(d,J＝3.3Hz,1H),2.89(d,J＝3.2Hz,1H),2.40–2.33(m,1H),2.25–2.16(m,1H),2.13–2.04(m,1H),1.90–1.78(m,2H),1.61–1.51(m,1H),1.42(s,3H).¹³CNMR(151MHz,CDCl₃):δ201.94,65.43,40.40,36.35,32.55,28.38,17.51ppm.对映体过量值用HPLC测定，(大赛璐手性柱AD-H，己烷/异丙醇＝95:5,流速0.8mL/min,λ＝208nm),tRmajor＝19.680min,tRminor＝16.546min。

化合物3f：(1R,7S,8R)-8-nitrobicyclo[5.1.0]octan-2-one(3f)²Colorlessoil,¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ4.63(d,J＝3.3Hz,1H),3.19–3.06(m,1H),2.67–2.54(m,1H),2.49–2.33(m,2H),2.24–2.12(m,1H),1.67(m,J＝13.8,11.7,7.0Hz,2H),1.55(d,J＝13.9Hz,3H).¹³CNMR(151MHz,CDCl₃):δ203.28,62.93,43.12,39.89,27.32,26.97,25.58,24.43ppm.对映体过量值用HPLC测定，(大赛璐手性柱AD-H，己烷/异丙醇＝98:2,流速0.5mL/min,λ＝208nm),tRmajor＝29.865min,tRminor＝27.359min。

化合物3g：(1R,5S,6R)-6-nitrobicyclo[3.1.0]hexan-2-one(3g)²Lightyellowsolid,¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ4.42(s,1H),2.99(d,J＝5.2Hz,1H),2.81(d,J＝6.1Hz,1H),2.41–2.18(m,3H),2.03–1.94(m,1H).¹³CNMR(151MHz,CDCl₃):δ207.23,61.94,37.50,32.52,30.72,22.06ppm.对映体过量值用HPLC测定，(大赛璐手性柱AD-H，己烷/异丙醇＝98:2,流速0.6mL/min,λ＝208nm),tRmajor＝55.750min,tRminor＝58.842min。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.α-猪胰淀粉酶在催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物中的应用，其特征在于，反应通式如下：

其中，n＝0,1或2，R为3-甲基、4-甲基、4,4-二甲基或3,5,5-三甲基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应以甲醇作为溶剂，还含有布朗斯特碱，反应温度为15～60℃。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应溶剂还含有水，甲醇与水的体积比为9:1；所述布朗斯特碱为氮甲基吗啉，反应温度为25℃。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应底物a和b的摩尔比为2:1。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应时间为96-120h。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应以不过量的溴代硝基甲烷为准，每0.25mmol溴代硝基甲烷需要1mL的甲醇/水混合溶剂，氮甲基吗啉与溴代硝基甲烷的摩尔比为1:1。

7.α-猪胰淀粉酶催化串联反应合成硝基环丙烷类化合物的方法，其特征在于，反应通式如下：

其中，n＝0,1或2，R为3-甲基、4-甲基、4,4-二甲基或3,5,5-三甲基，甲醇与水作为反应溶剂，体积比为甲醇：水＝9:1；

反应以溴代硝基甲烷为准，烯酮与溴代硝基甲烷的摩尔比为2:1，氮甲基吗啉与溴代硝基甲烷的摩尔比为1:1；每0.25mmol溴代硝基甲烷需要1mL的甲醇/水混合溶剂，α-猪胰淀粉酶3.89kU；

将烯酮、溴代硝基甲烷、α-猪胰淀粉酶、氮甲基吗啉加入到甲醇/水混合溶剂中，25℃下搅拌反应，并用TLC监测反应，待反应无明显变化时停止搅拌，过滤除去酶并用乙酸乙酯洗涤滤饼；将获得的滤液旋转蒸发除去溶剂得粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，石油醚和乙酸乙酯体积比为4:1-10:1作为淋洗剂，得到纯化产物。