CN105483025A - 棘孢木霉h2及其在降解芘中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了棘孢木霉H2及其在降解芘中的应用，棘孢木霉H2，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.？11577。实验数据表明棘孢木霉H2具有降解芘的能力，降解力强，可以用于PAHs的降解。

Description

棘孢木霉H2及其在降解芘中的应用
技术领域
本发明涉及一株新的微生物及其在降低污染物中的应用，特别涉及棘孢木霉H2及其在降解芘中的应用。
背景技术
PAHs由两个或两个以上苯环以线性排列、弯接或簇聚的方式构成的。一般可分为两类，即孤立多环芳烃和稠合多芳烃。稠合多环芳烃对人类的威胁较大，有致癌作用的多环芳烃多为四到六环的稠环化合物。大多数PAHs不溶于水，熔点高达101℃～438℃，沸点150℃～525℃，分子量在178～300之间。双环、三环的PAHs易降解，四环以上的PAHs极难降解。研究结果表明：在室内环境下，双环PAHs的半衰期为2天；三环的半衰期为：l6天(蒽)，134天(菲)；而四环以上的PAHs半衰期约在200天以上。
PAHs的基本结构单位是苯环，苯环的数目和连接方式的不同引起分子量、分子结构变化，进而导致了某些不同的物理化学性质。PAHs具有致诱变性，且结构稳定，生物难降解。1979年，美国环保局(EPA)首先公布129种优先监测污染物，其中PAHs有16种。而后欧洲将6种PAHs作为目标污染物，我国国家环保局也将7种PAHs列入中国环境优先污染物黑名单。
环境中的PAHs来源主要来自人类的生产活动，由各种有机物不完全燃烧所致。例如，煤的汽化和液化过程、石油的裂解过程、各种石油馏份的燃烧、烹调油烟以及废弃物等均可造成环境中PAHs的污染。四环以下分子量较小的PAHs多以蒸气态存在，而分子量较大的则被吸附在颗粒物表面，尤其是在小于5μm的颗粒上，可以进入肺的深部。这样的颗粒可以在空气中悬浮几天到几周，也能远距离转移。
PAHs不易溶于水，极易附着在固体颗粒上，因此，大气、水及土壤中PAHs处于吸附态。PAHs在环境中是不断积累的。研究表明在河水、海水沉积物中，PAHs的浓度高而且积累的快。因排废气、废水及废物倾倒，PAHs对水、大气及土壤产生直接污染。吸附在烟气微粒的PAHs随气流传向周围及更远处，又随降尘、降雨及降雪进入水体及土壤，而土壤及地面多环芳烃通过扬尘再次进入大气，通过呼吸及食物链进入动物体产生毒害。
目前PAHs作为持久性有机污染物，因具有以下特性而被各国所关注：(1)PAHs具有极强的“三致”效应，即致癌性、致突变性及致畸性。人类及动物癌症病变有70％～90％是环境中化学物质引起的，而PAHs则是环境中致癌化学物质中最大的一类；(2)PAHs对微生物的生长有强抑制作用。PAHs因水溶性差及其稳定的环状结构而不易被生物利用，它们对细胞的破坏作用抑制普通微生物的生长；(3)PAHs经紫外照射后毒性更大(光毒效应)。PAHs吸收紫外光能后，被激发成单线态及三线态分子，被激发分子的能量可以通过不同途径损失。其中一部分被激发的PAHs分子将能量传给氧，从而产生反应能力极强的单线态氧，它能损坏生物膜。
1775年，英国人发现烟囱清扫工人多患阴囊癌；1882年，又有人发现从事煤焦油和沥青作业的工人多患皮肤癌。20世纪70年代以前，人们一直以为多环芳烃是直接致癌物，后来，动物实验的结果表明，多环芳烃本身对生物并无多大负效应，它们只有被酶系统代谢，转化为多种代谢产物后，其中某些活性形式的代谢产物与DNA发生共价结合，才具有致癌作用。
而多环芳烃进入土壤后，由土壤表面污染进一步导致下层土壤污染，甚至地下水污染。多环芳烃在土壤中的迁移与转化受挥发、光解及生物降解等过程的影响，在光诱导、生物积累及生物代谢变迁过程中，多环芳烃一般转化为酚类、醌类及芳香族羧酸类物质，有的转化产物甚至比原始多环芳烃更具毒性。
以往降解PAHs菌的分离报道，很多以萘、菲等低分子量的PAHs为主。自1988年Heitkamp等首次报道从土壤中分离到1株能降解芘的菌，经鉴定为分枝杆菌属的一个新种(MycobacteriumvanbaaleniiPYR-1)，之后高分子量PAHs的降解研究也有很多,分枝杆菌(如Mycobacteriumsp.strainAP1、Mycobacteriumsp.strainRJGII-135、Mycobacteriumflavescens，红球菌(Rhodococcussp.strainUW1)、白腐真菌(Pleurotusostreatus、Panerochaetechrysosporium）和糖丝菌(Saccharothrixsp.PYX-6)等。
PAHs的芘苯环对称排列组成，结构稳定，是高分子量PAHs的代表化合物，具有致癌、致畸的结构域，因此能降解芘的微生物资源还很有限，特别是芘降解霉菌的相关研究目前更少见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供棘孢木霉H2及其在降解芘中的应用。
发明人通过大量的筛选，筛选得到了一株可降解PAHs，特别是降解芘的新菌株，经鉴定，命名该新菌株为棘孢木霉H2。棘孢木霉H2已经于2015年11月3日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏机构于2015年11月3日鉴定存活，给予保藏编号为CGMCCNo.11577，建议的分类命名为棘孢木霉（Trichodermaasperellum）。
实验数据表明棘孢木霉H2具有降解芘的能力，降解力强，可以用于PAHs的降解。
附图说明
图1为棘孢木霉H2在察氏培养基（25℃，7d）上的菌落形态；
图2为棘孢木霉H2在在麦芽汁培养基（25℃，7d）上的菌落形态；
图3为棘孢木霉H2在察氏酵母培养基（25℃，7d）上的菌落形态；
图4为棘孢木霉H2在不同培养基（25℃，7d）上的背面菌落形态；
图5为棘孢木霉H2的分生孢子梗；
图6为棘孢木霉H2对芘的降解曲线；
图7为棘孢木霉H2的菌丝干重增长图。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
芘降解菌的分离与鉴定
培养基配方
PDA培养基：土豆浸出物200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15-20g/L。
液体培养基：在TienandKirk(1988)的配方的基础上稍加改良：其中用浓度为0.02mol·L-1的乙酸缓冲液(pH=4.4)代替丁二酸二甲酯缓冲液。其中葡萄糖10g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，CaCl20.1g/L，酒石酸铵0.5g/L（C4H12N2O6），微量元素10g/L，微量元素的组成(/L):
MnSO40.5g，NaCl1.0g，FeSO4·7H2O0.1g，COCl20.1g，ZnSO4·7H2O0.1g，CuSO40.1g，AlK(SO4)2·12H2O0.01g，Na2MoO4·2H2O0.01g
接种前无菌过滤加入VB1溶液，使得最终VB1的质量浓度为5mg/L。
察氏培养基配方：30.0g/L蔗糖，3g/LNaNO3，1g/LK2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.5g/LKCl，0.01g/LFeSO4·7H2O，15-20g/L琼脂。
麦芽汁培养基配方：20g/L麦芽浸膏，1g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，15-20g/L琼脂。
察氏酵母培养基配方：K2HPO41g/L，查氏浓缩液10ml/L，酵母抽提物5g/L，蔗糖30g/L，15-20g/L琼脂。
芘降解菌的驯化
样品采自广东省清远市，取样品蚯蚓粪，300g，含水量约50%，平摊于托盘中，添加芘使得最终蚯蚓中芘的浓度为：第1天25mg·kg-1，4天后50mg·kg-1，8天后100mg·kg-1，15天后200mg·kg-1。添加芘的方法为：取一定量的芘溶于丙酮溶液，取芘丙酮溶液均匀喷施到土壤中，搅拌均匀，并放置通风厨待丙酮挥发完毕，在28℃，避光条件下连续驯化20天。
分离
称取已经驯化好的土样10g，放入90mL无菌水中，摇床振荡15min后，放置30s后，取0.1mL涂布到无机盐固体培养基上，然后用升华法在培养基上形成芘膜。成膜方法：把接种后的平板倒扣到底部平铺有固体芘的250mL的烧杯上，并用封口膜将接口处封闭，整体放到沙浴中加热，在平板上方放上冰，使芘升华后遇平板冷却而附着在固体培养基上。制备好的培养皿置入30℃恒温箱培养，能在固体平板上生长起来的真菌再多次用PDA培养基平板画线经多次划线纯化，纯化后的菌株再用于鉴定和芘降解能力的测定。
鉴定
（1）平板观察
选取察氏培养基、麦芽汁培养基、PDA培养基，将接种针经火焰灭菌并冷却后，蘸取极少量的孢子，点植于平板的中间位置，将平板置于25℃培养8d，观察菌落的特征并记录。
（2）显微观察
用解剖针从培养皿的菌落上，挑取少许菌体，置载玻片的水滴中，于显微镜下观察其形态特征并记录。
（3）分子鉴定
提取DNA，通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCT-GCCG-3')（SEQIDNO：1）和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')（SEQIDNO：2）扩增整个ITS序列，并进行PCR产物的纯化和克隆，然后由上海生物工程公司完成测序，测序结果经DNAMAN软件去除载体后，把所得的ITSrDNA序列提交到GenBank数据库,利用BLastn工具进行序列比对，对霉菌进行鉴定。
结果与分析
H2菌在察氏培养基上菌落生长迅速，5天即可长满整皿，致密丛束状，呈同心轮纹状，且中心菌丝缺少，边缘产生大量的暗绿色的分生孢子，反面无色。（图1，图4）；在麦芽汁培养基上菌丝生长茂盛，5天即可长满整皿，棉絮状菌丝，菌丝暗绿色，产白色的分生孢子，平板反面呈较深的土黄偏橙色（图2，图4）；在察氏培养基上菌落生长迅速，棉絮状，5天铺满培养皿，菌丝暗绿色，产白色的分生孢子，平板反面淡黄色（图3，图4）。分生孢子梗为菌丝的短侧枝，其上对生分枝，分枝上又继续分枝，形成二级、三级分枝，类似松柏树枝式轮廓，分枝角度锐角接近直角，分生孢子头椭圆形、球形，卵形等（图5）。
结合上述的平板观察、显微观察和分子鉴定结果，得出如下结论：
本发明筛选到的降解芘霉菌棘孢木霉H2，ITSrDNA序列长度为570bp，具体的序列为：TCGGGACTCACTCCCAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA（SEQIDNO：3），与棘孢木霉（Trichodermaasperellum）的同源性达99.8%，其培养特征及显微形态特征与棘孢木霉（Trichodermaasperellum）最相似。
棘孢木霉H2对芘的降解能力
一级种子的制取
先从斜面上接种至PDA培养基上，培养箱30℃生长10天以上，待表面长满白色的孢子，用无菌勺轻轻刮下表面的孢子，置于含有100mL无菌无机盐培养液中，160r/min，30℃培养3-5天，待孢子球长至2mm左右，进入快速生长期，备用，此为一级种子。
实验过程
用无菌吸管吸取孢子液5mL接种到含芘的25mL的液体培养基中，瓶口用无菌封口培养膜封口（无菌封口培养膜是环凯公司生产的双层膜，上有直径0.6cm的圆孔两个，两层膜的中间有直径3cm的、孔径小于0.2μ的无菌滤纸片，可用于过滤空气），放置恒温振荡培养箱中160r/min，30℃培养，隔一定的时间取样，每次取3瓶，过滤于烧杯中，转入分液漏斗中，加环己烷7ml振摇萃取2min，滤纸和烧杯用丙酮洗涤，同时洗涤液转入分液漏斗中，洗涤后的孢子烘干至恒重，用以测定菌丝干重。
具体检测方法
菌丝干重用恒重法，即80℃烘至恒重。
芘的测定用气相色谱-质谱联用仪(岛津GC/MSQP2010Plus，日本)对有机相中的芘含量进行测定。色谱条件：进样口无分流模式，进样口温度270℃；色谱柱型号为DB-5弹性石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；柱流量1.65mL/min；炉温55℃保持1min，以25℃/min升至200℃，再以10℃/min升至240℃保持0.5min，最后以30℃/min升至280℃保持2min。
结果与分析
本次研究了芘降解霉菌棘孢木霉H2在30天之内的芘降解能力(图6)，以相同条件下未接种菌种的芘培养液为空白对照，在接种的第8天降解率就达到66.41%,菌丝干重0.026g（图7）；至14天，降解率下降为34.17%，菌丝干重0.086g，有快速上升；23天，降解速度又加快很多，降解率达到73.79%，菌丝干重继续上升至0.0955g，；培养30天，降解率达到81.82%，而菌丝干重则略微有下降，为0.0846g。一般来说，霉菌降解芘有两条途径：一是菌丝吸附；二是酶促降解。在本研究的8、14天，含芘的培养液对菌丝生长有抑制作用，此时芘的降解应该主要是菌丝吸附；从8-14天，菌丝对含芘的培养液已经适应并开始快速生长；23天，菌丝继续生长，但生长速度已经减缓，此时降解率再次快速上升，芘的浓度仅为0.540mg/L；至培养30天，菌丝干重有少许下降，且有少量菌丝出现自溶，但降解率继续上升，达到81.82%，此时应该是菌丝产生了某些降解芘的酶，才导致芘的浓度没有上升反而下降得很厉害，所以，在该研究的30天摇床培养中，前期（23天前）应该是以吸附降解为主，而23天后应该是以酶促降解为主。
<110>广东省生态环境与土壤研究所
<120>棘胞木霉H2及其在降解芘中的应用
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工引物
<400>1
tccgtaggtgaacctgccg19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工引物
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<210>3
<211>570
<212>DNA
<213>棘胞木霉
<400>3
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ctgtagtcccctcgcggacgtatttcttacagctctgagcaaaaattcaaaatgaatcaa180
aactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgata240
agtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgc300
cagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggg360
atcggcgttggggatcgggacccctcacacgggtgccggccccgaaatacagtggcggtc420
tcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacaactcgcaccgggagcgcggcgcgtcc480
acgtccgtaaaacacccaactttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgc540
tgaacttaagcatatcaataagcggaggaa570

Claims (5)

1.棘孢木霉H2，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11577。
2.权利要求1所述的棘孢木霉H2作为PAHs降解剂的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：PAHs为芘。
4.一种降解PAHs的生物制剂，其特征在于：该生物制剂中含有权利要求1所述的棘孢木霉H2。
5.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于：PAHs为芘。
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