CN105473707B - 成体心脏干细胞群 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种特异的多能心脏干细胞的鉴定，分离扩增和特性的阐明。阐明这些成体干细胞的特性是由于它们天然地表达一类特异性的可以被用于辅助其分离和扩增的分子标记。特别地，所述细胞表达SOX17和GATA4，但不表达Oct4，Nanog，c‑kit和端粒酶逆转录酶。这些细胞能够分化成为以下以细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞。它们在免疫调节以及提供，激活和/或诱导损伤的心脏组织的修复上表现出前所未有的能力。这些成体干细胞可被用作治疗试剂治疗，包括但不限于，组织再生，特别是损伤心脏组织如心肌的再生。

Description

成体心脏干细胞群

发明领域

本发明涉及一类特异的成体心脏干细胞的鉴定、分离、扩增和特性的阐明。阐明这些成体干细胞的特性是由于它们天然地表达一类特异性的可以被用于辅助其分离和扩增的分子标记。本发明细胞在提供、激活和/或诱导损伤心脏组织的修复上表现出前所未有的能力。这些成体干细胞可被作为治疗试剂用于包括，但不限于，组织再生，特别是损伤的心脏组织如心肌再生。

发明背景

现有技术中已描述过多种不同的心脏干细胞系，包括在WO 99/49015，WO 2005/012510，WO2006/052925，WO02/09650，WO02/13760，WO03/103611，WO2007/100530，WO2009/073616，WO2011/057249，WO2011/057251，WO2012/048010，WO2006/093276和，WO2009/136283中描述的细胞系。

尽管这些干细胞系已通过不同的手段被分离，它们都共有很多相同的特性，实际上可能是相同的或实质上一样的干细胞群。特别地，所述已知的成体心脏干细胞群都共有某些特性、分子标记和形态学特点。所述已知的细胞共有同样的起源(心脏组织)、贴壁培养时的形态，表达成体干细胞表面的分子标记CD90或CD44，并且大部分在扩增过程中的某些时间点也表达c-kit，主要是在所述干细胞培养启示时。端粒酶也被表明在这些细胞中是活跃的。此外，所有这些细胞都具有分化为心脏谱系细胞的能力，如平滑肌、内皮细胞或心肌细胞。

尽管现有技术中已经知道有多种不同的心脏干细胞系，仍然存在鉴定并阐明一种能够被用作治疗用途的心脏干细胞系需要。在治疗的背景下，与接受者遗传上不一致的干细胞系常常在疗效可见之前因对所述干细胞的免疫排斥而引发问题。另一成体来源的多能干细胞所经常经历的问题是在注射到成体动物中时会有形成畸胎瘤的倾向，因此其作为治疗药物的应用受到限制。

因此目前仍存在需要鉴定一具有治疗用途的潜力，但注射到病人体内时不具有形成畸胎瘤倾向的成体心脏干细胞群。更进一步，需要不会引起免疫排斥风险的细胞。

发明概要

本发明提供一新成体心脏干细胞群，其与已知细胞群在分子标记表达谱和形态上不同，并且由于其低免疫原性及对同种异体、同源或免疫缺陷宿主施用时不会形成畸胎瘤而适于治疗应用。本发明所述心脏干细胞还能调节接受者的对异源细胞的免疫应答并能诱导血管发生。本发明所述细胞可分离自心脏组织，优选地分离自心肌组织，并在体外附着于通常用于制备细胞库的表面上扩增。与其他前述细胞不同，本发明所述细胞为端粒酶逆转录酶阴性，所以其扩增能力有限，预防了肿瘤形成。

本发明所述成体心脏干细胞的心脏保护、免疫调节能力和心脏再生潜能使其成为治疗诸如缺血性心脏病、自身免疫疾病、伤口愈合过程或再生治疗等不同疾病的合适的治疗工具。特别地，下述由本发明所述成体心脏干细胞所介导的现象使其成为治疗与细胞死亡和炎症过程有关的疾病的有用的治疗工具：

-由这些细胞产物所介导的心脏保护信号将限制创伤之后细胞的损失。

-所述成体心脏干细胞的免疫调节能力将调节T细胞和巨噬细胞介导的炎症过程。尽管创伤后启始阶段的免疫应答对去除细胞碎片和启始伤疤形成是关键的，延长的炎症过程将不会使伤疤消除和组织再生。

-最后，大鼠模型的体内实验表明所述成体心脏干细胞具有诱导新生组织形成、减少伤疤的尺寸和增加新生肌纤维存在的能力。这将通过所述成体心脏干细胞激活内源干细胞的能力被介导。

因此，所有这些由本发明成体心脏干细胞介导的活性是它们称为治疗与细胞死亡和炎症过程有关的疾病的有用的治疗试剂。此外，这些细胞在需要形成新生组织的疾病中可被用于促进组织再生。在这个意义上，人缺血性心脏病可使用这些细胞进行治疗。所述成体心脏干细胞在该疾病的急性阶段将会限制细胞的丧失，调节免疫应答以使再生更快，最后还将激活内源组织的常驻细胞促进新生组织形成。

成体心脏干细胞和成体心脏干细胞群

本发明提供成体心脏干细胞，特别地以一大体上纯的成体心脏干细胞群的形式提供，其中所述成体心脏干细胞(CSCs)或所述大体上纯的成体心脏干细胞群表达分子标记SOX17和GATA4，并且其中所述成体心脏干细胞或所述大体上纯的成体心脏干细胞群不表达分子标记Oct4，Nanog和c-kit。

“成体”是指所述干细胞不是来源于胚胎的。在一种实施方案中，“成体”意为胚胎后或“出生后”。对于本发明的干细胞，术语“成体干细胞”意为所述干细胞分离自生长阶段在胚胎期之后的动物的组织或器官。在一些情况下，本发明的干细胞也可能分离自出生后阶段。所述细胞可分离自哺乳动物，如大鼠、小鼠、猪或人。成体干细胞不像胚胎干细胞，后者通过其起源-胚囊的内细胞团来界定。根据本发明的成体干细胞可分离自任何非胚胎的组织，并将包括初生儿、少年、青年和成人个体。通常本发明所述干细胞会分离自一非新生哺乳动物，例如分离自一个非新生的人、大鼠、小鼠或猪。优选地，本发明所述干细胞分离自人，因此是人成体心脏干细胞或以大体上纯的人成体心脏干细胞群。

本发明所述成体心脏干细胞及所述大体上纯的人成体心脏干细胞群可被分离获得。

术语“分离”表示其所指的细胞或细胞群不在天然的环境中。所述细胞或细胞群大体上从周边的组织被分离出来。在一些实施方案中，如果样品包括至少大约75％，在一些实施方案中至少大约85％，在一些实施方案中至少大约90％，在一些实施方案中至少大约95％的成体干细胞，则所述细胞或细胞群被大体上从周边的组织中被分离出来。换言之，如果样品包括少于大约25％，在一些实施方案中少于大约15％，在一些方案中少于大约5％的物质不是成体干细胞，则所述样品大体上从周边的组织中被分离出来。所述百分比值指重量或细胞数百分比。该术语包括取自其自身来源的生物体、随后又再次植入某生物体的细胞。所述包括再次植入的细胞的生物体可以是所述细胞所取自的同样的生物体，或者可以是不同的生物体，即相同物种的不同个体。

所述新成体心脏干细胞和所述新成体心脏干细胞群的分子标记表达谱可以通过额外的分子标记的存在和/或不存在，或通过特定的存在或不存在的分子标记组合的表达谱来进一步界定。在每种情况下，所述特定的分子标记组合可作为在一群细胞内的特定表达谱和/或群内的单个细胞的特定分子标记表达谱存在。

因此，在一种实施方案中本发明提供了一种分离的多能成体心脏干细胞，其中所述细胞表达以下分子标记：(a)SOX17和GATA4，并且其中所述细胞不表达以下分子标记：(b)Oct4，Nanog，c-kit和端粒酶逆转录酶，其中所述细胞能够分化为以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞。本发明还提供了一大体上纯的成体心脏多能干细胞群，其中所述细胞群表达以下分子标记：(a)SOX17和GATA4；和/或其中所述细胞群不表达以下分子标记：(b)Oct4，Nanog，c-kit和端粒酶逆转录酶，其中所述细胞能分化为以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在可检测到的水平表达SOX17和GATA4中的一种或多种。在进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在可检测到的水平表达SOX17和GATA4。

在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的成体心脏干细胞中至少大约95％在可检测到的水平表达SOX17和GATA4。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的成体心脏干细胞的至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％在可检测到的水平表达SOX17和GATA4。

本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞还可表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，CSF3，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或大体上纯的所述成体心脏干细胞群的细胞还可表达IL-1β并且任选地表达CD49c和/或HHEX。从这个意义上讲，在一特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞或所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的细胞中的至少大约95％在可检测到的水平表达IL-1β，CD49c和HHEX。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％在可检测到的水平表达IL-1β，CD49c和HHEX。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在可检测到的水平表达SOX17，GATA4，IL-1β，CD49c和HHEX，并且任选地在可检测到的水平表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，CSF3，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述的成体心脏干细胞的至少大约90％、91％、92％、93％、94％或95％在可检测到的水平表达SOX17，GATA4，IL-1β，CD49c和HHEX，并且任选地在可检测到的水平表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，CSF3，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述的成体心脏干细胞的至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％在可检测到的水平表达SOX17，GATA4，IL-1β，CD49c和HHEX，并且任选地在可检测到的水平表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，CSF3，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部。

在一实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在可检测到的水平表达CD31。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约60％(优选地至少62％)在可检测到的水平表达CD31。因此，在一实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞表达以下分子标记中的一种，两种或全部：(a)CD31，CD49c和/或HHEX；和/或其中所述细胞不表达以下分子标记中的一种，两种或全部：(b)CD133，Nkx2.5和/或CXCR4蛋白。在另一实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏多能干细胞群表达以下分子标记中的一种，两种或全部：CD31，CD49c和/或HHEX；其中所述细胞群不表达以下分子标记中的两种或全部：CD133，Nkx2.5和/或CXCR4蛋白。

因此，在一实施方案中本发明提供一种分离的多能成体心脏干细胞，其中所述细胞表达以下分子标记：SOX17，GATA4，IL-1β，CD31，CD49c和HHEX；且其中所述细胞不表达以下分子标记：Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白，Nkx2.5和CD133，其中所述细胞能够分化成以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞。本发明还提供一大体上纯的成体心脏多能干细胞群，其中所述细胞群表达以下分子标记：(a)SOX17，GATA4，IL-1β，CD31，CD49c和HHEX，并且其中所述细胞不表达以下分子标记：(b)Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白，Nkx2.5和CD133，其中所述细胞能够分化为以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞。

优选地，本发明所述成体心脏干细胞分离自心肌组织。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在可检测到的水平不表达c-kit，Oct4和/或Nanog中的一种或多种。在更进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在可检测到的水平不表达c-kit，Oct4和Nanog中的任意一种。

在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95％在可检测到的水平不表达c-kit蛋白。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％在可检测到的水平不表达c-kit蛋白。

在一进一步特定的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95％在可检测到的水平不表达c-kit蛋白，Oct4和/或Nanog中的一种或多种。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的细胞中的至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％在可检测到的水平不表达c-kit蛋白，Oct4和/或Nanog中的一种或多种。

在一进一步特定的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约95％在可检测到的水平不表达c-kit蛋白，Oct4和Nanog中的任意一种。更加特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的细胞中的至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％在可检测到的水平不表达c-kit蛋白，Oct4和Nanog中的任意一种。

在另一特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群还可以在可检测到的水平不表达Nkx2.5，CXCR4蛋白和/或CD133中的一种或多种。在进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群还可以在可检测到的水平不表达Nkx2.5，CXCR4蛋白和CD133中的任意一种。

在进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞中的至少95％在可检测到的水平不表达Nkx2.5，CXCR4蛋白和/或CD133中的一种或多种。更佳特定地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的所述成体心脏干细胞中的至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％在可检测到的水平不表达Nkx2.5，CXCR4蛋白和/或CD133中的一种或多种。本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞还可不表达以下分子标记中的一种或多种，即CD45，CD34，CD11b，端粒酶逆转录酶，CD40，CD80和/或CD86中的1，2，3，4，5，6种或全部。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的细胞表达分子标记SOX17和GATA4的组合，并且不表达分子标记Oct4，Nanog和c-kit的组合。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的成体心脏干细胞中的至少大约95％，例如至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％表达分子标记SOX17和GATA4的组合，并且不表达分子标记Oct4，Nanog和c-kit的组合。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞表达分子标记SOX17，GATA4，IL-1β，CD49c和HHEX的组合，并且不表达分子标记Oct4，Nanog，c-kit，Nkx2.5，CXCR4蛋白，端粒酶逆转录酶和CD133的组合。在一特定实施方案中本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞中的至少大约95％，例如至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％表达分子标记SOX17，GATA4，IL-1β，CD49c和HHEX的组合，并且不表达分子标记Oct4，Nanog，c-kit，Nkx2.5，CXCR4蛋白，端粒酶逆转录酶和CD133的组合。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群表达分子标记SOX17，GATA4，IL-1β，CD49c和HHEX的组合并且任选地在可检测到的水平表达以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，CSF3，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部，且在可检测到的水平不表达分子标记Oct4，Nanog，c-kit，Nkx2.5，CXCR4蛋白，端粒酶逆转录酶和CD133，任选地还有CD45，CD34，CD11b，CD45，CD34，CD11b，端粒酶逆转录酶，CD40，CD80和/或CD86的组合。在一进一步特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的至少大约95％，例如至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％在可检测到的水平表达分子标记SOX17，GATA4，IL-1β，CD49c和HHEX，任选地还有以下分子标记中的一种或多种，即KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，CSF3，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL8中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部的组合，并且在可检测到的水平不表达分子标记Oct4，Nanog，c-kit，Nkx2.5，CXCR4蛋白，端粒酶逆转录酶和CD133，任选地还有CD45，CD34，CD11b，CD45，CD34，CD11b，端粒酶逆转录酶，CD40，CD80和/或CD86的组合。

在某些特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群表达分子标记SOX17，GATA4，WT1，HEY2和KDR中的全部。在以进一步特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群表达分子标记SOX17，GATA4，CD44，CD90，CD105，CD166，WT1，HEY2和KDR中的全部。优选地，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群表达以下分子标记：CD31，IL-1β，CD44，CD90，CD105，CD166，WT1，HEY2，KDR，CCL2，IL-1α，CSF3，PDGF-b，CD29，HAND2，I型MHC和/或IL-8；并且不表达以下分子标记：CD45，CXCR4蛋白，Nkx2.5，CD34，CD11b，CD40，CD80和/或CD86。

在一进一步特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群不表达分子标记Oct4，Nanog，c-kit，CD40，CD80和CD86中的任意一种。在还进一步的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群不表达分子标记Oct4，Nanog，c-kit，CD45和端粒酶逆转录酶中的任意一种。

在本发明的某些实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群具有以下分子标记表达谱：SOX17，GATA4，CD44，CD90，CD105，WT1和KDR阳性，以及Oct4，Nanog，c-kit，CD45和端粒酶逆转录酶阴性。

本发明还提供一“混合细胞群”，包括占本发明所述成体心脏干细胞的至少大约0.5％的(在其他方面至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％或70％)不是本发明所述成体心脏干细胞的细胞，例如，但不限制于，来源于脂肪组织或骨髓的间充质干细胞，心外膜细胞，内皮细胞，周细胞和成纤维细胞。优选地，所述混合细胞群包括间充质干细胞。更优选地，所述混合细胞群中至少大约80％(在其他方面至少85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99.5％)是间充质干细胞。

关于本发明中大体上纯的细胞群中的“大体上纯的”是指一干细胞群，其中所述细胞群本质上仅包括本发明的成体心脏干细胞，即所述细胞群大体上是纯的。在本发明的许多方面，所述细胞群包括至少大约80％(在其他方面至少85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，99.9％或100％)本发明所述成体心脏干细胞。

术语“分子标记”，如本发明中用到的，包括任何其存在，浓度，活性和磷酸化状态能够检测和用于确认细胞表型的生物分子。

术语“表达”用于描述细胞内的分子标记的存在。为了被认为是在表达，一种分子标记必须在可检测到的水平存在。“可检测到的水平”是指所述分子标记可通过标准的实验室方法如PCR，杂交，免疫荧光，ELISA或FACS分析中的一种被检测到。“表达”可以指，但不限制于，一种蛋白、一种蛋白磷酸化的状态或一段编码蛋白的mRNA可检测到的存在。一个基因如果表达可以合情合理地在30个PCR循环后被检测到，优选地在37个PCR循环后被检测到，则被认为被本发明所述细胞或本发明所述群里的细胞所表达，对应细胞内的表达水平大约每个细胞100个拷贝。术语“表达”(express，expression)具有对应的意义。在低于该阈值的表达水平下，一种分子标记被认为没有表达。本发明的成体心脏干细胞中的一种分子标记的表达水平与另一种细胞，例如一种间充质干细胞中所述同样分子标记的表达水平的比较可通过比较分离自同一物种的所述两类细胞进行。优选地这一物种是哺乳动物，并且更优选地这一物种是人。这样的比较可以便利地通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验进行。

本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述成体心脏干细胞群的特性被阐明是由于它们的某些分子标记具有独特的表达水平。此处显示本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述成体心脏干细胞群在可检测到的水平表达众多特异性的分子标记。

如果所述成体心脏干细胞群中的本发明所述细胞的至少大约80％中一种分子标记表现为可以被检测到，则本发明所述成体心脏干细胞群被认为表达这种分子标记。在其他方面，所述群中的本发明所述细胞的至少大约85％，或至少大约90％，或至少大约95％，或至少大约97％，或至少大约98％或更多中的分子标记表现为可以被检测到。表达可以通过使用任何适当的手段，如RT-PCR实验，免疫印迹，免疫荧光，ELISA或通过荧光激活的细胞分选(FACS)被检测到。应当强调的是提供这一列方法仅仅是意在举例，而不是为了限制。

在一可选的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群被认为表达了一种分子标记，如果所述分子标记的表达水平在本发明所述细胞中高于在对照细胞中，例如，在间充质干细胞中。在此处的上下文中，“高于”是指在本发明所述细胞群中所述分子标记的表达水平至少2，3，4，5，10，15，20倍高于在对照细胞中的水平。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中SOX 17和GATA4的mRNA转录本的水平至少大约10倍于，例如大约10倍于，大约15倍于或大约20倍于或更多倍数高于获取自骨髓或脂肪组织中的间充质干细胞的同样的mRNA转录本的相应水平。

在一特定实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中WT1，HEY2和/或KDR的mRNA转录本的水平至少大约10倍于，例如大约10倍于，大约15倍于或大约20倍于或更多高于获取自脂肪组织中的间充质干细胞的同样的mRNA转录本的相应水平。

在一进一步特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中IL-1a，集落刺激因子3(CSF3)和/或PDGF-B的mRNA转录本水平至少大约5倍于，例如大约5倍于，大约10倍于或大约15倍高于或更多倍数于获取自脂肪组织中的间充质干细胞的同样的mRNA转录本的相应水平。

本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的特性还可以被阐明，因为本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在可检测到的水平上不表达一种特殊的分子标记或分子标记的组合。这些当中有许多表示分化或部分分化的细胞。如此处所界定，这些分子标记被称为阴性分子标记。

在一些实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群被认为不表达一种分子标记，如果存在于此的所述成体心脏干细胞的至少大约80％中所述分子标记不显示出可检测到的表达。在其他实施方案中，存在于此的所述成体心脏干细胞的至少大约85％，至少大约90％或至少大约95％或至少大约97％或至少大约98％或至少大约99％或至少大约100％中所述分子标记不显示出可检测到的表达。同样，通过使用RT-PCR实验，免疫印迹，免疫荧光，ELISA或使用FACS可以证明可检测到的表达的缺失。

此处所描述的分子标记被认为没有被本发明所述成体心脏干细胞表达，如果表达不能合乎情理地通过PCR的30个循环的水平检测到，对应细胞内的表达水平大约每个细胞不到大约100个拷贝和/或不能够通过免疫荧光，免疫印迹，ELISA或FACS被轻易地检测到。

本发明特异的分子标记

本发明所指的分子标记包括所述分子标记的特异性参考序列，以及任何这些分子标记的已知的直系同源基因。所述分子标记包括SOX17,GATA4,KDR，WT1，CCL2，IL-1α，IL-8，IL6，G-CSF，CXCL1，sICAM-1，CSF3，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，HAND2，I型MHC，CD45，CD34，CD11b，端粒酶逆转录酶，CD40，CD80，CD86，CD31，IL-1β，CD49c，HHEX，CXCR4蛋白，Nkx 2.5和CD133。

术语Nanog包括Nanog及其任何直系同源基因，包括但不限于2410002E02Rik，ENK，ecat4同源框转录因子Nanog，以及同源框转录因子Nanog-delta 48。

术语Oct-4包括Oct-4及其任何直系同源基因，包括但不限于Pou5f1，POU结构域5型转录因子1，Oct-3，Oct-3/4，Oct3，Otf-3,，Otf-4，Otf3-rs7，及Otf3g。

术语c-kit包括c-kit及其任何直系同源基因，包括但不限于CD117，Fdc，Gsfsco1，Gsfsco5，Gsfsow3，SCO1，SCO5，SOW3，Ssm，Tr-kit及KIT。

术语TERT包括TERT及其任何直系同源基因，包括但不限于端粒酶逆转录酶，EST2，TCS1，TP2，TRT，hEST2及端粒酶催化亚基。

术语SOX17包括Sox17及其任何直系同源基因，包括但不限于NG_028171.1GI:325053743。

术语CD90包括CD90及其任何直系同源基因，包括但不限于Thy1，胸腺细胞抗原1，theta，T25，Thy-1，Thy-1.2，Thy1.1及Thy1.2。

术语CD166包括CD166及其任何直系同源基因，包括但不限于Alcam(激活的白细胞细胞粘附分子)，AI853494,BEN,DM-GRASP,MGC27910,MuSC及SC1。

术语cd11b包括cd11b及其任何直系同源基因，包括但不限于Itgam(整合素αM)，CD11b/CD18，CR3，CR3A，F730045J24Rik，Ly-40，MAC1，Mac-1，Mac-1a，CD11B(p170)；Mac-1α；细胞表面糖蛋白MAC-1α亚基；补体成分受体3α,补体成分受体3α-a,3型补体受体，白细胞粘附受体MO1,和巨噬细胞抗原α。

术语CD29包括CD29及其任何直系同源基因，包括但不限于ITGB1，整合素，β1纤维连接蛋白受体，β多肽，MDF2，MSK12，FNRB，GPIIA，MDF2，MSK12，VLAB，OTTHUMP00000046253，OTTHUMP00000063731，OTTHUMP00000063732；OTTHUMP00000063733，纤维连接蛋白受体β亚基，整合素VLA-4β亚基及整合素β1。

术语CD105包括CD105及其任何直系同源基因，包括但不限于ENG，endolgin，RP11-228B15.2，END，FLJ41744，HHT1，ORW及ORW1。

术语Gata-4包括Gata-4及其任何直系同源基因，包括但不限于GATA-4锌指蛋白转录因子。

术语CD31包括CD31及其任何直系同源基因，包括但不限于PECAM1，血小板内皮细胞粘附分子，CD31/EndoCAM，PECAM-1及CD31/EndoCAM粘附分子。

术语IL-1β包括IL-1b及其任何直系同源基因，包括但不限于IL-1β,IL1-BETA,IL1F2及catabolin。

术语CD49c包括CD49c及其任何直系同源基因，包括但不限于ITGA3，GAP-B3，VCA-2，VLA3a，通过单克隆抗体J143鉴定得到的抗原及MSK18。

术语HHEX包括HHEX及其任何直系同源基因，包括但不限于HEX，HOX11L-PEN及PRHX。

术语CXCR4蛋白包括CXCR4蛋白及其任何直系同源基因，包括但不限于融合素或CD184，D2S201E，FB22，HM89，HSY3RR，LAP3，LCR1，LESTR，NPY3R，NPYR，NPYRL，NPYY3R及WHIM。

术语Nkx 2.5包括Nkx 2.5及其任何直系同源基因，包括但不限于CHNG5，心脏特异性同源框，CSX，CSX1，HLHS2，NKX2-5，NKX2E，NKX4-1及VSD3。

术语CD133包括CD133及其任何直系同源基因，包括但不限于prominin1，PROM1，MCDR2，STGD4，CORD12，RP41，AC133，MSTP061，PROMLI，hProminin，造血干细胞抗原及类prominin1。

细胞形态及其他特征

本发明所述成体心脏干细胞群由具备独特形态的细胞所构成。典型地，本领域所已知的心肌球衍生细胞直径至少为20μm。然而，本发明所述成体心脏干细胞典型地更小且直径小于20μm。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞的平均直径为≤18μm，≤17μm，≤16μm，≤15μm，≤14μm或者甚至更小。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞的平均直径的范围为≥大约10μm至≤大约15μm。在一进一步实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少90％，例如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更多的直径范围为≥大约10μm至≤大约15μm。

本发明所述成体心脏干细胞的形态使所述细胞群对治疗应用尤其有益，因为它们相对小的尺寸使其更适合对冠状及其他血管施用。例如，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群特别适合对冠状动脉，冠状静脉，和/或直接对心肌施用。本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群特别适合通过注射或导管施用。

本发明所述成体心脏干细胞具有无性增殖能力，即，所述细胞能够形成克隆。术语“无性增殖”涉及到本发明所述细胞的无性增殖的能力。所述术语意在表达单细胞接种后能够增殖并重现原始的培养。

在一些实施方案中，本发明所述大体上纯的成体干细胞群被认为具有无性增殖能力，如果所述成体心脏干细胞中的至少大约10％在作为单个细胞接种后增殖并建立起细胞培养。本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞在一些实施方案中至少大约15％，在一些实施方案中至少大约20％，在一些实施方案中至少大约25％，以及在一些实施方案中至少大约30％或更多具有无性增殖能力。

本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞还能够自我更新。即，本发明所述成体心脏干细胞产生具有与母细胞一样的分子标记表达特性谱和发育潜能的子细胞。这一特性可通过本发明所述细胞的培养在经历多次传代后仍未失去分子标记表达谱的能力来确定。然而，本发明所述成体心脏干细胞不能被无限次传代。本发明所述成体干细胞可扩增至20次而不改变任何特性。在一实施方案中，本发明所述成体干细胞可被扩增至50次而不改变任何特性。

本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞还表现出高度的基因组稳定性。“高度的基因组稳定性”是指本发明所述大体上纯的成体干细胞群可被传代多达5次，扩增和/或对个体施用而用比较基因组杂交分析无任何染色体改变的证据。在一特定实施方案中，本发明所述大体上纯的干细胞群中的细胞的≤大约25％,例如≤大约20％,≤大约15％,≤大约10％或更少表现出染色体改变。术语“染色体改变”包括染色体结构的任何重排，其允许染色体结构与正常预期的染色体结构不同。例如，这一术语包含了染色体移位，染色体断裂和染色体倍增或丢失。

本发明所述成体心脏干细胞悬浮培养时能形成心肌球。术语“心肌球”为本领域所熟知并包括由心脏干细胞的克隆构成的假拟胚体。“拟胚体”或“假拟胚体”在本申请中被用作同义词，是在处于应用给出的培养条件下的启始分化成为不同类型细胞的一团细胞的聚集体。

在某些实施方案中，本发明所述大体上纯的成体干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞被认为能形成假拟胚体，如果本发明所述大体上纯的成体干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中的至少大约20％能形成假拟胚体。在一些实施方案中，本发明所述大体上纯的成体干细胞群或本发明所述的混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞中至少大约25％，至少大约30％或至少大约35％或更多能形成拟胚体。

通常地，这类假拟胚体通过悬滴法制备。然而，本发明所述细胞在不覆盖负电荷的细菌培养皿中用生长培养基培养就容易形成拟胚体。对于本领域熟练的人员来说非常清楚这一界定并非意在限定，并且本领域任何已知的制备拟胚体的方法都可以使用。本发明所述细胞以低密度平铺于超低粘附力平皿上时还具备形成假拟胚体的能力是其自我更新能力的一个特性，可以开发利用于这一特性将它们从本发明培养中存在的来源于相同组织的其他非成体心脏干细胞的细胞中分离和分开。本发明所述成体心脏干细胞在细胞迁移试验中还能诱导单核细胞迁移和/或单核细胞的募集。一优选的细胞迁移试验如实施例3D所描述。“能诱导单核细胞迁移或募集”是指在此处所描述的细胞迁移试验中，前面培养本发明所述成体干细胞的培养基当置于小室下面时，诱导置于小室上面的单核细胞穿过5微米的膜孔到小室下面，速率比前面用于培养间充质干细胞(MSC)的培养基诱导的速率快至少1.5，2,3,4,5或更多倍。

本发明所述成体心脏安细胞还能诱导单核细胞增殖。“诱导单核细胞增殖”是指本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群与单核细胞共培养致使单核细胞增殖比单核细胞单独的基准速率或单核细胞与间充质干细胞共培养至少快2,3,4,5,10,15,20或更多倍。单核细胞增殖可通过任何本发明描述的或本领域已知的方法测定。

诱导单核细胞募集，迁移和/或增殖的能力可能对本发明所述成体心脏干细胞的治疗应用是重要的。本发明的发明人，在希望不被理论所约束的前题下，相信在一个体施用后，本发明所述成体心脏干细胞会诱导单核细胞的募集和增殖。所述单核细胞反过来在调节个体的免疫应答上发挥作用。单核细胞的存在也可能诱导该个体的血管发生。

本发明所述成体心脏干细胞还能调节T淋巴细胞应答。所述T淋巴细胞应答的调节可通过任何本领域已知的或本发明所描述的方法进行测定。以优选试验在实施例3E中被给出。“调节T淋巴细胞应答”是指本发明所述成体心脏干细胞能够调节激活的T细胞增殖，并且特别地能够激活并扩增调节性T细胞群和/或下调CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖。在一特别的实施方案中，包括本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群和调节性T细胞的悬浮共培养增使增殖的调节性T细胞的比例与单独培养的T细胞相比增加了10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,150％,200％或更多。在另一特别的实施方案中，包括本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群和PHA激活的T细胞的悬浮共培养使CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖与单独培养的PHA激活的T细胞相比减少了10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或更多。在另一实施方案中，当与丝裂霉素C处理过的本发明所述成体心脏干细胞共培养时，通过IL2加CD3/CD28Dynabeads激活的人原代T细胞的倍增次数与没有本发明所述成体心脏干细胞的阴性对照相比降低了10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或更多。

这些T淋巴细胞调节属性可能对本发明所述成体心脏干细胞的低免疫原性有所贡献，因此也就对本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群的低免疫原性有所贡献，这反过来使它们适用于治疗并适于作为同种异体细胞施用。本发明所述成体心脏干细胞表现出弱免疫原性表型。本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群中的本发明所述成体心脏干细胞不表达分子标记CD40，CD80，和/或CD86。本发明所述成体心脏干细胞的低免疫原性及弱免疫原性表型允许所述细胞避免接受者免疫系统的急性排斥，因此防止和/或延迟了从接受者体内的消除。本发明所述成体心脏干细胞因此仍然在接受者体内会存在一段时间，足够使治疗的有益效果产生。所述调节接受者免疫应答的能力也对治疗用途有益，因为其对本发明所述成体心脏干细胞预防损伤组织中伤疤的形成和促进心肌再生有所贡献。

本发明所述成体心脏干细胞或者不触发体外或体内的免疫应答，或者所触发的免疫应答比同种异体细胞群注射到个体内所预期能触发的免疫应答大幅度减弱。在本发明的某些方面，所述成体心脏干细胞和/或所述大体上纯的成体心脏干细胞群被认为没有触发免疫应答，如果所述成体心脏干细胞和/或所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的至少大约70％没有触发免疫应答。在一些实施方案中，所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的细胞中至少大约80％，至少大约90％，至少大约95％，至少大约99％或更多不触发免疫应答或仅触发弱免疫应答。优选地，本发明所述细胞不触发由抗体介导的免疫应答或不触发体内体液免疫应答，或触发比注射一种同种异体细胞后所预期触发的免疫应答更弱的免疫应答。

“弱免疫应答”是指由本发明所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群所触发的免疫应答与对照的同种异体细胞或细胞群所触发的相应的免疫应答水平相比减少了大约40％，≤大约30％，≤大约25％，≤大约20％或≤大约10％或更少。

免疫应答的缺失，或弱免疫应答的存在可以用任何常规方法或如本发明实施例中所描述来测定，优选地如实施例4A所描述。在一实施方案中，所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群将会被认为没有触发免疫应答或仅触发弱免疫应答，如果针对本发明注射的细胞所产生的同种异体抗体的水平低于针对注射的对照细胞，如间充质干细胞(MSCs)或来自不配对的个体的终端分化细胞，所产生的同种异体抗体水平的10％。特定地，针对本发明注射的细胞所产生的同种异体抗体的水平是针对注射的对照细胞，如间充质干细胞或来自不配对的个体的终端分化细胞，所产生的同种异体抗体水平的≤大约9％,≤大约8％,≤大约7％,≤大约6％,≤大约5％,≤大约4％,≤大约3％,≤大约2％,≤大约1％,≤大约0.5％或更低。

在一特别优选的实施方案中，所述针对所述本发明中注射的细胞或细胞群所产生的同种异体抗体的水平通过常规手段如流式细胞术不能被检测到。

在一实施方案中，所述成体心脏干细胞和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群会被认为没有触发免疫应答或仅触发弱免疫应答，如果所述大体上纯的成体心脏干细胞群与来源于不配对个体的T细胞一起孵育所诱导的IL2，IFNλ，TNFβ，IL4，IL5，IL10，IL3，TNFα和/或TGFβ中的一种或多种的水平低于来源于不配对个体的相同T细胞群与终端分化细胞或间充质干细胞一起孵育后的IL2，IFNλ，TNFβ，IL4，IL5，IL10，IL3，TNFα和/或TGFβ中的一种或多种的表达水平的大约50％。在一些实施方案中，所述大体上纯的成体心脏干细胞群与来源于不配对个体的T细胞一起孵育所诱导的IL2，IFNλ，TNFβ，IL4，IL5，IL10，IL3，TNFα和/或TGFβ中的一种或多种的水平低于来源于不配对个体的相同T细胞群与终端分化细胞或间充质干细胞一起孵育后的IL2，IFNλ，TNFβ，IL4，IL5，IL10，IL3，TNFα和/或TGFβ中的一种或多种的表达水平的大约40％，大约30％，大约25％，大约20％，或大约10％，或更低。在一特定的实施方案中，所述大体上纯的成体心脏干细胞群与来源于不配对个体的T细胞一起孵育后所诱导的IL2和IFNλ的水平低于终端分化细胞与来源于不配对个体的相同T细胞一起孵育后的IL2和IFNλ表达水平的大约50％(例如，≤大约40％，≤大约30％，≤大约25％，≤大约20％，≤或大约10％或更低)。

在另一实施方案中，紧随上文描述的试验所产生的免疫应答可通过检测所述试验中的T细胞增殖速率来测量。在一实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群会被认为没有触发免疫应答，如果来源于不配对个体的T细胞在与所述大体上纯的成体心脏干细胞群一起孵育后其增值速率低于相同的T细胞群与分离自不配对个体的终端分化细胞或PBMCs一起孵育后的所述T细胞的倍增速率的大约50％。在一些实施方案中，所述分离的成体心脏干细胞与来源于不配对个体的T细胞一起孵育后诱导的增殖速率低于相同的T细胞群与分离自不配对个体的终端分化细胞一起孵育后的所述T细胞倍增速率的大约40％，大约30％，大约25％，大约20％，或大约10％或更低。

提供上文所描述的试验仅仅是为了注释说明，而并非意图穷尽所有情况。熟练人员将知晓各种可替代的试验，这些可被使用。优选的试验在本发明实施例中给予了描述。

本发明所述成体心脏干细胞还能够分泌抗凋亡因子。抗凋亡因子的分泌可按本发明所描述来测量，并且特别地如实施例3F所描述。在特定的实施方案中，抗凋亡因子的分泌可通过比较接触用于扩增本发明所述一大体上纯的成体心脏干细胞群的培养基的创伤心肌细胞与接触用于扩增间充质干细胞培养基的创伤心肌细胞的细胞活性来测量。在一特别的实施方案中，接触到本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞的细胞活性至少比对照高2,3,4,5,10或更多倍。

本发明所述成体心脏干细胞还能够促进心肌再生，例如，通过诱导内源心肌细胞的再生，促进新生肌肉形成和/或阻止伤疤形成和重塑心脏组织。实施例4C中给出一优选的测量心肌再生促进的试验。

本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的或本发明所述混合细胞群中的心脏干细胞还是多能的。“多能”是指所述干细胞能够产生来自多种谱系的细胞类型，但谱系的数量有限。

特别地，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群中的或本发明所述混合细胞群中的细胞能够分化为以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞，心肌细胞和/或平滑肌细胞。

产生本发明所述成体心脏干细胞群的方法

本领域已知的从心脏组织中制备心脏干细胞的方法有很多。本发明提供了一种制备所述成体心脏干细胞和/或根据本发明所述一大体上纯的成体心脏干细胞群。在鉴定得到了一些想要获得的成体心脏干细胞群所独有的分子标记后，发明人开发获得了一种制备所述群的方法，包括以下步骤：

(a)提供一包括成体心脏干细胞群的悬液；并且

(b)筛选至少表达SOX17和GATA4的细胞。

所述筛选可通过使用任何常规手段检测至少SOX17和GATA4的表达，并弃去不表达这些分子标记的细胞来进行。在一特别的实施例中，在步骤(a)后获得一团细胞沉淀，并且在mRNA水平高表达SOX17和GATA4的细胞被筛选出准备进行进一步处理。

本发明所述方法可进一步包括扩增步骤(b)中筛选到的细胞的步骤，即步骤(c)。在本实施方案中，本发明提供了一种制备根据本发明所述一大体上纯的心脏干细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供一包括成体心脏干细胞群的悬液；

(b)筛选至少表达SOX17和GATA4的细胞；以及

(c)扩增步骤(b)中筛选的细胞。

所述扩增步骤提供了包括细胞数量更多的一大体上纯的成体心脏干细胞。因此所述扩增步骤对于增加本发明细胞群的规模有益，所述细胞群可用于下游的用途，如本发明所描述的治疗应用。

本发明所述方法可进一步包括确认由步骤(c)产生的所述大体上纯的干细胞群仍然至少SOX17和GATA4还在表达的步骤，即步骤(d)。因此，本发明所述方法可以包括确认源自步骤(c)的已扩增的细胞中至少SOX17和GATA4的表达的步骤。在本实施方案中，本发明提供了一种制备根据本发明所述一大体上纯的心脏干细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供一包括成体心脏干细胞群的悬液；

(b)筛选至少表达SOX17和GATA4的细胞；

(c)扩增步骤(b)中筛选的细胞；以及

(d)确认源自扩增步骤(c)的所述大体上纯的干细胞群至少仍在表达SOX17和GATA4。优选地，确认源自扩增步骤(c)的所述大体上纯的干细胞群至少仍在表达SOX17，GATA4和IL-1β并且不表达以下分子标记：Oct4，Nanog，C-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白和Nkx 2.5；并且任选地，确认所述细胞能够分化为以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和平滑肌细胞。

本发明所述方法可从任何一致的包括一成体心脏干细胞群的悬液开始。然而，在一特定实施方案中，所述方法还包括制备所述启始包含一成体心脏干细胞群的细胞悬液。在一实施方案中，这种细胞悬液从心脏组织，如心脏活体组织检测(例如获取自心脏外科手术，在心脏插入导管的过程中通过活检导管获得，或获取自处死的动物的心脏)。因此，在本实施方案中，本发明方法包括从心脏组织中分离一成体心脏干细胞群的步骤和扩增所述细胞群然后筛选所述细胞的步骤。在本实施方案中，本发明所述方法包括以下步骤：

(a)制备包含来自心肌组织的细胞悬液；

(b)分离成体心脏干细胞群；

(c)扩增所述成体心脏干细胞群；以及

(d)筛选至少表达SOX17和GATA4的细胞。

优选地，步骤(d)包括筛选至少表达SOX17，GATA4和IL-1β，并且，任选地，表达CD31且不表达以下分子标记：Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4和Nkx2.5；并且能够分化为以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞的细胞。

从心脏组织中分离一成体心脏干细胞群可通过任何本领域已知的手段进行。在一特定的实施方案中，来自心脏组织的细胞经过滤除去心肌细胞并经过免疫耗竭去除CD45阳性细胞。所述耗竭的细胞可随后任选地经过免疫选择获得CD117(c-kit)阳性细胞。然而，根据本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群为c-kit阴性，所以发明人相信这一步是任选的并且如果存在的话还可能导致免疫选择的结果不真实。有可能这一步仅仅代表了附加的尺寸过滤步骤，且可被包含有任何免疫选择性的抗体或根本不包含任何抗体的珠过滤所代替。可选地，最初用针对CD117的免疫选择所分离到的细胞可能产生表达c-kit的最初始的成体心脏干细胞群。然而，清楚的是，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群是c-kit阴性的，这意味着任何在起始时存在的c-kit的表达在随后的筛选步骤或筛选和扩增步骤中丧失了。所述细胞的分子标记表达谱在所述方法的步骤与步骤之间可能会改变，而且特别是在启初的包含一成体干细胞群的悬液和产生自所述筛选步骤的细胞之间。

所述扩增所述成体心脏干细胞群的步骤可包括在适合的，有助于细胞生长的条件下(例如在含3％O₂气氛中)在扩增培养基中培养分离的成体心脏干细胞群。所述扩增的成体心脏干细胞群然后可被冷冻保存以创建一个工作细胞库(WCB)。例如，所述成体心脏干细胞群可在传代4次倍增21次以后冷冻保存以构建一个WCB。然后可以分析所述细胞的表达谱。

在一进一步特定的实施方案中，一种制备根据本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞的方法，包括以下步骤：

(a)制备包含来自心肌组织的细胞悬液；

(b)分离成体心脏干细胞群；

(c)扩增所述成体心脏干细胞群；

(d)制备一包括多种细胞系的工作细胞库(WCB)或多个每个库具有一个细胞系的工作细胞库；

(e)从所述工作细胞库中或从至少表达SOX17和GATA4的工作细胞库中筛选那些细胞系；优选地，从所述工作细胞库中或从所述至少表达SOX17，GATA4，IL-1β以及任选地，CD31并且不表达以下分子标记：Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白和Nkx2.5的工作细胞库中筛选那些细胞系；并且，任选地，确认所述细胞能够分化为以下细胞类型中的一种或多种：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和/或平滑肌细胞的细胞系；

(f)扩增所述筛选的细胞系；以及

(g)确认在最终的大体上纯的成体心脏干细胞群中至少SOX17和GATA4的表达，优选地，确认在最终的大体上纯的成体心脏干细胞群中至少SOX17，GATA4，IL-1β以及任选地，CD31的表达，以及以下分子标记的不表达：Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白和Nkx2.5。

在本发明的这一方法的一特定的实施方案中，在步骤(b)和(c)之间有一步筛选步骤，包括筛选至少表达SOX17和GATA4的细胞用于进一步处理。更加特定地，在细胞已经被扩增至少3代后进行增加的一步筛选步骤，其可以包括17次倍增。在传到第3代时，获得一团细胞沉淀并且高水平表达SOX17和GATA4的mRNA的细胞被筛选出并进一步扩增形成工作细胞库。所述细胞的表型在WCB阶段通过流式细胞术和qPCR得以确认，并且细胞扩增后产生终产品。

在本发明所述方法的任意一种中，所述筛选步骤和/或所述确认步骤可任选地还包一种或多种进一步的分子标记的筛选或检测。这些分子标记包括WT1，HEY2，KDR，PDGF，CCL2，IL1α和/或CSF3。在一特定的实施方案中，所述筛选步骤包含筛选表达SOX17，GATA4，WT1和HEY2全部这几种分子标记的细胞。在一进一步特定的实施方案中，所述筛选步骤包含筛选表达SOX17，GATA4，WT1，HEY2，KDR，PDGF-β，CCL2，IL1α和CSF3全部这几种分子标记的细胞。在一特定的实施方案中，所述确认步骤包含确认所述细胞表达SOX17，GATA4，WT1和HEY2全部这几种分子标记。

术语“工作细胞库”在本发明中作常规的意义使用，并会得到本领域技术人员的充分理解。一个“工作细胞库”是一源自母细胞库或来自原代分离的细胞群的细胞培养物并且意在用于准备生产可用于制备本发明所述药物组合物的细胞培养物(也被称作“终产品”)。

尽管通过其他方法也可能生成本发明所述细胞，本发明的发明人发现筛选至少表达SOX17和GATA4的细胞的步骤提高了生产大体上纯的成体心脏干细胞群的效率，其具有所声称的干细胞群的全部优势属性。

筛选自所述WCB的细胞和/或细胞系随后可被解冻并扩增。在一些实施方案中，所述筛选的细胞系可被扩增至直到第5代(累计25次倍增)，这样制成所述终产品(FP)，其中细胞的质量被分析。质量控制(QC)可在生产过程中进行以确保所述终产品的一致性，纯度和安全性。

最终的核实步骤，以确认在最终的，大体上纯的成体心脏干细胞群中至少SOX17和GATA4表达，有益于质量控制的目的以及确认所述终产品是根据本发明所述一大体上纯的成体心脏干细胞群。

本发明还延伸至通过本发明所述方法获得的或能够获得的成体心脏干细胞及一大体上纯的成体心脏干细胞群。

所述成体心脏干细胞群可被分离自任何本领域已知的适合的培养基。术语“培养基”(culture medium，medium)在被领域被承认，并通常指任何用于活细胞栽培的物质或制剂。术语“培养基”，在被用在细胞培养相关的时候，包括细胞周围的环境组分。培养基可以是固体，液体，气体或一种相与物质的混合物。培养基除了不支持细胞生长的液体培养基外还包括液体生长培养基。培养基还包括凝胶培养基，如琼脂，琼脂糖，明胶和胶原基质。典型的气体培养基包括生长在陪替式培养皿或其他固体或半固体支持物上的细胞被接触到的气相。术语“培养基”还指意图用于细胞培养的材料，即使其还未与细胞接触。换句话说，一种富有营养的准备用于细菌培养的液体就是一种培养基。类似地，一种与水或其他液体混合后即变得适合用于细胞培养的粉状混合物可被称为“粉状培养基”。“限定培养基”指由化学上限定的(通常是纯化过的)组分组成的培养基。“限定培养基”不包含成分基本没有阐明的生物提取物，如酵母提取物和牛肉汤。“富集培养基”包括了设计为支持某一特别物种中大部分或全部活体形式生长的培养基。富集培养基常包括复杂的生物提取物。“适于高密度培养物生长的培养基”是指当其他条件(如温度和氧气传输率)允许这种生长时任何允许细胞培养物达到数值为3或更大的OD600值的培养基。术语“基础培养基”指一种促进多类无需任何特殊营养添加成分的微生物的生长的培养基。大多数基础培养基通常包括四组基础化学物质：氨基酸，碳水化合物，无机盐和维生素。基础培养基通常作为更加复杂的培养基的基础，在所述更加复杂的培养基中还要添加诸如血清，缓冲液，生长因子之类的添加成分。一方面，所述生长培养基可以是一种复杂的培养基，含有必要的生长因子以支持本发明所述细胞的生长和扩增而同时维持了其自我更新能力。基础培养基的实例包括，但不限于，Eagles基础培养基，Minimum基本培养基，Dulbecco’s改进型Eagle培养基，培养基199，营养混合物Ham’s F-10和Ham’s F-12，McCoy’s 5A，Dulbecco’s MEM/F-12，RPMI 1640和Iscove’s改进型Dulbecco’s培养基(IMDM)。

在一优选的实施方案中，所述分离培养基包括EGF，bFGF，IGFII和ITS。所述分离培养基可以进一步包括DMEM/F-12培养基，FBS，L-谷酰胺，青霉素-链霉素和/或hEPO。在一特定的优选实施方案中，所述分离培养基包括以下特别指定浓度的组分中的一种或多种：

DMEM/F-12培养基，浓度为大约80-95％，例如85-90％，或86％，87％，88％或89％；

胎牛血清，浓度为大约5-15％，例如7-13％，8-12％或9％，10％，11％或12％；

青霉素-链霉素，浓度为大约0.5-2％，例如0.75-1.5％，0.8-1.2％或0.9％，1％或1.1％，或可选地浓度分别为100U/ml和100μg/ml；

bFGF，浓度为大约5-15ng/ml，7-13ng/ml，8-12ng/ml或9ng/ml，10ng/ml，11ng/ml或12ng/ml；

EGF，浓度为大约10-30mg/ml；

IGF II，浓度为大约20-40ng/ml；

ITS，浓度为大约0.01-1x，例如0.25-0.75x或0.5x；和/或

hEPO，浓度为大0.0001-0.05U/ml，例如，0.001-0.01U/ml，0.0025-0.0075U/ml或0.004-0.006U/ml或0.005U/ml。

在一特定的实施方案中，所述分离培养基包括DMEM/F-12培养基，胎牛血清，L-谷酰胺，青霉素-链霉素，EGF，bFGF，IGFII，ITS和hEPO中的全部。

所述成体心脏干细胞群可在任何本领域已知的合适的培养基中进行扩增。在一优选实施方案中，所述扩增培养基包括EGF，bFGF，IGFII和ITS。所述扩增培养基可进一步包括DMEM/F-12培养基，Neurobasal培养基，胎牛血清-ESCq，L-谷酰胺，青霉素-链霉素，B27，N2,和/或β-巯基乙醇。

在一特定的优选实施方案中，所述分离培养基包括以下特别指定浓度的组分中的一种或多种：

DMEM/F-12培养基，浓度为大约40-50％，例如42-45％，或42％，43％，44％或45％；

Neurobasal培养基，浓度为大约40-50％，例如42-45％或42，43％，44％或45％；

FBS-ESCq，浓度为大约5-15％，例如7-13％，8％-12％或9％，10％,，11％或12％；

L-谷酰胺，浓度为大约0.5mM-5mM，例如1mM-3mM，1.5mM-2.5mM或2mM；

青霉素-链霉素，浓度为大约0.5-2％，例如0.75％-1.5％，0.8％-1.2％，或0.9％，1％，或1.1％,或可选地，浓度分别为100U/ml和100μg/ml；

β-巯基乙醇，浓度为大约40-60μM，例如45-55μM，47-52μM或50μM；

B27，浓度为大约0.01-1x，例如0.25-0.75x或0.5x；

N2，浓度为大约0.01-1x，例如0.25-0.75x或0.5x；

bFGF，浓度为大约5-15ng/ml，7-13ng/ml，8％-12ng/ml或9ng/ml，10ng/ml，11ng/ml或12ng/ml；

EGF，浓度为大约10-30mg/ml；

IGF II，浓度为大约20-40ng/ml；和/或

ITS，浓度为大约0.01-1x，例如0.25-0.75x或0.5x。

在一特定的实施方案中，所述扩增培养基包括DMEM/F-12培养基，Neurobasal培养基，FBS-ESCq，L-谷酰胺，青霉素-链霉素，B27，N2，β-巯基乙醇，EGF，bFGF，IGFII和ITS中的全部。

上述限定的培养基用于心脏干细胞的分离和激增可导致产生少数具有本发明所述成体心脏干细胞属性的细胞。然而，如Lauden等人所鉴定(Circulation Research(2012)DOI:10.1161/CIRCRESAHA.112.276501)，在缺少本发明所描述的筛选步骤时所述心脏干细胞可能为Oct4和Nanog阳性，不像本发明所述细胞。因此，本发明所述筛选步骤有益于生产一大群根据本发明所述成体心脏干细胞。

本发明所述方法可在任何适合的有助于细胞生长的条件下实施。典型的培养条件包括温度大约30-40℃，优选地大约35-38℃，36-37.5℃或大约37℃。氧气从读可以从大约1-5％，例如从大约2-4％或2.5-3.5％，或大约3％。

处理方法，治疗用途及药学上可接受的组合物

本发明所述成体心脏干细胞，包括通过本发明所描述的任何方法获得的或能够获得的细胞，适用于治疗用途及治疗缺血性损伤和心血管疾病的方法，特别是细胞治疗法，包括体内诱组织修复/再生的诱导。本发明所述成体心脏干细胞通常将以本发明所述一大体上纯的成体心脏干细胞群的形式或以本发明所述一混合细胞群的形式被用于治疗方法和治疗用途。

因此本发明提供了治疗方法，包括将本发明所述成体心脏干细胞或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群对接受个体进行施用，并提供了本发明所述成体心脏干细胞或所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群在治疗中的用途。

特别地，本发明所述成体心脏干细胞或所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群有益于治疗缺血性损伤和心血管疾病，如心肌梗塞，慢性缺血性心肌病，心肌病和慢性心力衰竭。鉴于本发明所述细胞的免疫调控能力它们一般可用于治疗自身免疫疾病，炎症过程，慢性溃疡和伤口愈合。此外它们可用于防止同种异体器官移植的排斥。由于本发明所述细胞具有血管形成的能力，它们可用于缺血性疾病，像严重肢体缺血。

因此本发明提供了治疗自身免疫疾病，炎症过程，慢性溃疡及促进伤口愈合的方法，包括对接受对象施用本发明所述成体心脏干细胞，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群，本发明所述混合细胞群或本发明所述药物组合物。本发明还提供防止同种异体器官移植排斥的方法，包括将本发明所述成体心脏干细胞，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群施用于接受对象。

一般本发明所述成体心脏干细胞或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群通过注射或植入引入到对象的体内。一般本发明所述成体心脏干细胞或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群会被直接注射进入预期它们在其中发挥作用的组织。在特定的实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群，本发明所述混合细胞群或本发明所述药物组合物在静脉内，动脉内，冠状血管内或心肌内施用。

本发明所述成体心脏干细胞可按1×10⁶至50×10⁶个细胞的剂量，优选地按25×10⁶至45×10⁶个细胞的剂量，更优选地按35×10⁶至40×10⁶个细胞的剂量，最优选地按38×10⁶个细胞的剂量施用。

在一实施方案中，本发明所述成体心脏干细胞或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群可用于心脏组织再生，包括用于心肌的再生。在此实施方案中，本发明所述细胞可以直接跨心内膜注射或植入受损的心脏组织；在动脉内用针导管将所述细胞注射进入心肌；使用气囊导管插入动脉灌注损伤的组织区域，或相反；通过向冠状静脉内注射所述细胞对所述损伤的区域进行引流的方式注射进入或植入损伤的心脏组织中，一可选的处理心肌的实施方案是经导管经心内膜注射，可使用或不使用带有如NOGA系统或任何其他类似的注射系统的电子作图。在一实施方案中，本发明提供了本发明所述成体心脏干细胞，本发明所述大体上纯的成体心脏多能干细胞群或本发明所述混合细胞群，任选地粘附于一生物相容性植入物，在心脏组织再生中的用途。

在另一实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群可粘附于一生物相容性植入物上被植入损伤的组织。在本实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群可在植入到对象体内之前在体外就粘附于所述生物相容性植入物上。如本领域任何技术人员所清楚的，众多粘附剂中的任何一种在植入前都可用于将所述细胞粘附于所述植入物上。这里仅意在举例，这些粘附剂可包括血纤维蛋白，整合素家族中的一个或多个成员，钙粘着蛋白家族中的一个或多个成员，选择素家族中的一个或多个成员，细胞粘着分子(CAMs)中的一种或多种，免疫球蛋白家族中的一个或多个成员以及人造粘附剂中的一种或多种。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意图进行限定。对于本领域技术人员而言非常清楚一种或多种粘附剂的任何组合都可使用。

在另一实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群在将基质植入对象之前可以被包埋于基质中。一般地，所述基质会被植入对象的损伤组织。基质的例子包括基于胶原的基质，基于血纤维蛋白的基质，基于层黏连蛋白的基质，基于纤维连接蛋白的基质和人造基质。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意图进行限定。

在一进一步的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群可以与一基质形成组分一起被植入或注射进入对象体内。这可能允许所述细胞在注射或植入后形成基质，确保所述细胞在对象体内保持在适当的部位。基质形成组分的实施例包括血纤维蛋白胶液态烷基，氰基丙烯酸盐粘合剂单体，增塑剂，多糖如右旋糖苷，含有乙撑氧的寡聚物，模块共聚物如泊洛沙姆和普兰尼克，非离子型表面活性剂如吐温和Triton'8',以及人造的基质形成组分。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意图进行限定。对于本领域技术人员而言非常清楚一种或多种基质形成组分的任何组合都可使用。

在一进一步的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述混合细胞群可被包含与一微球内。在此实施方案中，所述细胞可封装于所述微球的中心。同样在此实施方案中，所述细胞可包埋于所述微球的基质材料中。所述基质材料可包括任何合适的可生物降解的多聚物，包括但不限于藻酸盐，聚乙二醇(PLGA)，及聚氨酯。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意图进行限定。

用作治疗用途和治疗方法时，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或所述混合细胞群将会按治疗上有效的剂量施用于对象。体内或离体要投放的细胞数量基于一些参数，包括：对象的体重，组织损伤的严重程度，以及对象体内的存活细胞数。一典型的细胞数可以是大约1×10⁶至1×10⁸个细胞，更加特定地10⁶至10⁷个细胞每公斤体重。一般地，一个疗程投中送到对象体内的细胞总数会是大约1×10⁶至1×10⁸个细胞。

如上所述，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群具有数个特性使其特别适用与治疗用途。特别地，低免疫原性，在接受者体内调节T细胞应答的能力，诱导血管发生的能力和促进心肌再生并诱导内源心肌细胞再生的能力都对治疗效果作出了贡献。因此本发明提供了一种治疗心血管疾病和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群用于治疗心血管疾病的治疗用途，其中所述大体上纯的成体心脏干细胞群通过以下机制中的一种或多种诱导心脏组织修复：

(a)单核细胞的募集；

(b)免疫调节；

(c)血管发生的激活；

(d)促进心肌再生和/或

(e)诱导内源心肌细胞的再生。

因此，在本发明一实施方案中提供了一种治疗罹患心血管疾病或缺血性损伤的个体的方法，包括对所述个体施用本发明所述成体心脏干细胞群，本发明所述一大体上纯的成体心脏多能干细胞群，本发明所述一混合细胞群或本发明所述一药物组合物的步骤。本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的低免疫原性和/或本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的免疫调节能力使本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群在施药后避免被所述接受个体的免疫系统急性排斥和/或消除。因此，在至少24小时的时间段内，例如36小时，48小时，72小时，4天，5天，6天，1周，2周，1个月或更长时间内，在所述个体的体内仍存在数量可被检测到的被施用的细胞。在一特定的实施方案中，24小时后，施用的细胞中至少大约50％或更多，例如至少大约60％，70％，80％，90％，95％，99％或更多，在所述个体中仍存在。

所述施用细胞的滞留允许所述细胞形式其治疗心血管疾病或缺血性疾病的功能。例如，所述细胞能够发挥其免疫调节效果，诱导单核细胞的募集和/或激活，诱导血管发生和/或诱导内源心肌细胞的再生长达大约24小时或更长，例如长达36小时，长达48小时，长达72小时，4天，5天，6天，1周，2周，1个月或更长。

尽管来自本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群的细胞在所述个体的体内保持的时间长到足以发挥治疗效果，但所述细胞不会永久地滞留于所述个体的体内。足够发挥治疗效果的时间为至少24小时并可能长达1个月或更长。例如，所述细胞可被滞留长达36,48,72小时，4天，5天，6天，1周，2周或1个月。

本发明所述成体心脏干细胞和所述大体上纯的成体心脏干细胞群的一更进一步的有益属性是其在免疫缺陷的个体中施药后不会诱导肿瘤，如实施例4E所述。

本发明所述成体心脏干细胞和所述大体上纯的成体心脏干细胞群还可以按至少50×10⁶个细胞的剂量通过在冠状血管内施药的方式施用而不显现出任何心脏毒性。在本发明的情况下，心脏毒性通过检测有没有特定的心脏酶的水平升高到超过一般可接受的上限来测量。特别地，心肌肌钙蛋白I(cTnI)，肌酸激酶-MB(CK_MB)和/或肌红蛋白(MB)的水平指示心脏毒性。如本发明实施例4D所述，这些酶的水平在施用本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群于一个体后没有升高。本发明还提供一药物组合物，包括：(a)本发明所述成体心脏干细胞，(b)本发明所述一大体上纯的成体心脏干细胞群，或(c)本发明所述一混合细胞群及一药学上可接受的载体。优选地，本发明所述药物组合物包括从1×10⁶到50×10⁶个细胞，优选地25×10⁶到45×10⁶个细胞，更优选地35×10⁶到45×10⁶个细胞，最优选地38×10⁶个细胞。

所述药学上可接受的载体可包括一细胞培养基，其支持所述细胞的活性。所述培养基通常是无血清的以避免在接受者体内刺激免疫应答。所述载体通常溶于缓冲液和/或无热源的。

药学上可接受的载体及稀释剂包括盐水，液体缓冲溶液，溶剂和/或分散培养基。这样的载体及稀释剂的使用为本领域所熟知。所述溶液优选地为无菌的且流动性程度达到能够轻易地注射。在许多实施方案中，所述溶液在生产和储藏条件下稳定并且通过使用，例如对羟基苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫汞撒来避免保存中被微生物活动所污染。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意图进行限定。本发明所述成体干细胞组合物溶液可通过向一药学上可接受的载体或稀释剂及，如果需要，其他上述所列举的已经过滤除菌的成分中加入本发明所述的成体干细胞制得。

一些能用作药学上可接受的载体的材料和溶液的例子包括：(1)糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)分装黄芪胶；(5)麦芽糖；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可油和栓剂蜡；(9)油，如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；(10)甘醇，如丙二醇；(11)多羟基化合物，如丙三醇，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热源的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯纤维，聚碳酸酯和/或聚酐；以及(22)其他无毒性兼容的用于药物配方的物质。提供这一列名单用意仅在于注释说明，而不是意图进行限定。

在一特定的实施方案中，本发明所述大体上纯的成体心脏干细胞群或本发明所述药物组合物可在冷冻培养基中冷冻。任何在低于大约-20℃的温度(例如低于大约-40℃，或低于大约-80℃的温度)下还能保存所述细胞的活力的培养基都适于用作冷冻培养基。例如，所述冷冻培养基可包括2.5％到10％的DMSO。更加特定地，所述冷冻培养基可包括5-7.5％的DMSO。

冷冻培养基可以基于本发明所述培养基或扩增培养基，还包括胎牛血清或人血清或其他任何在所述细胞解冻后还能维持细胞完整性的蛋白或蛋白混合物。本发明所述细胞还可冻存于基于右旋糖苷的无蛋白培养基中。

解冻后，本发明细胞可经洗涤除去DMSO或其他冷冻培养基组分再施用或重悬于施用缓冲液。施用缓冲液可为任何能够注射进病人体内后不产生毒性的生理溶液。施用缓冲液可包括3-15％蛋白质，如人血清白蛋白。

本发明所述药物组合物还可用于本发明所述的治疗或治疗用途方法中的任何一种。

一般的定义

术语“大约”与数值相关时是指该数值的+/-10％。术语“大约”与数值相关时还包括该数值的+/-5％。

术语“包括”(comprise，comprising)用于包括性的，开放性的意思，意指其他的要素可被包括在内。术语“包括”还包含术语“由…组成”和“基本上由…组成”并可与之互换使用。

术语“大体上纯的”包括“完全纯的”并可与此术语互换使用。

附图简要说明

图1、生产本发明所述心脏干细胞流程的示意图。

图2、A)本发明所述心脏干细胞(CSCs)与源自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞相比SOX17和GATA4的具有更高的mRNA表达(通过qPCR测定)；

B)CSCs表达SOX17和GATA4蛋白，由蛋白表达阵列研究可以观察到。

图3、A)通过流式细胞术分析发现在CSCs中c-kit没有表达或表达水平非常低。c-kit具有代表性的表达(黑色线条)已示出。灰色填充区域显示同型对照。

B)流式细胞术分析揭示CSCs中CD45，CD11b，CD34，CXCR4和CD133在其细胞膜上表达为阴性。CD45，CD11b，CD34，CXCR4和CD133的表达(黑色直方图)对应于同型对照(灰色填充的直方图)被示出。

图4、A)CSCs不表达端粒酶。通过对CSCs进行qPCR分析没有观察到端粒酶催化亚基的表达。

B)CSCs中的端粒重复片段扩增流程(TRAP)端粒酶活性与MSC或HDF比较。在CSCs中未观察到端粒酶活性。

C)人CSCs体外充分扩增后(>30次群倍增)进行细胞化学分析检测衰老相关β半乳糖苷酶活性(SA-βGal)。体外扩增后，部分CSCs与X-gal孵育后变蓝，表明这些细胞衰老了。

图5、A)经蛋白质阵列分析CSCs不表达Oct3/4或Nanog。

B)经Western杂交分析CSCs不表达Oct3/4或Nanog。

图6、A)ELISA研究已示出CSCs如何在工作细胞库和在终产品(FP)中表达大量的CCL2。间充质干细胞被用作对照细胞系。

B)CSCs表达IL-8，IL-6，CXCL6，sICAM1和IL-1α蛋白，由蛋白表达阵列研究可观察到。

图7、CSCs表达I型MHC但不表达共刺激分子CD40，CD80和CD86。

图8、A)在分离和体外扩增后分析CSCs的细胞大小。

B)CSCs分离后具有圆形的形态。

C)CSCs在体外扩增时获得了类基质细胞的形态。

D)CSCs在传至第2代(P2)和第7代(P7)时有无性增殖能力。

E)和F)在超低粘附性平板上接种一个单细胞时CSCs能够形成心肌球并悬浮生长。

图9、A)细胞迁移试验Transwell平板。

B)CSCs具有较强的募集单核细胞的能力。

C)CSCs对激活的T细胞展示出免疫调节能力。

图10、A)由CSCs分泌的生长因子促进生存。

B)所述由CSCs分泌的因子的促存活能力也在H9c2细胞中在血清去除后进行分析。

图11、A)CSCs分化为心脏细胞谱系的潜力通过免疫荧光进行分析。在特定的分化培养基中培养后CSC细胞展现出对应于平滑肌，内皮细胞和心肌细胞的分子标记的表达。

B)此外，CSCs在适当的培养基中培养后也能分化成脂肪细胞和骨细胞。脂肪细胞的分化通过油红O染色(以示出细胞质脂滴)进行分析，而骨细胞分化通过茜素红染色(以指示出钙的沉积)确证。

图12、本图所示比较基因组杂交分析对应一人类女性的基因组且未观察到染色体改变，如倍增或缺失。

图13、同种异体的CSCs在冠状血管内施用后未引起强体液应答。

A)同种异体的猪CSCs通过冠状血管内注射到免疫活性的梗塞的猪体内，在细胞施用前或15或30天后采集血样。在第30天同样的细胞按新的剂量通过静脉内注射到体内，并且血样在第二次注射后第3,7,15和30天采集。

B)特异的免疫反应性的免疫球蛋白(IgG和IgM)的存在在不同的血样中进行分析。在最初的30天中针对被注射的细胞无法找到特异的免疫反应性的IgG。反之，在第二次注射后我们在第7,15和30天观察到了同种异体CSCs特异的IgM和IgG的存在。这些结果表示尽管同种异体CSCs在施用后不会触发强体液应答，它们仍被识别并很可能被产生免疫记忆的免疫系统消除，免疫记忆在第二次注射后引发了更强和更快的应答。

图14、CSCs注射24小时候还留在心脏中。使用到GFP标记细胞的示踪实验表明CSCs至少在注射后24小时仍留在梗塞区域。人CSC用GFP(>)标记并注射到免疫缺陷大鼠的心肌内，大鼠在此7天前已形成梗塞。24小时后处死动物，通过组织学分析到GFP阳性细胞的存在。荧光标记的微球与所述细胞一起共注射以能够坚定到注射部位(实心箭头)。细胞核用DAPI染色(*)。

图15、A)免疫缺陷大鼠通过连接冠状动脉前降支形成梗塞，并且来自不同供体的CSCs被移植到心肌内(5x10⁵)并与注射PBS的动物对比。前壁(AW)增厚的水平在移植有CSCs的动物中显著更高。

B)与对照动物相比，在用细胞处理过的大鼠中通过采用Masson三色染色的组织学分析也显示伤疤的大小显著下降，并且在受影响的区域心肌细胞增加。

图16、注射溶液(安慰剂)或剂量为50×10⁶的人CSC已通过冠状血管内注射到健康的猪的体内。心脏酶在基线和细胞注射后24小时进行检测，并未观察到毒性。

图17、使用特异性探针(来自Life Technologies的TaqMan探针)的定量PCR(qPCR)分析显示与用作对照细胞系的间充质干细胞相比，在CSCs中GATA4，SOX17，WT1，HEY2，KDR，HHEX和HAND2过表达。GUSB基因被用作内源对照基因。数值为相对定量的Log2对数值。

图18、流式细胞分析揭示CSCs在其细胞膜上高水平表达CD166，CD90，CD44，CD105，CD31和CD49c(黑色直方图)。同型对照如灰色的填充的直方图所述。

实施例

实施例1细胞的分离与扩增

本发明所述细胞分离自从右心耳获得的心脏穿刺与处死的动物(小鼠，大鼠，猪等)的心脏。通过将穿刺样本切成小碎片(＜1mm³)并用2型胶原酶(Worthington生物化学公司，Lakewood，新泽西，美国)处理3个循环每次30分钟获得一细胞悬液。心肌细胞通过离心和使用40μm细胞滤网过滤去除。在CD45阳性细胞被免疫耗竭并依照生产商说明书使用微珠(Miltenyi生物科技，Bergish Gladbach，德国)筛选CSCs后获得心脏干/组细胞。所述用到的微珠为CD117(c-kit)微珠，但其他微珠也可以使用，应为CSCs的分离并不依赖于c-kit的存在。

分离后，所述细胞在分离培养基(DMEM/F12培养基添加10％胚胎干细胞级的胎牛血清(FBS ESCq)，L-谷氨酰胺(2mM)，青霉素-链霉素(100U/mL和100μg/mL)，bFGF(10ng/mL)以及ITS(Invitrogen，马德里，西班牙及圣-欧班，法国)，IGF-II(30ng/mL)和EGF(20ng/mL)(Peprotech，Neuilly-sur-Seine，法国)和hEPO(Sigma-Aldrich，马德里，西班牙)(见表1))中接种于基质胶(BD生物科学，马德里，西班牙)包被的平板。

表1 CSC分离培养基

所述细胞于37℃在3％O₂的气氛下生长，以此促进发挥恰当的功能并模拟生理/病理的条件。细胞接种一周后，分离培养基由扩增培养基所取代，扩增培养基是DMEM/F12和Neurobasal培养基(1：1)并添加有10％FBS ESCq，L-谷氨酰胺，青霉素-链霉素，B27(1×)，N2(1×)，β-巯基乙醇(50μM)，ITS和生长因子(bFGF，IGF-II，EGF)的组合(见表2)。

表2扩增培养基

所述细胞在扩增培养基中和3％O₂的气氛下生长，然后在传至第4代倍增21次后冻存一制得工作细胞库(WCB)。随后分析所述细胞的表达谱。表达谱正确的细胞被解冻并扩增直到第5代(累计倍增25次)，这样形成所述终产品(FP)其中细胞的质量进行了分析。质量控制(QC)在生产过程中完成一确保所述终产品的一致性，纯度和安全性。

实施例2 CSCs中mRNA与蛋白质表达的阐明

A.CSCs表达SOX17和GATA4mRNA

根据实施例1所述方法获得的SOX17和GATA4在所述心脏干细胞(CSCs)中的mRNA表达与来自骨髓或来自脂肪组织的间充质干细胞(MSCs)进行了比较。来自CSCs与来自MSCs的mRNA被分离，并制得cDNA用于qPCR和表达阵列实验。

为了所述表达阵列实验，来自1×10⁶CSCs的或来自脂肪组织MSCs的RNA用Qiagen柱(RNeasy柱)分离并且RNA的质量通过生物分析仪(Agilent技术)试验进行分析。只有RIN＞7的RNA制品才得以扩增并用低输入标记试剂盒(Agilent技术)进行标记。用到了8个在WCB水平不同的CSCs供体和6个在FP水平不同的CSCs供体进行本研究。作为参照的样品，4个在WCB水平不同的MSCs供体和4个在FP水平不同的MSCs供体被使用。微阵列表达SurePrintG3v2，60K平台被使用，并且分析通过使用GeneSpring v12.1软件完成。统计学显著性(p-值矫正)使用单因素方差分析(ANOVA)计算并通过多次测试(Benjamini-Hochberg)矫正。矫正后的p值＜0.05被认为在统计学上差异显著。如图2A所示，在CSCs中SOX17和GATA4的mRNA表达量比在来自脂肪组织的MSCs中高出20多倍。

微阵列表达分析的确证通过qPCR进行。收集CSCs和人MSCs，用TRI-试剂(Sigma-Aldrich)按生产商使用说明提取总RNA。通过分光光度计测量法测量RNA浓度。根据生产商使用说明用

III RT-PCR第一链合成系统(Invitrogen)从2μg RNA合成cDNA。所述合成的cDNA按1:10稀释，50-200ng cDNA用人特异性TaqMan探针(AppliedBiosystems，见表3)进行定量实时PCR(qPCR)。qPCR反应用Taqman通用PCR大师混合液(Applied Biosystems)重复三次。PCR反应在StepOnePlus机器(Applied Biosystems)上进行，用StepOne软件2.2.2版本及Data Assist软件3.0版本来分析结果。mRNA的表达以β-葡萄糖苷酸酶的表达来标准化。人骨髓MSCs被用来作为相对定量计算(2-ΔΔCT)的参照细胞系。

表3 TaqMan qPCR分析引物列表

靶标	参考号
		GATA4	Hs00171403_m1
SOX17	Hs00751752_s1
		WT1	Hs01103751_m1
HEY2	Hs00232622_m1
		KDR	Hs00911699_m1
端粒酶	Hs00972656_m1
		GUSB	Hs99999908_m1
HHEX	Hs00242160_m1
		HAND2	Hs00232769_m1
Nkx 2.5	Hs00231763_m1

使用本方法确认了SOX17和GATA4的mRNA表达水平在CSCs中比在人间充质干细胞中高，如图2B所示。

B.CSCs表达SOX17和GATA4蛋白

通过蛋白质表达阵列研究来测定GATA4和SOX17是否被翻译。制备线性生长期培养的细胞的小团沉淀，用PBS洗涤2次并干燥冻存于-80℃。在做杂交前，解冻小团沉淀并按照生产商使用说明制备CSC裂解液。对每种细胞裂解液中的蛋白质浓度进行了定量。

所述阵列研究使用Proteome Profiler的人源阵列试剂盒，即Proteome Profiler人细胞因子阵列试剂盒A组(ARY005)和一人多能干细胞阵列试剂盒(ARY010)。所述裂解液(200μg蛋白抽提液)与阵列中存在的蛋白(人细胞因子和干细胞调控蛋白)的抗体混合，随后蛋白-抗体复合物与膜一起孵育。与抗体阵列膜的杂交根据生产商的使用说明进行。发现CSCs表达SOX17和GATA4蛋白(图.2B)。

C.CSCs表达CD166，CD90，CD44和CD105但不表达c-kit，CD45，CD34和CD11b

c-kit，CD45，CD34，CD11b，CD166，CD90，CD44和CD105的表达通过流式细胞术测定。细胞以胰酶-EDTA消化并重悬于DMEM。由台盼蓝染料排除技术发现细胞活力为>85％。将所述细胞离心并重悬于PBS至浓度为0.2-1.0×10⁶个细胞/mL。染色前，细胞用1％(v/v)溶于PBS的人血清在冰上封闭20分钟。大约0.5–3.0×10⁵个细胞被饱和浓度的表面分子标记特异的抗体和同型匹配的对照染色。所述细胞避光4℃孵育1小时。孵育后，细胞用PBS洗涤两次。当一抗处于纯化状态时，所述细胞此外还与荧光基团偶联的物种特异性Ig抗体避光4℃孵育20分钟。某一特定的分子标记染色为阳性的细胞通过在一阈值内的细胞百分比来测定，该阈值确立的标准是所述测到的阳性事件中不到2％代表被所述同型配对对照非特异性的结合。每个分析中最少计数2500个事件。所述细胞表面分子标记的表达用商品化的抗体按生产商推荐的稀释倍数通过流式细胞术分析。细胞使用Eipcs XL流式细胞仪获得并使用FCS Express 3软件进行分析。

表4流式细胞分析中用到的抗体

如图3A所示，在CSCs中未观察到的c-kit的表达根本没有或非常低。使用两种不同抗体(一种获取自Miltenyi，另一种获取自BD)获得了类似的结果。

如图3B所示，CSCs的谱系分子标记CD45，CD11b和CD34也被发现为阴性。

如图18所述，CSCs表达CD166，CD90，CD44和CD105。

D.CSCs不表达端粒酶

根据如实施例2A所描述的方法通过qPCR分析了CSCs以检测其是否表达端粒酶的催化亚基。肿瘤细胞系KG1和MCF7被用作阳性对照，并且来自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)和人二倍体成纤维细胞(HDF)被用作阴性对照。mRNA按实施例2A所述的方法提取，端粒酶催化亚基的表达由使用到特异TaqMan探针的qPCR检测。在CSCs中未检测到端粒酶催化亚基的表达(见图4A)。

此外，CSCs中的端粒酶活性与MSC或HDF通过端粒重复片段扩增流程(TRAP)进行了比较，该方法是一种高度灵敏的基于对端粒酶活性的荧光检测和实时定量的方法。端粒酶活性对温度敏感，并且在85℃时失活。在85℃孵育过与未在85℃孵育过的样品的端粒酶活性进行了比较。1×10⁶个CSC的小团沉淀被制得并使用TRAPEZE RT端粒酶检测试剂盒(CHEMICON)进行端粒酶活性检测。来自不同供体和体外扩增中不同步骤的CSCs(WCB和FP)被检测。细胞系K562和MCF7用作阳性对照品。端粒酶活性按生产商提供的使用说明进行分析。PCR反应在StepOnePlus(Applied Biosystems)上进行。制作得到不同端粒序列含量的标准曲线，并且端粒活性的定量通过定量标准曲线软件进行分析。

在所述三种细胞系的任何一种内都未检测到显著的活性。另外，检测到CSCs在体外细胞扩增时端粒长度缩短，表明这些细胞不会延长端粒。这种伴随着每一次细胞分裂的端粒的缩短在体外细胞进行充分培养后将会最终导致增殖的中止。

E.CSCs体外充分扩增后的衰老

对CSCs进行了细胞化学分析以测定其在体外充分(>30次群倍增)扩增后是否会变得衰老。衰老通过基于衰老相关的β-半乳糖苷酶活(SA-βGal)性来检测。CSCs在体外被扩增，固定并在pH6条件下与发色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳避难糖苷(X-gal)一起孵育，当其被β-半乳糖酶切割时会产生不溶的蓝色复合物。如图4C所示，体外扩增后部分CSCs在与X-gal一起孵育后变蓝，因此表明这些细胞在衰老。

F.CSCs不表达Oct3/4或Nanog

涉及到干细胞发育的不同基因的表达通过上述蛋白质表达阵列进行了分析。如图5A所示，未观察到Oct3/4或Nanog的表达。

Oct3/4的表达还通过Western杂交使用三种不同的抗体在大鼠和人CSCs中进行了分析。1-5×10⁶个细胞的细胞的小团沉淀用添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA裂解缓冲液(20mM Tris pH7.5，150mM NaCl,2mM EDTA，1％脱氧胆酸钠,1％Triton X-100,0.25％SDS)裂解。全细胞提取物(WCE)的蛋白浓度用Nanodrop测定，等量的WCE(50μg)上样至Tris-甘氨酸凝胶并转至0.45μm聚偏氟乙烯膜(PVDF)。膜用添加Tween的Tris缓冲盐溶液(10mM Tris-HCl,pH 8,150mM NaCl,and 0.05％Tween 20)洗涤2次，室温用溶于添加Tween的Tris缓冲盐溶液的5％脱脂牛奶或1％BSA封闭1小时，然后用生产商推荐的不同浓度一抗4℃杂交过夜。免疫印迹用辣根过氧化物酶偶联的二抗处理，随后用ECL-plus进行发光反应。通过再次与抗β-肌动蛋白的抗体杂交来保证上样量相等。

表5用于Western杂交分析的抗体

NTERA消息被用作阳性对照。50μg来自CSCs的细胞蛋白提取物跑SDS-PAGE胶，蛋白转至醋酸纤维素膜，并用特异的抗体(见表5)检测Oct3/4的存在。肌动蛋白被用作上样的对照。如图5B所示，Western杂交分析证实了Oct3/4表达的缺失。

G.WT1，HEY2，KDR，HHEX和HAND2mRNA表达在CSCs内比在MSC内要高

WT1，HEY2，KDR和HHEX在CSCs中的表达与来自脂肪组织的间充质干细胞用如实施例2A所描述的表达阵列进行了比较。如表6所示，发现CSCs表达的WT1，HEY2，KDR和HHEXmRNA转录本在CSCs内比在来自脂肪组织的MSCs内多至少20倍。

表6 CSCs与来自脂肪组织的MSCs内WT1，HEY2，KDR和HHEX的比较表达

这些结果已经过使用特异性TaqMan探针的qPCR(见实施例2A)确证。图17总结qPCR分析结果，表明GATA4，SOX17，WT1，HEY2，KDR，HHEX和HAND2与作为参照细胞系的MSCs相比较时在CSCs内过表达。图17的数值为想对定量的Log2对数值。

H.CSCs过表达分泌因子IL-1α，CSF，PDGF和IL-1β

分泌因子IL-1α，集落刺激因子3(CSF3)，PDGF和IL-1β在CSCs内相对于来自脂肪组织MSCs的比较表达(倍数改变)由mRNA表达阵列来进行评估。如表7所示，分泌因子IL-1α，CSF，PDGF和IL-1β的mRNA表达比在来自脂肪组织的MSCs中至少高10倍。

表7在CSCs与来自脂肪组织的MSCs内IL-1α，CSF，PDGF和IL-1β的比较表达

L.CSCs分泌大量的CCL2

在所述WCB与FB中CCL2的分泌水平通过ELISA来测定。CSCs按5000个细胞/cm²接种于DMEM/F12:Neurobasal培养基(1:1)还补充有10％血清的培养基中。第二天所述培养基由无胎牛血清并添加有生长因子类胰岛素生长因子2(IGF-II)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的培养基替换。3天后收集细胞培养上清液，碎片通过1500×g离心3分钟去除，然后立即进行分析。人CCL2/MCP-1Quantikine ELISA试剂盒(R&Dsystems)按生产商的使用说明使用。

如图6A所示，CSCs在WCB和在FP内都表达大量的CCL2。相比之下，MSCs产生的CCL2量低一些。

J.CSCs过表达IL-8，IL-6，CXCL1，sICAM1，IL-1α，IL-1β，G-CSF蛋白

为了评估IL-8，IL-6，CXCL1，sICAM1，IL-1α，IL-1β和G-CSF在CSCs内的表达水平进行了蛋白质阵列研究。来自骨髓的间充质干细胞(MSC-BM)被用作对照细胞系。用到了一种R&D的人多能干细胞抗体阵列。CSC裂解液(200μg蛋白提取物)与针对干细胞调控相关蛋白的抗体混合，随后蛋白抗体复合物与蛋白定量膜一起孵育。

如图6B所示，发现CSCs在CSCs内比在MSCs内表达G-CSF，IL-8，IL-6，CXCL1，sICAM-1，IL-1β和IL-1α蛋白质的水平更高。

K.CSCs不表达Nkx 2.5

用定量PCR(qPCR)测定与作为参照细胞系的骨髓MSCs相比CSCs内Nkx2.5的表达。从这些细胞中提取mRNA，Nkx2.5的表达通过使用特异TaqMan探针的qPCR来进行评估。在CSCs细胞中未检测到Nkx2.5的表达.

L.CSCs表达CD31和CD49c蛋白但不表达CD133或CXCR4蛋白

CD31，CD49c，CD133和CXCR4蛋白的表达根据实施例2C所列举的方法由流式细胞术进行评测。

如同实施例2C，获取了每种抗体染色的细胞计数相对于荧光强度的直方图，使用正向参数相对于侧向散射参数划定细胞的阈值以去除碎片。当对应于阳性细胞的直方图，就表达水平而言(荧光强度)可清楚地与同型对照和/或阴性细胞后获得的直方图区分开时，进行阈值划定分析。对于更低的荧光强度，还通过减去细胞结合到特异性的分子标记与非特异性的同型配对对照的抗体上所产生的部分重叠的直方图的面积来确证阳性细胞的数量。当使用减去面积作为表达水平定量的手段时，当细胞具有超过30％的表达时即被认为是阳性。

图3B的流式细胞结果显示出CSCs表面不表达趋化因子受体CXCR4。同样CSCs为c-kit(CD117)分子标记阴性(如前所述，见图3A)。这些分子标记的表达为阴性，因为其对应的分子标记抗体所产生的信号的强度与同型对照所产生的信号的强度一样。类似地，在CSCs的膜表面为检测到CD133表达。如图3B所示，CSCs与特异性抗CD133的抗体一起孵育后所观察到的信号与对照抗体观察到的类似(灰色区域)。

CD31在CSCs细胞群中一致性地表达。在图18中可观察到CSCs结合抗CD31的抗体所产生的直方图描绘出一个独特的峰及均匀分布，表明相对于同型对照的直方图(实心灰色)荧光强度增加。即，CSCs为CD31细胞表面分子标记阳性。如图18所示，当使用减去面积的手段时，CD31的表达高于30％。CD49c也被表明在100％的CSCs中一致性表达。

实施例3 CSC体外表型特点分析

A.CSCs具有低免疫原性谱

CSCs内共刺激分子CD40，CD80，CD86和I型MHC(或I型HLA)的表达通过实施例2C所述的流式细胞试验方法测定。CSCs被发现表达I型MHC，但不表达或表达非常低水平(<2％)的共刺激分子CD40，CD80和CD86。

B.CSCs的形态和大小独特

CSCs的大小在分离后与体外扩增后进行分析。所述细胞的大小也在解冻所述冻存细胞后在所述终产品中进行测量。如图8A所示，分离的CSC细胞比MSCs和成纤维细胞小，并且在培养后一直维持着更小的尺寸。CSCs的平均大小为直径小于15μm大于10μm，如图7所示。

如图8所示，CSC细胞分离后具有圆形的形态。在体外扩增时所述细胞获得以类体细胞的形态，如图8C所示。

C.无性增殖能力和CSCs能形成心肌球的能力

CSCs的无性增殖能力在传至第2代(P2)和第7代(P7)时通过接种单个细胞到超低吸附力96孔板的孔当中进行评测。所述心肌球的存在通过接种后14天和21天在显微镜下直接视觉检查来分析。如图8D-F所示，CSCs在第2代(P2)和第7代(P7)被发现具有无性增殖能力并能够形成心肌球，在接种于超低吸附力平板时能悬浮生长。

D.CSCs能够诱导单核细胞募集

通过进行细胞迁移试验来测定CSCs是否能够诱导单核细胞迁移通过多孔膜。使用了具有孔径为5微米的嵌套室的24孔迁移小室(Costar，美国)。MonoMac-1细胞培养至适当浓度以使其在试验时处于指数期。所述细胞经过计数，两次洗涤并被置于迁移小室的嵌套室(100μL内2.5×10⁵个细胞)。对应于CSCs，MSCs(来自骨髓)或HDFs的细胞上清液的条件培养基被置于所述孔的下面部分。所述细胞在37℃，5％CO₂下温育240分钟。所有点值均进行两次重复。然后移除所述嵌套室并通过流式细胞术对迁移至所述小室下面部分的细胞进行计数。如图9B所示，CSCs与MSC或HDF相比更强地诱导了单核细胞募集。

E.CSCs对激活的T淋巴细胞展示出免疫调节能力

CSCs对T细胞的免疫调节效果在用CFSE标记T细胞后进行分析。HLA错配的CFSE标记的PBMC(1×10⁵)通过Dynabeads人T激活分子CD3/CD28(Life Technologies)加IL-2(10ng/mL)或通过植物血凝素(PHA)在丝裂霉素C处理过的CSCs(1×10⁴)存在或不存在的条件下刺激5天。共培养结束后T细胞的增殖通过流式细胞术测定，在CD3，CD4或CD8阳性细胞内用CFSE示踪。如图9C所示，CSCs对激活的T淋巴细胞(CD3阳性)展示出免疫调节能力。

F.由CSC分泌的生长因子促进细胞生存

CSCs分泌的因子对成肌细胞H9C2的心肌保护能力在体外通过使用CSC条件培养基进行研究。H9C2细胞的死亡可由1mM过氧化氢(H₂O₂)诱发，过氧化氢导致诱导凋亡的氧自由基的产生。H9C2按20×10³个/mL接种，24小时后加入1mM H₂O₂并进一步孵育细胞30分钟。随后所述生长培养基被源自CSCs，MSCs-BM或HDFs的条件培养基所取代，并且细胞继续培养16小时。最后，加入阿尔玛蓝(1:10稀释)并在2小时后通过在EnVision多功能酶标仪上测量570nm吸收值来分析细胞活力。如图10A所示，向过氧化氢处理过的H9C2细胞中加入CSC条件培养基被发现阻止了细胞死亡并增加了细胞代谢。

所述由CSCs分泌的因子的促生存能力还在血清耗竭后的H9C2中进行分析。血清耗竭的细胞凋亡通过在无血清培养基中培养细胞24小时诱发。在血清耗竭导致的细胞凋亡进程的启始，H9C2细胞通过切割caspase3的前体形式激活caspase3。无胎牛血清的CSCs，MSCs-BM或HDFs的条件培养基被加入，24小时后caspase3的激活按实施例2F所述的方法通过Western进行分析。如图10B所示，caspase3的促激活在与无血清/CSC条件培养基共培养的H9C2饥饿细胞中被发现降低。

G.CSCs能够分化为多种谱系

CSCs分化为心脏谱系的潜力通过免疫荧光显微术进行分析。人CSC按5000个细胞/cm²接种于0.1％明胶包被的6孔板并在添加了10％FBS ESCq及生长因子的DMEM/F12和Neurobasal(1:1)的培养基中孵育24小时。细胞用100nM后叶催产素(Sigma-Aldrich)处理3天，然后胰酶消化并接种于p24超低粘附力孔内(Costar)(2000个细胞/孔)。七天后，收集心肌球并在分化培养基中分配于铺有预先用层粘连蛋白(Sigma-Aldrich)包被过的玻片的24孔板上，分化培养基为：α-MEM，2％FBS，地塞米松(1μM)(Sigma-Aldrich)，β-磷酸甘油(10nM)(Sigma-Aldrich)，抗坏血酸(50μg/mL)(Sigma-Aldrich)。在最初的四天内培养基中添加有TGF-β1(5ng/mL)(Peprotech)，BMP-2(10ng/mL)(R&D systems,马德里，西班牙)和BMP-4(10ng/mL)(R&D systems)，随后添加成分被DKK-1(0.15μg/mL)替代(Peprotech)。在分化流程(第30天)结束时用免疫荧光细胞术对细胞进行分析。如图11A-C所示，CSCs在特定的分化培养基中培养后表达了对应于平滑肌，内皮细胞和心肌细胞的分子标记。

CSCs在适合的培养基中培养后还能够分化为脂肪细胞与骨细胞。脂肪细胞分化通过油红O染色进行分析，骨细胞分化通过茜素红染色来确证。

H.CSCs的基因组稳定性

通过进行比较基因组杂交分析来测定分离的人CSCs基因组稳定性并评测是否有染色体改变，例如倍增或缺失，在体外扩增后出现在CSCs中。用人类基因组CGH44k微阵列(Agilent Technologies,圣克拉拉,加利福尼亚，美国)进行了寡核苷酸阵列-比较基因组杂分析。总共1μg来自所述细胞的基因组DNA和一种作为参照的健康的基因组DNA(Promega，麦迪逊，威斯康辛，美国)通过随机引物被差异标记上Cy5-dCTP和Cy3-dUTP。所述杂交按生产商的流程进行。拷贝数改变的区域通过AGW提供的ADM-2(设置为6)统计学进行检测，其最少有五条连续的探针，因此允许检测任何至少200kb的异常区域。图12显示针对一人类女性基因组进行的比较基因组杂交分析。未观察到染色体改变，因此表明CSCs的基因组稳定。

实施例4体内CSCs分析

A.CSCs在冠状血管内施用后不诱导强体液应答

CSCs在冠状血管内注射后的免疫原性根据图13A所示的时间表在猪体内进行评测。100×10⁶个同种异体的猪CSC细胞经由冠状血管内注射施用到免疫活性的梗塞的大白猪体内，针对注射细胞的同种异体抗体，IgG和IgM的存在在细胞施用前和细胞施用后15天和30天进行分析。施药后30天，50×10⁶个同样的CSCs通过静脉内进行注射，对血清中的特异性的同种异体抗体在第二次注射后第3，7，15和30天进行检测。取自血样的血清与所述注射的细胞一起孵育。针对所述注射的细胞具有同种异体反应性的抗体的存在用抗IgG或抗IgM标记的抗体通过流式细胞术进行分析。

特异的免疫活性的免疫球蛋白(IgG和IgM)的存在在不同的血样中进行分析。在最初的30天内找不到针对所述注射的细胞具有特异的免疫活性的IgG。与此相反，在第二次注射后我们在第7,15和30天观察到CSC特异性IgM和IgG的存在，如图13B所示。这些结果显示，尽管CSCs在施用后不触发强体液应答，它们仍被识别并很可能被产生免疫记忆的免疫系统消除，免疫记忆在第二次注射后引发了更强和更快的应答。

B.CSCs在体内施用后滞留

CSCs在心脏内施用后滞留通过示踪试验进行测定。人CSC用GFP标记并注射到7天前即已形成梗塞的免疫缺陷大鼠的心肌中。所述动物注射24小时后处死，通过组织学分析来分析GFP阳性细胞的存在。荧光标记的心肌球与所述细胞一起共注射以能够鉴定到施用的位点。如图14所示，这些示踪试验表明注射后至少24小时CSCs仍然在梗塞区域。

C.CSCs促进心肌再生

CSCs对梗塞的大鼠心脏的效果由超声心动图和组织学分析来进行评测。体重200到250g的免疫缺陷裸鼠(HIH-Foxn1rnu，查尔斯河实验室公司，威明顿，马萨诸塞)通过永久性连接冠状动脉前降支形成梗塞。一旦受影响的组织颜色变暗，即用Hamilton注射器在梗塞的边界区域的2个位点进行心脏内移植(PBS或5×10⁶个来自不同供体的CSC)。在细胞注射后15天，1个和2个月后麻醉动物并通过超声心动图分析心脏的功能。

移植后两个月，处死动物，将心脏取出，以磷酸缓冲盐水洗涤，4％多聚甲醛固定24小时并贮存于70％乙醇中直到进一步处理。在包埋前，将心房去除并将心脏切成三块大小类似的部分：顶部区域(A区)，中间区域(B区)即进行连接的地方以及靠近瓣膜的区域(C区)。每个区域都用石蜡包埋，并且三张来自所选心脏(如下所示)的厚5mm，间隔75mm的切片用Masson氏三色染色技术染色。进行组织学分析并计算与整个左心室直径相关的伤疤大小。在一代表性的梗塞区域计算出了与壁的总厚度相关的肌纤维百分比含量。使用CellAOlympus软件获取组织形态学的测量结果。用Student‘s t检验分析获取自超声心动图或组织学分析的数据的显著性。

如图15A所示，与对照动物相比，在注射了CSCs的动物中观察到了更高的心脏功能。在所述细胞处理组中，就面积改变分数(FAC)而言心脏表现的改善在移植后1个月被观察到，并且在两个月时还在维持。更加特定地，移植后2个月，盐水处理组的FAC为33.76±1.69％，而CSC处理组的FAC为42.53±8.29％。前壁增厚(AWT)在移植了CSCs的动物中显著地更高(盐水处理组18.93±4.18％，CSC处理组27.37±5.14％)，表明CSCs对于促进新生肌肉的形成与预防重构比盐水更加有效。

通过Masson氏三色染色的组织学分析也显示与对照动物相比，细胞处理的大鼠在受影响区域的伤疤尺寸显著下降并且心肌细胞数量增加。这些实验用获取自四个不同的供体的CSCs完成以确证分离和扩增过程的可重复性并证实不同批次之间的生物等同性。

D.冠状血管内注射后CSCs不引起心脏毒性

为了检测施用CSCs的安全性，在注射人CSC到健康的猪的体内后对心脏酶的存在进行了监测。以从冠状血管内注射进入猪的体内的方式施用溶液(安慰剂)或剂量为5×10⁶个人CSC。细胞以2mL/min的速度进行注射，并对心脏肌钙蛋白I(cTnI)，肌红蛋白和肌酸激酶-MB在细胞施用前和施用后24小时进行定量，并未观察到毒性。针对cTnI的结果如图16所示。

E.CSCs不引起肿瘤发生

在免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)中完成了两个不同的实验以检测CSCs的致瘤潜力。CSCs通过静脉内注射(3×10⁶个细胞)或皮下注射(10×10⁶个细胞)进入免疫缺陷小鼠，并在8个月或4个月内分别分析肿瘤的形成。所有动物每天进行一次常规的临床观察(星期一至星期五)，观察除了基于每天外，为了看到宏观可见的针对检验样品施用的逆反应，还在检验样品施用后立即进行观察。在实验期结尾，对每只动物进行全面的尸检，且腹腔，胸腔，颅腔及其相关器官在原位进行检查。此外，在实验期结尾，对每只动物的部分器官进行组织学评估。这些研究的结果(临床观察，身体与器官重量，尸检观察与组织学评估)表明测试的剂量下的CSCs在SCID小鼠体内在试验的时间段中缺少肿瘤形成性。

F.本发明所述成体心脏干细胞作为治疗产品用于人类的正当理由

本发明所述成体心脏干细胞的心脏保护和免疫调控能力及其心肌再生潜力使其成为治疗不同疾病，如缺血性心脏病，自身免疫疾病，伤口愈合过程或再生治疗的合适的治疗工具。特别地，以下由本发明所述CSCs所介导的现象使其成为治疗细胞死亡与炎症过程相关疾病的有用的治疗工具：

-由这些细胞产物(见图10)所介导的心脏保护信号将限制创伤之后细胞的损失。

-所述成体心脏干细胞的免疫调节能力将调节T细胞和巨噬细胞介导的炎症过程。尽管创伤后启始阶段的免疫应答对去除细胞碎片和启始伤疤形成是关键的，延长的炎症过程将会阻止伤疤消除和组织再生。

-最后，大鼠模型的体内实验表明所述成体心脏干细胞具有诱导新生组织形成、减少伤疤的尺寸和增加新生肌纤维存在的能力。这将通过所述成体心脏干细胞激活内源干细胞的能力被介导。

因此，所有这些由本发明成体心脏干细胞介导的活性是它们称为治疗与细胞死亡和炎症过程有关的疾病的有用的治疗试剂。此外，这些细胞在需要形成新生组织的疾病中可被用于促进组织再生。在这个意义上，人缺血性心脏病可使用这些细胞进行治疗。所述成体心脏干细胞在该疾病的急性阶段将会限制细胞的丧失，调节免疫应答以允许更快的再生，最后还将激活内源组织的常驻细胞促进新生组织形成。

此外，这些细胞可在疾病发展的不同的时间点施用。细胞可在疾病的急性阶段施用以预防细胞损失，可在亚急性或慢性阶段施用以调节免疫应答并激活内源的再生。所述CSCs的低免疫原性谱及其免疫调节能力将延长其在体内的存活并因此增加其治疗潜力。

本发明所述成体心脏干细胞可通过不同途径予以施用，如冠状血管内，心肌内，静脉内，真皮内等。与MSC相比CSCs减小的尺寸使这些细胞特别适合于冠状血管内施用。可通过冠状血管内投送超过30×10⁶个细胞而不会观察到cTnI升高。

实施例5在罹患急性心肌梗塞和左心室功能异常的病人体内从冠状血管内注入同种异体的人CSCs的临床流程示例

Claims (35)

1.一种分离的多能成体心脏干细胞，其中所述多能成体心脏干细胞表达以下分子标记：

(a)SOX17，GATA4，IL-1β，CD31，CD49c，HHEX，KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，HAND2，I型MHC，IL-8，IL-6，CXCL1，G-CSF和sICAM1；

其中所述多能成体心脏干细胞不表达以下分子标记：

(b)Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4蛋白，Nkx2.5，CD133，CD45，CD34，CD11b，CD40，CD80和CD86；

其中所述多能成体心脏干细胞至少能够分化为以下所有的细胞类型：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和平滑肌细胞。

2.如权利要求1所述分离的多能成体心脏干细胞，其中所述多能成体心脏干细胞分离自心肌组织。

3.如权利要求1中所述分离的多能成体心脏干细胞，其中所述多能成体心脏干细胞具有10μm-15μm的直径。

4.如权利要求1中所述分离的多能成体心脏干细胞，其中所述多能成体心脏干细胞：

(a)能在悬浮培养时形成球；

(b)能诱导单核细胞募集；

(c)能调节T淋巴细胞应答；

(d)能分泌抗凋亡因子；和/或

(e)能形成克隆。

5.一种纯的多能成体心脏干细胞群，其由如权利要求1～4任一项中所述的多能成体心脏干细胞组成。

6.如权利要求5中所述纯的多能成体心脏干细胞群，其中所述多能成体心脏干细胞群的所述多能成体心脏干细胞具有10μm-15μm的平均直径。

7.一种从心肌组织中制备一种纯的多能成体心脏干细胞群的方法，包括以下步骤：

(a)分离多能成体心脏干细胞群，所述多能成体心脏干细胞群由包含来自心肌组织的细胞悬液制备得到；

(b)扩增所述多能成体心脏干细胞群；以及

(c)筛选至少表达SOX17，GATA4，IL-1β，CD31，CD49c，HHEX，KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，HAND2，I型MHC，IL-8，IL-6，CXCL1，G-CSF和sICAM1；并且不表达以下分子标记：Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4，CD133，Nkx2.5，CD45，CD34，CD11b，CD40，CD80和CD86；并且至少能够分化为以下所有的细胞类型：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和平滑肌细胞的细胞。

8.一种从心肌组织中制备一种纯的多能成体心脏干细胞群的方法，包括以下步骤：

(a)分离多能成体心脏干细胞群，所述多能成体心脏干细胞群由包含来自心肌组织的细胞悬液制备得到；

(b)扩增所述多能成体心脏干细胞群；

(c)制备包括多种细胞系的工作细胞库(WCB)；

(d)从所述工作细胞库中筛选至少表达SOX17，GATA4，CD31，IL-1β，CD49c，HHEX，KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，HAND2，I型MHC，IL-8，IL-6，CXCL1，G-CSF和sICAM1；并且不表达以下分子标记：Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4，CD133，Nkx2.5，CD45，CD34，CD11b，CD40，CD80和CD86；并且能够分化为以下所有细胞类型：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和平滑肌细胞的细胞系；

(e)扩增所述筛选的细胞系；以及

(f)在最终的纯的多能成体心脏干细胞群中确证至少表达SOX17，GATA4，CD31，IL-1β，CD49c，HHEX，KDR，HEY2，WT1，CCL2，IL-1α，PDGF-β，CD166，CD105，CD90，CD44，HAND2，I型MHC，IL-8，IL-6，CXCL1，G-CSF和sICAM1；确证以下分子标记的表达缺失：Oct4，Nanog，c-kit，端粒酶逆转录酶，CXCR4，CD133，Nkx2.5，CD45，CD34，CD11b，CD40，CD80和CD86；并确证分化为以下所有的细胞类型的能力：脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞和平滑肌细胞。

9.一种包括如权利要求1～4任一项中所定义的多能成体心脏干细胞的混合细胞群，其中所述混合细胞群包括与如权利要求1～4任一项中所定义的多能成体心脏干细胞不同的细胞。

10.如权利要求9所述混合细胞群，其中所述混合细胞群包括来自脂肪组织或骨髓的间充质干细胞，心外膜细胞，内皮细胞，周细胞和成纤维细胞。

11.一种药物组合物，包括：

(a)如权利要求1-4中任一项所述分离的多能成体心脏干细胞，

(b)如权利要求5或6中所述纯的多能成体心脏干细胞群；或

(c)如权利要求9或10所述混合细胞群；

以及一种药学上可接受的载体。

12.如权利要求11所述药物组合物，其中所述组合物包括1×10⁶至50×10⁶个所述多能成体心脏干细胞。

13.如权利要求12所述药物组合物，其中所述组合物包括25×10⁶至45×10⁶个所述多能成体心脏干细胞。

14.如权利要求13所述药物组合物，其中所述组合物包括35×10⁶至40×10⁶个所述多能成体心脏干细胞。

15.如权利要求14所述药物组合物，其中所述组合物包括38×10⁶个所述多能成体心脏干细胞。

16.如权利要求1～4任一项中所述分离的多能成体心脏干细胞用于制备治疗下述疾病的药物中的用途：

(a)心血管疾病；或

(b)缺血性损伤。

17.如权利要求16所述用途，其中：

(a)所述心血管疾病为心肌病；或

(b)所述缺血性损伤为严重肢体缺血。

18.如权利要求16所述用途，其中所述心血管疾病为慢性缺血性心肌病。

19.如权利要求16所述用途，其中所述心血管疾病为急性心肌梗塞。

20.如权利要求16所述用途，其中所述心血管疾病为慢性心力衰竭。

21.如权利要求1～4任一项中所述分离的多能成体心脏干细胞在制备治疗罹患心血管疾病或缺血性损伤的个体的药物中的用途，包括向所述个体施用所述多能成体心脏干细胞。

22.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞是同种异体的。

23.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞按以下方式施用：

(a)静脉内，动脉内，冠状血管内或心肌内；和/或

(b)按1×10⁶至50×10⁶个所述多能成体心脏干细胞的剂量。

24.如权利要求23所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞按25×10⁶至45×10⁶个所述多能成体心脏干细胞的剂量进行施用。

25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞按35×10⁶至40×10⁶个所述多能成体心脏干细胞的剂量进行施用。

26.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞按38×10⁶个所述多能成体心脏干细胞的剂量进行施用。

27.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞通过以下机制中的一种或多种诱导心脏组织修复：

(a)单核细胞的募集；

(b)免疫调节；

(c)血管发生的激活；

(d)促进心肌再生和/或

(e)诱导内源心肌细胞的再生。

28.如权利要求1～4任一项中所述分离的多能成体心脏干细胞用于制备：

(a)治疗自身免疫疾病，炎症过程和促进伤口愈合；或

(b)预防同种异体的器官移植排斥的药物中的用途。

29.如权利要求1～4任一项中所述分离的多能成体心脏干细胞用于制备治疗慢性溃疡的药物中的用途。

30.如权利要求1～4任一项中所述分离的多能成体心脏干细胞用于制备治疗心脏组织再生的药物中的用途。

31.如权利要求30所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞附着于生物相容性内置物上。

32.如权利要求1～4任一项中所述分离的多能成体心脏干细胞用于制备治疗急性心肌梗塞的药物中的用途，其中所述多能成体心脏干细胞通过冠状血管内的途径施用；并且所述多能成体心脏干细胞的剂量为按1×10⁶至50×10⁶个所述多能成体心脏干细胞的剂量。

33.如权利要求32所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞的剂量为按25×10⁶至45×10⁶个所述多能成体心脏干细胞的剂量。

34.如权利要求33所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞的剂量为按35×10⁶至40×10⁶个所述多能成体心脏干细胞的剂量。

35.如权利要求34所述的用途，其特征在于，所述多能成体心脏干细胞的剂量为按38×10⁶个所述多能成体心脏干细胞的剂量。

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