CN105462958A - 双链dna的人工合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体的说是双链DNA人工合成方法，利用半导体芯片技术，使用flank序列进行第一轮PCR扩增，使半导体芯片所合成的核苷酸大量增加，配合Type？IIs型限制性内切酶和T4？DNA连接酶边切边连，达到合成双链DNA的目的。本发明可以一次性合成高达上百万条引物，合成成本低。本方法特别适用于大规模高通量的合成双链DNA的研究包括但不限于代谢通路，生物途径，蛋白质定向进化以及基因组合成与组装等。

Description

双链DNA的人工合成方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是属于DNA合成技术领域，更为具体的说是双链DNA的人工合成方法。

背景技术

合成生物学是二十一世纪新兴的一门交叉学科，合成生物学运用工程学的研究思路去设计、改造基因，生物元件，生物途径，甚至是整个基因组，在生物，医药，环保，能源和农业等领域有着广泛的应用前景。

基因合成是合成生物学的主要组成部分，是合成生物学的基础和骨架。基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术，不同于寡核苷酸合成单链DNA，基因合成的是双链DNA分子。

基因合成是获取目的基因的手段之一，相对于从已有生物中获取基因来说，基因合成无需模板，不受基因来源限制，可以合成自然界中极难获得或者不存在的基因。基因合成所需的合成周期短，合成序列100％正确，具有更大的灵活性，同时可以对基因的酶切位点和基因序列进行修改，方便后续实验，通过人工合成的基因可以进行密码子优化，使其在各种生物表达体系中都能得到良好表达。

早期的基因合成通过连接酶介导法和FokI法等，将寡核苷酸组装成具有功能的基因。然而，早期的合成技术通常只能合成小于1kb的DNA片段。20世纪90年代，通过连接酶链式反应法和PCR法的结合使用，科学家们合成了2.1kb的恶性疟原虫基因pfsub-1.进入21世纪以后，以PCR为基础的基因合成方法得到了进一步的演变与发展，先后诞生了连接酶拼接法、重叠延伸PCR法、以PCR为基础的两步DNA合成方法、BioBrick^TM法，BglBrick法等技术。这些技术中存在这样或者那样的问题。譬如仍然无法有效解决大片段，元件库，基因组等的合成，无法实现无痕组装，特别的例如BioBrick^TM法和BglBrick法，同时还受酶切位点序列限制。

现有技术中Gibson等温组装法(Gibsonisothermalassembly)是目前使用的最为广泛的基因合成方法，该方法既可以组装较小的基因，也可以组装较大的基因片段，因此应用广泛，但是该方法在合成高GC含量，高度重复的正向或者反向重复序列时，具有明显的局限性。

更重要的是在组装大片段，生物途径合成，或者组装基因组时，因为对引物的需求量巨大，传统的引物合成方法因为无法一次性高通量合成组装基因组所需要的大量引物，耗时耗力，而且传统的化学合成方法合成引物成本高昂。

进入21世纪以来，随着生命科学的发展和下一代测序技术的进步，包括人类，水稻等越来越多的物种的基因组已经测序完成，利用已经得到的基因组序列研究具有重要意义的生物途径，生物元件库等，成为一项重要的研究课题。研究者对基因合成的需求也因此越来越大，传统的基因合成和组装方法面临越来越大的困难和挑战，难以满足市场和科研对基因合成的需求。为了提高基因合成通量并降低成本，有必要开发下一代的DNA合成和组装技术。

生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，目前已经商业化的有各种动物的表达谱芯片，捕获芯片，miRNA芯片等。生物芯片具有高通量，微型化和自动化等特点，生物芯片的出现为大规模高通量低成本的新一代DNA合成和组装提供了可能。

发明内容

本发明公开了一种新的双链DNA的人工合成方法，包括以下步骤，

1)将目标DNA划分成多个长度为200-1000bp的核苷酸片段；

2)在核苷酸序列的5’端添加前一核苷酸序列3’端的末端四个碱基，首条核苷酸序列5’端不添加，添加后的核苷酸序列长度为30-90nt；

3)在核苷酸序列的两端分别加上TypeⅡs限制性内切酶的酶切识别序列，然后在这一序列的两端再添加长度为20nt的flank序列；

4)将步骤3)中的核苷酸序列利用半导体芯片，采用电化学方法，以flank序列为引物进行PCR扩增，获得高通量合成的核苷酸序列；

5)采用TypeIIs限制性内切酶BsaI对PCR扩增产物进行酶切，与此同时，利用T₄DNA连接酶将各个片段连接起来，获得双链DNA，即得到目标DNA分子。进一步地，我们优选步骤4)中的PCR扩增中

反应体系为：

反应条件为：

进一步地，我们还公开了步骤5)中的反应体系为：

反应条件为：

作为优选，我们公开TypeⅡs限制性内切酶包括但不限于FokI、AlwI、BsaI、BbsI或BsmbI。

本方法利用半导体芯片技术，使用flank序列进行第一轮PCR扩增，使半导体芯片所合成的核苷酸大量增加，配合TypeIIs型限制性内切酶和T₄DNA连接酶边切边连，达到合成双链DNA的目的。

本发明所公开的方法具有如下特点：

1.合成成本低，通过芯片技术合成的基因比传统的以PCR为基础的基因合成成本低90％以上，单个碱基的价格可以低到0.01元/nt；

2.高通量，DNA芯片技术具有高通量的特点，可以一次性同时合成上百万条引物，每条引物长度可达200nt,用于后续的实验。

具体实施方式

如无特别说明，本文中的所有技术和科学术语均按本发明所涉及的行业普通技术人员普遍理解的正常含义。

文中的“序列”代表着聚合物中单体的排列顺序，比如核苷酸在多核甘酸序列中的排列顺序，此处所说的“核苷酸序列”“核酸”或者“多核苷酸”指的是单链或者双链中的脱氧核糖核苷酸，核酸序列是由自然的核苷酸A，T，C，G，U或者其他合成的自然碱基的类似物组成，本发明中，腺嘌呤缩写为A，鸟嘌呤缩写为G，胞嘧啶缩写为C，胸腺嘧啶缩写为T。多核酸序列可以是单链或者双链，若无特别说明，核苷酸也包括了较长的核苷酸或较短的核苷酸，比如寡核苷酸。

文中“bp”为碱基对，“nt”为核苷酸。

文中采用传统的标记方法来描述多核苷酸序列，单链的左端为5’端，双链的左端为正链5’端。

实施例

在本实施例中我们欲合成一条人工设计的DNA序列：

GGATCCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAAGACTTGGACTGGCCTCCAGGCAGCCCACAAGAGCCTCTGTGCCTGGTGGCACTGGGCGGGGACAGCAATGGCAGCAGCTCCCCCCTGCGGGTGGTGGGGGCTCTAAGCGCCTATGAGCAGGCCTTCCTGGGGGCCGTGCAGAGGGCCCGCTGGGGCCCCCGAGACCTGGCCACCTTCGGGGTCTGCAACACCGGTGACAGGCAGGCTGCCTTGCCCTCTCTACGGCGGCTGGGGGCCTGGCTGCGGGACCCTGGGGGGCAGCGCCTGGTGGTCCTACACCTGGAGGAAGTGACCTGGGAGCCAACACCCTCGCTGAGGTTCCAGGAGCCCCCGCCTGGAGGAGCTGGCCCCCCACTCGAG

首先，我们需要将上述的这条目标DNA序列分成长度为200-1000bp的多个片段，在本实施例中我们将上述的这条目标DNA序列分成了七个片段，然后，我们分别对每条核苷酸片段进行设计，并形成引物。设计时，从第二条核苷酸序

列开始，我们要在其前面也就是5’端添加前一条核苷酸尾端也就是3’端的最后4

个碱基，从而形成首尾4个碱基相同的效果。

设计形成的引物如下：

1	GGATCCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAAGACTTGGACTG
		2	ACTGGCCTCCAGGCAGCCCACAAGAGCCTCTGTGCCTGGTGGCACTGGGCGGGGACAGCAATGGCAG
3	GCAGCAGCTCCCCCCTGCGGGTGGTGGGGGCTCTAAGCGCCTATGAGCAGGCCTTCCTGGGGGCCG
		4	GCCGTGCAGAGGGCCCGCTGGGGCCCCCGAGACCTGGCCACCTTCGGGGTCTGCAACACCGGTG
5	GGTGACAGGCAGGCTGCCTTGCCCTCTCTACGGCGGCTGGGGGCCTGGCTGCGGGACCCTGGGGGGCAGCG
		6	AGCGCCTGGTGGTCCTACACCTGGAGGAAGTGACCTGGGAGCCAA
7	CCAACACCCTCGCTGAGGTTCCAGGAGCCCCCGCCTGGAGGAGCTGGCCCCCCACTCGAG

然后，我们在所设计的引物两端分别加上20nt的flank序列,和酶切识别位点

序列,本实例以TypeIIs限制性内切酶BsaI为例，酶切的正向识别序列为ggtctc,

酶切的反向识别序列为gagacc,5’端的flank序列20nt,序列为

TCGACACCACTATACACCAC；3’端的flank序列20nt,序列为

GGCCCGTGAGAGTATAAAGA.合成总长度101-127nt的核苷酸序列

1.TCGACACCACTATACACCACggtctcaGGATCCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAAGACTTGGagagaccGGCCCGTGAGAGTATAAAGAA

2.TCGACACCACTATACACCACggtctcaGCCTCCAGGCAGCCCACAAGAGCCTCTGTGCCTGGTGGCACTGGGCGGGGACAGCAATGagagaccGGCCCGTGAGAGTATAAAGA

3.TCGACACCACTATACACCACggtctcaCAGCTCCCCCCTGCGGGTGGTGGGGGCTCTAAGCGCCTATGAGCAGGCCTTCCTGGGGagagaccGGCCCGTGAGAGTATAAAGA

4.TCGACACCACTATACACCACggtctcaTGCAGAGGGCCCGCTGGGGCCCCCGAGACCTGGCCACCTTCGGGGTCTGCAACACCagagaccGGCCCGTGAGAGTATAAAGA

5.TCGACACCACTATACACCACggtctcaACAGGCAGGCTGCCTTGCCCTCTCTACGGCGGCTGGGGGCCTGGCTGCGGGACCCTGGGGGGCagagaccGGCCCGTGAGAGTATAAAGA

6.TCGACACCACTATACACCACggtctcaCTGGTGGTCCTACACCTGGAGGAAGTGACCTGGGAGagagaccGGCCCGTGAGAGTATAAAGA

7.TCGACACCACTATACACCACggtctcaCACCCTCGCTGAGGTTCCAGGAGCCCCCGCCTGGAGGAGCTGGCCCCCCACTCGAGagagaccGGCCCGTGAGAGTATAAAGA

将最终添加有flank序列以及限制性内切酶的核苷酸序列利用半导体芯片，采用电化学方法进行高通量合成。然后用flank序列TCGACACCACTATACACCAC和TTCTTTATACTCTCACGGGCC作引物进行PCR扩增,获得扩增后的PCR产物，最后，我们用TypeIIs限制性内切酶BsaI对PCR扩增产物进行酶切，与此同时，利用T₄DNA连接酶将各个片段连接起来，边切边连，获得双链DNA，即得到目标DNA分子。

SEQUENCELISTING

<110>苏州泓迅生物科技有限公司

<120>双链DNA人工合成方法

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<170>PatentInversion3.3

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<213>人工序列

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ggatccagagcagaggagccagctgtgggcaccagtggcctcatcttccgagaagacttg60

gactggcctccaggcagcccacaagagcctctgtgcctggtggcactgggcggggacagc120

aatggcagcagctcccccctgcgggtggtgggggctctaagcgcctatgagcaggccttc180

ctgggggccgtgcagagggcccgctggggcccccgagacctggccaccttcggggtctgc240

aacaccggtgacaggcaggctgccttgccctctctacggcggctgggggcctggctgcgg300

gaccctggggggcagcgcctggtggtcctacacctggaggaagtgacctgggagccaaca360

ccctcgctgaggttccaggagcccccgcctggaggagctggccccccactcgag414

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Claims (4)

1.双链DNA的人工合成方法，其特征是，包括如下步骤：

1)将目标DNA划分成多个长度为200-1000bp的核苷酸片段；

2)在核苷酸序列的5’端添加前一核苷酸序列3’端的末端四个碱基，首条核苷酸序列5’端不添加，添加后的核苷酸序列长度为30-90nt；

3)在核苷酸序列的两端分别加上TypeⅡs限制性内切酶的酶切识别序列，然后在这一序列的两端再添加长度为20nt的flank序列；

4)将步骤3)中的核苷酸序列利用半导体芯片，采用电化学方法，以flank序列为引物进行PCR扩增，获得高通量合成的核苷酸序列；

5)采用TypeIIs限制性内切酶BsaI对PCR扩增产物进行酶切，与此同时，利用T₄DNA连接酶将各个片段连接起来，获得双链DNA，即得到目标DNA分子。

2.根据权利要求1所述的双链DNA的人工合成方法，其特征是，步骤4)中的PCR扩增反应体系为：

反应条件为：

。

3.根据权利要求1所述的双链DNA的人工合成方法，其特征是，步骤5)中的反应体系为：

反应条件为：

。

4.根据权利要求1所述的双链DNA的人工合成方法，其特征是，TypeⅡs限制性内切酶为FokI、AlwI、BsaI、BbsI或BsmbI。