CN105461794A - Snf5在抑制肝癌方面的应用 - Google Patents

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林琳
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孙戈
孙宁
丛日娇
曾凯
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Abstract

本发明提供了SNF5在抑制肝癌方面的应用，包括以下方面的应用：SNF5作为靶点在早期发现和治疗肝癌上的应用；SNF5能够抑制肝癌细胞的生长增殖和迁移功能；SNF5抑制CCND1与TGFβ1的表达、促进P21的表达；SNF5可抑制肝癌细胞HCCLM3与Hep3B的迁移和侵袭；SNF5能够提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。本发明的有益效果是为治疗肝癌提供了新思路、新靶点。

Description

SNF5在抑制肝癌方面的应用
技术领域
本发明属于生物基因技术领域，尤其是涉及SNF5在抑制肝癌方面的应用。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范围内的一种常见肿瘤也是预后较差的一种恶性肿瘤，五年生存率仅在10％左右，每年在全世界造成25-100万人死亡。HCC的发病具有显著的性别差异，男女比例在6-8∶1，提示性激素受体在其发生发展过程中发挥作用。
转换/蔗糖不发酵(Switch/sucrosenonfermentable，SWI/SNF)复合物是被广泛研究的一类染色质重塑复合物，其首先在用遗传学方法筛选酵母中调节交配型转换(matingtypeswitching，SWI)和影响蔗糖酵解(sucrosenon-fermenting，SNF)的基因时被发现。该复合物进化高度保守，在真核生物中广泛表达，主要由SWI及SNF基因编码的蛋白质组成。哺乳动物细胞中，SWI/SNF复合物含有10-15个亚基，其中BRG1(Brahma-relatedgene1)或hBRM(humanBrahma)是ATP酶亚基。SNF5是SWI/SNF复合物中另一高度保守的亚基，存在于所有的SWI/SNF复合物中。研究表明，SWI/SNF复合物的成员在决定细胞增殖和细胞命运方面起作用，并在基因表达的转录调控中扮演主要角色。SWI/SNF复合物并非特异性调节某一信号通路，它在多个重要的并且无关联的信号通路中均充当着基本的组成部分。
SNF5基因在染色体上定位于22q11，在儿童横纹肌样瘤(rhabdoidtumors，RTs)患者中常存在这个区域的染色质重排。SNF5肿瘤抑制作用的最有力证据也来自于RTs的相关研究。该病患者几乎全部存在SNF5等位基因之一的缺失及另一等位基因的突变或甲基化失活。SNF5合性缺失的小鼠发生组织学上类似人RTs的肿瘤，且100％ARAP2双等位基因条件性失活的小鼠在出生后10周内迅速地出现淋巴瘤或RTs。部分慢性髓细胞性白血病病人在患病过程中出现SNF5的杂合性缺失，提示其在该肿瘤的发病过程中发挥作用。
SNF5含有2个与蛋白-蛋白结合有关的Rpt结构域，并参与SWI/SNF复合物靶向目标启动子的过程，但其具体作用机制现在并不十分明确。在一些SNF5表达缺失的RT细胞系中，SNF5的重新表达引起细胞周期抑制因子p21及p16水平升高，cyclinD1表达下降，从而使细胞周期阻滞在G1期。进一步研究发现，SNF5通过介导SWI/SNF复合物在转录起始位点处的结合、招募RNA聚合酶II(RNApolymeraseII，RNAPII)及调节H3K4和H3K36的甲基化修饰，促进抑癌因子p21及具促凋亡作用的NOXA表达。SNF5能够结合于cyclinD1的启动子上，并招募组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，抑制cyclinD1的表达。在正常细胞及RT细胞中，重新表达的SNF5结合于AuroraKinaseA(AuroraA)的启动子上并显著下调其表达，抑制细胞生长。SNF5的缺失引起Wnt/β-catenin通路的活化，并引起该通路下游靶基因的活化。RT中，SNF5能与Hedgehog(Hh)通路的主要效应因子GLI1(glioma-associatedoncogenefamilyzincfinger-1)相互作用，并结合于GLI1启动子上抑制GLI1表达；而SNF5缺失能够引起的GLI1表达升高，促进致癌的Hh通路异常激活。
综上所述，SNF5参与多个信号通路的调节，其在多种肿瘤中的生物学功能和分子机制对于进一步研究肿瘤治疗中潜能药物靶点具有重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供了SNF5在抑制肝癌方面的应用，即SNF5可以抑制肝癌细胞的生长、侵袭和迁移，并在临床肝癌组织中表达减少，在肝癌的发生发展中起抑制作用。
本发明的技术方案是：
SNF5在抑制肝癌方面的应用。
优选的，SNF5作为靶点在早期发现和治疗肝癌上的应用。
优选的，SNF5能够抑制肝癌细胞的生长增殖和转移功能。
优选的，SNF5抑制CCND1与TGFβ1的表达、促进P21的表达。
优选的，SNF5可抑制肝癌细胞HCCLM3与Hep3B的迁移和侵袭。
优选的，SNF5能够提高肝癌细胞HCCLM3与Hep3B对索拉非尼的敏感性。
本发明具有的优点和积极效果是：本发明通过细胞功能实验，发现SNF5能够抑制肝癌细胞的生长和转移功能，并且在肝癌临床样本进行了SNF5表达水平检测，发现SNF5在临床肝癌组织中表达减少。同时我们发现，SNF5能够提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。本发明为治疗肝癌提供了新思路、新靶点。
附图说明
图1是SNF5表达质粒。
图2是基因沉默SNF5对HCCLM3与Hep3B细胞中P21，CCND1与TGFβ1基因蛋白表达的影响(A-HCCLM3，B-Hep3B)。
图3是基因沉默SNF5对HCCLM3与Hep3B细胞增殖的影响(A-HCCLM3，B-Hep3B)。
图4是基因沉默SNF5对HCCLM3与Hep3B细胞侵袭迁移的影响A-HCCLM3，B-Hep3B)。
图5是基因沉默SNF5对HCCLM3与Hep3B细胞索拉非尼敏感性的影响(A-HCCLM3，B-Hep3B)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明。
如图1所示，构建SNF5表达质粒。
S1、利用针对SNF5的shRNA慢病毒载体感染肝癌细胞系HCCLM3与Hep3B，建立稳定沉默SNF5的肝癌细胞系及对照细胞系。
实验方法：以有效沉默SNF5的shRNA包装慢病毒，感染HCCLM3和Hep3B细胞，2μg/ml嘌呤霉素筛选阳性细胞。
结果：成功获得稳定沉默SNF5的肝癌细胞系及对照细胞系。
S2、通过Westernblot检测SNF5对一系列肝癌重要基因的影响，结果表明SNF5抑制了CCND1与TGFβ1的表达而促进了P21的表达。并且RealtimeRT-PCR结果显示，SNF5与TGFβ1在肝癌病例中的表达呈现负相关。
实验方法：1、Westernblot，SNF5稳定敲低和对照细胞以2×105每孔的密度接种于6孔板，37度培养48小时后收细胞提取蛋白进行Westernblot检测。2、RNA提取及反转录：RNA提取试剂RNAisoplus(TAKARA)提取细胞RNA，测浓度，反转录试剂盒PrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime)(TAKARA)反转录为cDNA。RealtimePCR检测：cDNA稀释10倍，用RealtimePCR试剂盒PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)(TAKARA)进行PCR检测，体系参照说明书。
结果：如图2所示，SNF5抑制了CCND1与TGFβ1的表达，而促进了P21的表达。此外，沉默SNF5可促进HCCLM3与Hep3B细胞中TGFβ1基因mRNA的表达，SNF5与TGFβ1在肝癌病例中的表达呈现负相关。
S3、生长曲线实验的结果表明沉默SNF5抑制了细胞的生长增殖能力。
实验方法：SNF5稳定敲低和对照细胞以5×104每孔的密度接种于24孔板，用新鲜含5％CSS的培养基培养，加入10-8M的DHT或相应量的无水乙醇作为对照，分别在第0，1，2，3，4和5天用胰酶消化收集细胞，胎盼兰染色后用血球计数板计数活细胞数。
结果：如图3所示，沉默了SNF5基因的HCCLM3与Hep3B细胞的增殖水平明显高于对照组，提示沉默SNF5促进了肝细胞肝癌的增殖。
S4、Transwell实验表明，沉默SNF5促进了肝癌细胞HCCLM3与Hep3B的迁移和侵袭。
实验方法：SNF5稳定沉默细胞和对照细胞用10-8M的DHT或相应量的无水乙醇处理24hr，用无血清培养基以5×104(无基质胶)或3×105每孔的密度(有基质胶)接种于Transwell上层小室或含1∶6稀释的基质胶的小室中，下层孔板加入含10％CSS(无基质胶)或20％CSS(有基质胶)的培养基，37℃培养16hr(无基质胶)或20hr(有基质胶)。弃掉培养基，未穿过小室的细胞用干净棉签轻轻擦除，下层小室用胎盼兰染色后在倒置显微镜下观察并拍照。
结果：如图4所示，沉默了SNF5基因的HCCLM3与Hep3B细胞的迁移和侵袭能力明显高于对照组，提示沉默SNF5促进了肝细胞肝癌的迁移和侵袭能力。
S5、通过检测肝癌组织及癌旁组织样本切片中SNF5的表达情况发现，SNF5在肝癌中表达低于癌旁组织，并且在部分病例中SNF5呈现缺失。另外，SNF5表达减少的肝癌病例的总体生存期明显低于SNF5正常表达的病例。
S6、MTS实验表明，沉默SNF5后肝癌细胞HCCLM3与Hep3B对抗肝癌药物索拉非尼的敏感性明显下降。
实验方法：以3×103每孔的密度将基因沉默SNF5的HCCLM3与Hep3B细胞接种于96孔板，每组3复孔。37℃，DMEM培养基培养48小时后加入Promega公司的CellTiter96AQueousMTSReagentPowder(G1112)MTS试剂，一小时后在酶标仪上用490波长进行检测。
结果：如图5所示，沉默了SNF5基因的HCCLM3与Hep3B细胞对索拉非尼的敏感性下降。
本发明发现SWI/SNF复合物的核心亚基SNF5在肝癌的发生发展过程中发挥了重要作用。SNF5调控多种癌症相关基因的表达，抑制了肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭，并增加了肝癌细胞对抗癌药物索拉非尼的敏感性。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (6)

1.SNF5在抑制肝癌方面的应用。
2.根据权利要求1所述的SNF5在抑制肝癌方面的应用，其特征在于：SNF5作为靶点在早期发现和治疗肝癌上的应用。
3.根据权利要求1所述的SNF5在抑制肝癌方面的应用，其特征在于：SNF5能够抑制肝癌细胞的生长增殖和转移功能。
4.根据权利要求1所述的SNF5在抑制肝癌方面的应用，其特征在于：SNF5抑制CCND1与TGFβ1的表达、促进P21的表达。
5.根据权利要求1所述的SNF5在抑制肝癌方面的应用，其特征在于：SNF5可抑制肝癌细胞HCCLM3与Hep3B的迁移和侵袭。
6.根据权利要求1所述的SNF5在抑制肝癌方面的应用，其特征在于：SNF5能够提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。
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