CN105456261B - 丙型肝炎病毒抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及丙型肝炎病毒复制的新型抑制剂。本发明涉及用作丙型肝炎病毒抑制剂的化合物，以及化合物基于细胞的系统中抑制HCV病毒复制的应用。

Description

丙型肝炎病毒抑制剂
技术领域
本发明描述新型的丙型肝炎病毒抑制剂及基于细胞系统中抑制HCV病毒复制的应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)是一种严重的威胁人类的病原体，全球现有约2亿人携带丙肝病毒，大约是感染艾滋病毒人数的5倍。持续性HCV感染具有潜在严重并发症，可导致肝硬化、肝癌等晚期肝病。因此，HCV感染已成为全球严重的公共卫生问题。
HCV隶属于黄病毒(Flaviviridea)科，为有包膜的单股正链RNA病毒，直径40～60nm，分为6个主要基因型即1～6型。HCV的基因组由5’非编码区、3’非编码区及位于其间的单一开放阅读框组成，开放阅读框编码约3000多个氨基酸的 NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH多聚蛋白前体。在宿主细胞和病毒蛋白酶作用下，HCV多聚蛋白裂解形成至少10种具有不同功能的病毒蛋白。其中，C-E1-E2 为蛋白结构域，在宿主细胞信号肽酶的作用下分别裂解成核心蛋白C和包膜蛋白E1和E2，其在子代病毒组装中发挥作用；p7是由63个氨基酸残基组成的连接结构蛋白和非结构蛋白的疏水性蛋白，在宿主细胞信号肽酶的作用下释放并形成离子通道，但其在病毒复制和病毒颗粒形成中的作用目前尚不明确；NS2-NS5为非蛋白结构域，NS2为膜内蛋白，它与NS3 的N端一起组成NS2/NS3半胱氨酸蛋白酶，通过构象变化后利用自催化机制切断NS2和 NS3的连接部位而释放出NS2和NS3蛋白，NS3和NS4A形成的复合物NS3/4A为丝氨酸蛋白酶，该酶依次切断NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B连接释放出NS4A、 NS4B、NS5A和NS5B蛋白。一旦这些NS蛋白被切断，它们便组装为膜相关的HCV复制酶复合物。这种复合物不但包含全部的HCV NS蛋白，还含有活化复制态的HCV RNA。功能性HCV复制子体系证实NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B均为复制酶体系的必需组分。通过抑制复制酶体系中一种或多种NS蛋白，都可能干扰甚至完全阻断HCVRNA的复制，理论上这些NS蛋白都可以作为发现HCV特定靶向复制过程中的关键酶。
目前，临床上大多采用聚乙二醇化干扰素α(pegylated interferonα)和核苷类似物利巴韦林(ribavirin)联合用药治疗丙型肝炎，但是只对50％的HCV基因I型病人有效。而且，干扰素和利巴韦林的联合治疗非常昂贵，并有许多严重的副作用，如疲倦发热、血液分析异常溶血性贫血和抑郁症等。因此，根据HCV的生命周期，寻找特异性的、安全有效的直接作用抗病毒药物(Direct Acting Antivirals，简称DAA)是目前丙肝药物研发的迫切需求和重要方向。
最近几年，由于病毒基因组学的发展，以病毒复制周期的关键酶为靶标，已有4个小分子抗丙肝药物被美国FDA批准上市。其中，Boceprevir，Telaprevir和Simeprevir是HCVNS3/4A蛋白酶抑制剂，Sofosbuvir是第一个特异性针对HCV NS5B聚合酶的抑制剂。后者可以单独使用，不需要与干扰素和利巴韦林构成联合用药方案，而且临床疗效好，因此受到抗病毒药物市场的热捧。
ROW25243化合物(2-(benzo[d]oxazol-2-ylthio)-N-(3，5-bis(trifluoromethyl) phenyl)acetamide)来自于InterBioscreen数据库。本发明通过整合现有抗HCV NS5B聚合酶药物和抑制剂数据、计算模型和体外化合物筛选，发现了新结构类型的非核苷HCV抑制剂 ROW25243。ROW25243在低浓度(μM)下能有效抑制HCV病毒在宿主细胞Huh7.5.1的复制，有进一步优化成抗HCV候选药物的潜力。对HCV复制的抑制活性为EC50＝1.61μM，细胞毒性为CC50＞51μM，药物治疗指数TI＝31.68，与NS5B聚合酶亲和力KD＝4.67μM，具有进一步开发的前景。
发明内容
本发明的目的是提供化合物ROW25243化合物分子具有一定的抑制HCV病毒细胞活性作用。
本发明的ROW25243(2-(benzo[d]oxazol-2-ylthio)-N-(3，5-bis(trifluoromethyl) phenyl)acetamide)化合物结构如附图所示：
ROW25243分子式：C17H10F6N2O2S。
ROW25243分子量：420.33。
ROW25243是一个苯并恶唑类化合物，并且含有一个间双三氟基苯结构和酰胺键。
ROW25243化合物作为非核苷类抑制剂，通过与NS5B的变构位点结合，使NS5B蛋白构象改变，从而阻止其复制RNA。
ROW25243化合物显示出一定的抑制HCV复制的活性的作用，对HCV复制的抑制活性为EC50＝1.61μM，细胞毒性为CC50＞51μM，药物治疗指数TI＝31.68，与NS5B聚合酶亲和力KD＝4.67μM。
ROW25243化合物抑制HCV复制的活性的作用是通过自身的分子结构特点决定的。ROW25243结构中酰胺键的羰基与NS5B聚合酶的Thumb II活性口袋内Ser476残基形成氢键作用。间位双三氟甲苯插入到Leu419，Arg422，Met423和Trp528残基构成的一个疏水性口袋构成的疏水性口袋，苯并恶唑环插入到由Leu419，Val485，Ala486，Leu489，Leu497和Met423残基构成的一个较浅的疏水性口袋，从而加强了化合物NSC273937与HCV NS5B聚合酶的亲和力。
附图说明
附图是ROW25243化合物的结构式图。
具体实施方式
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不意于限制本发明的保护范围。
在抗HCV生物活性评估中，由于我们没有直接的HCV NS5B聚合酶检测方法，所以我们运用了HCV 活病 毒感染 宿主 细胞(人肝肿瘤细胞Huh7.5.1)的实验系统，检测了化合物在细胞水平上抑制HCV感染和复制的活性，明确了化合物具有抗HCV活性。
1.试验原理
在HCV病毒感染宿主细胞Huh7.5.1的系统上，将样品进行单浓度，即在5μM浓度下检测其对HCV病毒复制的抑制活性及其细胞毒性，进行抗HCV活性作用的初筛试验。在 HCV病毒感染宿主细胞Huh7.5.1的系统上，将上述样品中对HCV病毒复制的抑制活性＞60％以上的样品，进行浓度梯度上检测其抗HCV活性作用，即20μM，2.5μM，0.31μM， 0.039μM，0.0049μM，0.00061μM，并计算出细胞毒性CC50和HCV抑制活性EC50。MPA 为试验阳性参照物，用于观察试验稳定性.
本试验中，使用2a型HCV病毒株为试验材料，对药物的体外抗病毒活性进行测试。所有测试系统中，在病毒基因序列中插入Luciferase报告基因，便于信号测定。HCV的JFH-1病毒株是2005年由科学家Wakita等人自肝炎病人体内获得，是迄今为止唯一可在体外实现感染和复制的HCV病毒株。
2.试验材料
细胞：肝癌细胞系Huh7.5.1，来自于上海巴斯德所钟劲。
Rluc-JFH1毒株：试验室自建。在JFH1毒株的质粒的NS5A蛋白的399位置插入Rluc基因，同时引入多个点突变，然后按照参考文献将该质粒体外转录成为RNA，电转Huh7.5.1细胞，72稀释后收集上清，称为P1代病毒。再继续感染Huh7.5.1细胞，培养一周后收集上清称为P2代病毒，如此到P3代病毒时收集病毒上清离心分装，取少量病毒感染Huh7.5.1细胞，测试病毒的滴度(Luciferase读值)。其余病毒置于-80℃避光保存。
3.试验方法与评价
3.1药物配制
药物：---(DMSO储存液，10mM)
含有10％FBS的DMEM培养基做8倍浓度梯度稀释。试验药物终浓度为20μM，2.5μM，0.31μM，0.039μM，0.0049μM，0.00061μM。体系中DMSO终浓度为0.5％。
3.2病毒的稀释
用于测试药效的Rluc-JFH1在测定病毒滴度后(Luciferase检测)，按照1∶10的浓度稀释，每孔加入病毒液100μL，使最后的Luciferase检测的数值控制在10000-100000之间。
3.3试验程序
3.3.1活病毒体系检测药效
在96孔板内，将Huh7.5.1按照每孔1.5×104细胞铺板，培养基体积为100μL，37℃细胞培养箱内过夜培养。
将96孔板内的培养基吸出，将培养基换为100μL含有不同药物浓度的稀释好的病毒的培养基，37℃细胞培养箱内培养。
在加入病毒48小时后，吸取病毒上清，加入含有Luciferase化学底物的裂解液，按照说明书，检测Luciferase读值。以0.5％DMSO处理作为对照。
3.3.2细胞毒试验
在96孔板内，将Huh7.5.1按照每孔1.5×104细胞铺板，培养基体积为100μL，37℃细胞培养箱内过夜培养。
将96孔板内的培养基吸出，将培养基换为100μL含有不同药物浓度的培养基，37℃细胞培养箱内培养。
在加入病毒48小时后，吸取病毒上清，加入用培养基稀释好的WST-1(Roche)，按照说明书，检测OD450/reference OD630的读值，以0.5％DMSO处理作为对照。
3.3.3结果处理
每次试验同一样本为3复孔，统计学处理采用Origin7.5软件，根据曲线拟合和回归法求出关系方程，计算半数抑制浓度EC50。相同的试验重复两次，最后计算两次试验EC50的平均值和SEM，结果保留2位有效数字。
药物治疗指数(TI)＝CC50/EC50。

Claims (4)

1.一种如下式(I)所述的化合物在制备抑制HCV病毒复制的药物的用途，
2.权利要求1所述的用途，其特征在于，化合物的酰胺键羰基与NS5B聚合酶的Thumb II活性口袋内Ser476残基形成氢键作用。
3.权利要求1所述的用途，其特征在于，化合物的间位双三氟甲苯插入到NS5B聚合酶的Leu419，Arg422，Met423和Trp528残基构成的一个疏水性口袋。
4.权利要求1所述的用途，其特征在于，化合物的苯并恶唑环插入到NS5B聚合酶中由Leu419，Val485，Ala486，Leu489，Leu497和Met423残基构成的一个较浅的疏水性口袋。
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