CN105434488A - 山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用 - Google Patents

山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用及山蜡梅叶片的制备方法。所述山蜡梅叶片由山蜡梅叶1500g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得槲皮素和山柰素含量有很大提高。

Description

山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用及山蜡梅叶片的制备方法。
背景技术
山蜡梅叶片标准号WS-11310(ZD-1310)-2002，记载于国家中成药标准汇编内科内科肺系（一）分册。由山蜡梅叶1500g作为原料药制成，具有辛凉解表，清热解毒的功效。用于风热感冒，发热，恶寒，咽痛。
现有技术中，尚未有山蜡梅叶片在在制备抑制小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用的报道，也未见有山蜡梅叶片提取制备方面采用超临界萃取的报道，而水煎煮、水蒸气蒸馏法提取挥发油的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种山蜡梅叶片的制备方法。
本发明的目的是通过如下的方案实现的：
山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用，所述山蜡梅叶片由山蜡梅叶1500g作为原料药制成，所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成：取山蜡梅叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量l-3ml/g生药·min，萃取时间700-800min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
优选的，上述的山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用，所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成：取山蜡梅叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间750min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
现有技术中，山蜡梅叶片口服，一次6～7片，一日3次。山蜡梅叶片服药量大。采用本发明方法制备成的山蜡梅叶片每片重0.35g，每次仅需3片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。
试验一、不同方法制备的山蜡梅叶片中槲皮素和山柰素含量的比较
l、仪器及试药本发明山蜡梅叶片：按实施例1方法制备，使用1500g原料药，经提取制成500片，每片重0.35g。原山蜡梅叶片，按照WS-11310(ZD-1310)-2002标准方法制备。Agilent1200高效液相色谱仪；METTLERAE240电子分析天平；槲皮素和山柰素对照品（中国药品生物制品检定所）。
2、方法
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％磷酸溶液（45∶55）为流动相；检测波长为365nm。理论板数分别按槲皮素、山柰素峰计算均应不低于1500。
对照品溶液的制备精密称取槲皮素、山柰素对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含6μg、8μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本发明山蜡梅叶片10片，精密称定，研细，取0.60g，精密称定，加甲醇加热回流2次（50ml、50ml），每次1小时，滤过，合并滤液，残渣加甲醇适量洗涤，滤过，洗液并入滤液中，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至3～4，加醋酸乙酯振摇提取5次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
对照产品供试品溶液的制备取对照的山蜡梅叶片20片，精密称定，研细，取1.2g，精密称定，加甲醇加热回流2次（50ml、50ml），每次1小时，滤过，合并滤液，残渣加甲醇适量洗涤，滤过，洗液并入滤液中，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至3～4，加醋酸乙酯振摇提取5次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液、对照产品供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3、结果
结果表明，本发明山蜡梅叶片中槲皮素和山柰素的含量为220-362μg/片；而原山蜡梅叶片中槲皮素和山柰素的含量为36μg/粒，每次服用量3片的槲皮素和山柰素含量为原片剂6粒含量的3-5倍，在服用量减少的情况下，槲皮素和山柰素含量有很大提高。
上述研究表明，采用本发明制备方法制备的山蜡梅叶片，有效成分含量远远高于WS-11310(ZD-1310)-2002标准记载的方法制备的山蜡梅叶片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
取山蜡梅叶1500g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间750min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
经检测，成品中槲皮素和山柰素的含量为362μg/片。
实施例2
取山蜡梅叶1500g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO2流量1ml/g生药·min，萃取时间800min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
经检测，成品中槲皮素和山柰素的含量为220μg/片。
实施例3
取山蜡梅叶1500g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度60℃，CO2流量3ml/g生药·min，萃取时间700min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
经检测，成品中槲皮素和山柰素的含量为308μg/片。
实施例4：山蜡梅叶片抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖的实验研究资料
1．实验材料
1.1实验用细胞株
小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
1.2实验药物
研究药物：本发明山蜡梅叶片：按实施例1方法制备。
药液储液：称取100mg山蜡梅叶片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
1.3实验试剂
DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137)；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387)；Trypsin（AMRESCO公司）；EDTA（AMRESCO公司）；PenicillinGSodiumSalt（AMRESCO公司1）；StreptomycinSulfate(AMRESCO)；无水乙醇（淄博亚杜兰经贸有限公司）；MTT(Biosharp批号：0793)：PBS（实验室自配）；
1.4实验器材
莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMIL）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190）；C02培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Sprlng公司型号：S/N020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号：DHG9123A)；冰箱(西门子公司型号：KG18V21TI)；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
2．实验方法
1)Neuro-2a细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%C02进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。
2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5%C02)常规培养。
3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入山蜡梅叶片溶液，继续培养24h。
4)24h后加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
6)同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。
7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率(%)=（对照孔OD值-给药孔OD值）、对照孔OD值×100%。实验重复3次。
3．统计处理
采用MicrosoftExcel2007软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean±S．D．表示。
4．实验结果
MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对Neuro-2a细胞增殖抑制有差异(P<0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。
表1山蜡梅叶片对Neuro-2a细胞增殖抑制影响研究(X±SD)
组别 药物浓度（mg/ml） 抑制率（%）
对照组 0 0
1 5 8.49±5.03
2 10 16.01±7.06*
3 15 26.93±10.89**
4 20 37.16±13.57**
注：与对照组比较，*P<O.01；**P<0.001。
5．实验结论
本发明的山蜡梅叶片可以抑制Neuro-2a细胞增殖，减少Neuro-2a细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。

Claims (2)

1.山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用，所述山蜡梅叶片由山蜡梅叶1500g作为原料药制成，其特征在于，所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成：取山蜡梅叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量l-3ml/g生药·min，萃取时间700-800min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
2.根据权利要求l所述的山蜡梅叶片在制备抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成：取山蜡梅叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间750min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.35g。
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CN103768263A (zh) * 2013-12-06 2014-05-07 济南新起点医药科技有限公司 一种青梅感冒片的制备方法及其在抑制脑神经瘤细胞Neuro-2a细胞增殖药物中的应用

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